專利名稱：一種產(chǎn)accd的植物內(nèi)生細(xì)菌及其土壤修復(fù)菌劑和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)和環(huán)境污染治理技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種產(chǎn)AC⑶的植物內(nèi)生細(xì)菌及其土壤修復(fù)菌劑和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
礦產(chǎn)資源開(kāi)采和礦山開(kāi)發(fā)引起的環(huán)境問(wèn)題是全球普遍關(guān)注的問(wèn)題，越來(lái)越受到人們的重視，主要由于其中鎘、鉛、錳、鋅等重金屬有毒元素向環(huán)境的釋放。重金屬污染土壤的植物修復(fù)技術(shù)因其成本低廉、環(huán)境友好而成為世界各國(guó)關(guān)注的熱點(diǎn)，成為礦區(qū)環(huán)境恢復(fù)的最佳策略。但其在實(shí)施過(guò)程中也存在不少問(wèn)題，如土壤重金屬的生物有效性低，不利于植物對(duì)重金屬的吸收和清除；超積累植物通常生長(zhǎng)緩慢、生物量小等，這些缺點(diǎn)嚴(yán)重影響了植物修復(fù)的效率。如何促進(jìn)超積累植物生長(zhǎng)、提高重金屬吸收是植物修復(fù)技術(shù)中的關(guān)鍵。重金屬污染等多種脅迫環(huán)境均能導(dǎo)致植物體內(nèi)乙烯的大量積累，而內(nèi)源乙烯的過(guò)量產(chǎn)生將導(dǎo)致植物根部生長(zhǎng)發(fā)育受阻或死亡。高等植物體內(nèi)乙烯的合成前體物質(zhì)為 ACCd-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸)。研究發(fā)現(xiàn)，多種植物促生細(xì)菌可分泌ACC脫氨酶(ACXD)， 將植物乙烯前體ACC分解成為α - 丁酮酸和氨，這樣可大大減少植物有害乙烯的產(chǎn)生，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。研究已證明接種ACCD產(chǎn)生細(xì)菌的植物會(huì)增大根部的長(zhǎng)度及根密度。 Belimov等首次報(bào)道了細(xì)菌ACXD活性與促進(jìn)植物組織中Cd的積累量的增多呈正相關(guān)。 Rajkumar和Freitas、Jiang等和Rodriguez等的研究都已表明產(chǎn)ACCD的菌株能夠通過(guò)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，來(lái)增強(qiáng)植物-微生物聯(lián)合修復(fù)土壤重金屬污染，在植物修復(fù)重金屬污染土壤中具有應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高產(chǎn)ACXD的植物內(nèi)生細(xì)菌。本發(fā)明的另一目的是提供由該高產(chǎn)ACCD的植物內(nèi)生細(xì)菌制備的土壤修復(fù)菌劑。本發(fā)明的又一目的是提供該細(xì)菌的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種高產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶的植物內(nèi)生細(xì)菌Jp3_3，分類命名為 Pantoea agglomerans Jp3_3，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2011年7月 13 日，菌種保藏號(hào)為 CCTCC NO :M 2011250。Jp3_3 (CCTCC NO :M 2011250)是從中國(guó)江西省某銅尾礦區(qū)生長(zhǎng)的小飛蓬(Comnyza canadensis)莖中分離得到，經(jīng)鑒定為Pantoea agglomerans。主要生物學(xué)特性為G_，菌體為短桿狀；乙酰甲基甲醇(V. P.)、檸檬酸鹽、精氨酸脫羧酶反應(yīng)陽(yáng)性，淀粉水解、過(guò)氧化氫酶反應(yīng)陰性；能在以ACC為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，ACXD酶活性最高達(dá)402 μ M α-KB h—rng—1。LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，單個(gè)菌落圓形， 邊緣整齊，直徑1 3mm，白色，不透明。一種含有所述的保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011250的Jp3_3菌株的生物修復(fù)制劑。所述的生物修復(fù)制劑優(yōu)選為液體制劑，其中含有保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011250
