專利名稱：糞腸球菌及其應(yīng)用與其飼料添加劑和發(fā)酵劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株糞腸球菌(Enterococcus faecal is)及其應(yīng)用與其飼料添加劑和發(fā)酵劑。
背景技術(shù)：
在我國養(yǎng)殖業(yè)中，抗生素的過度使用，造成了藥物殘留以及大量耐藥性細(xì)菌產(chǎn)生， 其結(jié)果嚴(yán)重阻礙了畜、禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，為食品安全和消費(fèi)者的身體健康埋下了隱患，因此尋找安全、無殘留的抗生素替代品迫在眉睫。包含益生菌的生物飼料添加劑是一種十分理想的部分抗生素的替代品，而益生菌菌株是開發(fā)質(zhì)量穩(wěn)定、效果顯著、性價(jià)比高的生物飼料添加劑的重要基礎(chǔ)。益生菌的研究和開發(fā)的關(guān)鍵問題在于優(yōu)良菌株的分離和篩選、良好的益生菌處理工藝。目前，益生菌菌種存在以下幾個(gè)問題1.大多數(shù)的益生菌為不產(chǎn)芽孢的乳酸菌，且多屬專性厭氧菌，極易受到溫度、氧氣、水分及酸堿等外界環(huán)境因素的影響，通常菌活性保持比較困難；2.多數(shù)益生菌在飼料加工過程中難以耐受飼料制粒時(shí)的高溫；3.菌種本身的特性不好，產(chǎn)酶、抑菌能力差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株抗逆性強(qiáng)、益生功能優(yōu)秀的益生菌一糞腸球菌 (Enterococcus faecalis)，保藏編號為CGMCC No. 5092，此菌具有良好的抗逆性功能和益生功能耐人工胃酸、耐膽汁液、耐高溫、對大腸桿菌K88、K99和金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)抑制作用，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)、能夠抑制霉菌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了該糞腸球菌的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了包含該糞腸球菌的飼料添加劑和發(fā)酵劑。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一株糞腸球菌，其保藏編號為CGMCC No. 5092。其中，該菌的16s rRNA基因序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明的糞腸球菌可用于制備飼料添加劑。飼料添加劑主要用于畜、禽或者水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中，如雞、鴨、豬、牛、羊、魚等，其中飼料添加劑中糞腸球菌的活菌數(shù)為 IO9-IOiciCfWig ；飼料添加劑添加于禽畜或水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料后，飼料中糞腸球菌的活菌數(shù)為 106-108cfu/g。本發(fā)明還提供了包含該糞腸球菌CGMCC No. 5092的飼料添加劑，其特征在于飼料添加劑中糞腸球菌的活菌數(shù)為IO9-IOiciCfu/^本發(fā)明的糞腸球菌也可用于制備發(fā)酵劑。其中，所述的發(fā)酵劑為用于豆粕、棉粕、青草和/或玉米秸稈的發(fā)酵劑，發(fā)酵劑加入豆粕、棉粕、青草和/或玉米秸稈后的活菌數(shù)為106-107cfu/g。本發(fā)明還提供了包含該糞腸球菌CGMCC No. 5092的發(fā)酵劑，其特征在于發(fā)酵劑中糞腸球菌的活菌數(shù)為108-101QCfU/g。
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本發(fā)明的糞腸球菌(Enterococcus faecalis)為申請人從豬大腸中分離得到，其生物學(xué)特征如下菌落圓整，表面光滑，不透明，乳白色，邊緣光滑，革蘭氏陽性菌；單個(gè)菌體為球狀或橢圓狀。本發(fā)明的糞腸球菌經(jīng)過人工胃液、膽汁液及耐熱性的篩選；又經(jīng)過產(chǎn)酶能力篩選和抑菌能力篩選，可以耐受pH2.0，l%胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3%的人工膽汁液，可以耐受85°C的制粒溫度，也可以抑制致病性大腸桿菌K88，K99和金黃色葡萄球菌，具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸和抑制豆粕、棉粕、玉米秸稈中霉菌的能力。本發(fā)明的糞腸球菌