3的JP3-3菌株有效活菌數(shù)為10億個(gè)/毫升以上。其中，所述的液體制劑是通過(guò)常規(guī)的液體深層發(fā)酵方法發(fā)酵JP3-3菌株制備得到。所述的生物修復(fù)制劑還可優(yōu)選為固體制劑，其中含有保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011250的Jp3-3菌株有效活菌數(shù)為2億個(gè)/克以上。所述的固體制劑是使用草炭、蛭石或其他載體吸附保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011250 的JP3-3菌株發(fā)酵液配制成顆粒劑或粉劑。所述的保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011250的Jp3_3菌株在土壤重金屬污染的植物修
復(fù)中的應(yīng)用。所述的含Jp3_3菌株的生物修復(fù)制劑在土壤重金屬污染的植物修復(fù)中的應(yīng)用。一種所述的含Jp3_3菌株的生物修復(fù)制劑用于土壤重金屬污染的植物修復(fù)方法 在含重金屬的濕潤(rùn)土壤中播種植物種子，每千克土壤接種IO8個(gè)細(xì)菌/mL的菌液10 20mL， 分1-2次接種。有益效果本發(fā)明所述的植物內(nèi)生細(xì)菌Jp3_3菌株(CCTCC NO =M 2011250)能耐受多種重金屬(Cu、Pb、Cd、Ni的最小抑制濃度分別為3. 1,4. 8,4. 5,0. 9mM)。本發(fā)明所述的高產(chǎn)ACCD的植物內(nèi)生細(xì)菌Jp3-3菌株(CCTCC NO =M 2011250)及其強(qiáng)化植物土壤重金屬污染修復(fù)的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明所述的Jp3-3菌株(CCTCC NO =M 2011250)具有ACC脫氨酶( 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid deaminase) 舌 f生，Sl 舌 t生最 1 可達(dá) 402 μ Ma-KB · IT1 · mg—1，在重金屬污染土壤中定殖于植物體內(nèi)的具ACC脫氨酶活性的內(nèi)生細(xì)菌通過(guò)將乙烯的前體ACC轉(zhuǎn)換為α-丁酮酸和氨，可以直接調(diào)控植物體內(nèi)乙烯的含量，抑制乙烯的生物合成，促進(jìn)植物生長(zhǎng)；高產(chǎn)鐵載體，有助于提高植物抗逆性(抗旱、抗?jié)场⒖果}堿、抗病蟲(chóng)害)；該菌株能產(chǎn)生吲哚乙酸，IAA最高產(chǎn)量可達(dá)Hmg ·廠1 ；具有溶磷特性，有助于促進(jìn)植物生長(zhǎng)。(2)利用本發(fā)明植物內(nèi)生細(xì)菌Jp3-3菌株(CCTCC NO =M 2011250)促進(jìn)植物生長(zhǎng)， 提高植物提取修復(fù)效率。(3)可以回收重金屬，無(wú)二次污染。生物樣品保藏信息高產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶的植物內(nèi)生細(xì)菌Jp3_3，分類命名為Pantoea agglomerans Jp3_3，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址是中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏日期為2011年7月13日，菌種保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011250。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明中高產(chǎn)ACXD的植物內(nèi)生細(xì)菌Jp3_3菌株是從中國(guó)江西省某銅尾礦區(qū)生長(zhǎng)的小飛蓬(Comnyza canadensis)莖中分離純化得到，分離方法如下先用自來(lái)水將小飛蓬莖表面清洗干凈，然后用無(wú)菌水再清洗一遍，接著用75% 乙醇浸泡消毒5min，無(wú)菌水沖洗后再浸入2. 5%次氯酸鈉溶液中消毒5min，無(wú)菌水沖洗數(shù)遍。將表面消毒的莖置于研缽內(nèi)研磨至勻漿，取0.1ml勻漿液涂布于LB平板(蛋白胨 10g，酵母膏 5g，NaCl 10g,7jC lOOOmL，瓊脂 20g，pH 7. 0)，培養(yǎng) 3d，挑取單菌落在 LB 平板上劃線純化后保存。將菌株接種于LB培養(yǎng)液中，30°C搖床振蕩培養(yǎng)18h，取1. OmL菌液于Eppendorf離心管中，IOOOOrpm離心5min收集菌體，按常規(guī)方法提取細(xì)菌總DNA，PCR 擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后與GenBank中已知16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，與 Pantoeaagglomerans的16S rDNA序列相似性達(dá)到99%，將其鑒定為這個(gè)種。實(shí)施例2將Jp3-3(CCTCC NO =M 2011250)劃線接種于含不同重金屬濃度的LB培養(yǎng)基，30°C 培養(yǎng)3d，觀察其能否生長(zhǎng)及生長(zhǎng)情況。結(jié)果見(jiàn)表1。Jp3-3菌株能耐受多種重金屬(Cu、Pb、 Cd、Ni的最小抑制濃度分別為3. 1、4. 8、4. 5、0. 9mM)。表1菌株在含不同重金屬濃度的LB培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶的植物內(nèi)生細(xì)菌JP3-3，分類命名為 Pantoea agglomerans Jp3_3，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2011年7月13 日，菌種保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011250。
2.一種含有權(quán)利要求1所述的保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011250的Jp3_3菌株的生物修復(fù)制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物修復(fù)制劑，其特征在于該生物修復(fù)制劑為液體制劑，其中含有保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011250的Jp3_3菌株有效活菌數(shù)為10億個(gè)/毫升以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物修復(fù)制劑，其特征在于所述的液體制劑是通過(guò)常規(guī)的液體深層發(fā)酵方法發(fā)酵JP3-3菌株制備得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物修復(fù)制劑，其特征在于該生物修復(fù)制劑為固體制劑，其中含有保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011250的Jp3_3菌株有效活菌數(shù)為2億個(gè)/克以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物修復(fù)制劑，其特征在于所述的固體制劑是使用草炭、蛭石或其他載體吸附保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2011250的Jp3-3菌株發(fā)酵液配制成顆粒劑或粉劑。
7.權(quán)利要求1所述的保藏號(hào)為CCTCCNO =M 2011250的Jp3_3菌株在土壤重金屬污染的植物修復(fù)中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求2所述的含Jp3-3菌株的生物修復(fù)制劑在土壤重金屬污染的植物修復(fù)中的應(yīng)用。
9.一種權(quán)利要求2所述的含Jp3-3菌株的生物修復(fù)制劑用于土壤重金屬污染的植物修復(fù)方法，其特征在于在含重金屬的濕潤(rùn)土壤中播種植物種子，接種JP3-3菌株生物修復(fù)制劑，每千克土壤接種IO8個(gè)細(xì)菌/mL的生物修復(fù)制劑10 20mL，分1_2次接種。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)和環(huán)境污染治理技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種產(chǎn)ACCD的植物內(nèi)生細(xì)菌及其土壤修復(fù)菌劑和應(yīng)用。植物內(nèi)生細(xì)菌Jp3-3，分類命名為Pantoea agglomerans Jp3-3，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2011年7月13日菌種保藏號(hào)為CCTCC NOM 2011250。該細(xì)菌的ACCD酶活性最高可達(dá)402μM α-KB·h-1·mg-1；液體制劑含有有效活菌數(shù)為10億個(gè)以上/毫升，固體制劑含有效活菌數(shù)2億個(gè)以上/克。土壤修復(fù)菌劑直接施用可促進(jìn)植物生長(zhǎng)并吸收重金屬，強(qiáng)化植物修復(fù)重金屬污染土壤的效率。
文檔編號(hào)C12N11/14GK102391974SQ20111037773
公開(kāi)日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月24日
發(fā)明者何琳燕, 張文輝, 張艷峰, 盛下放, 黃智 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)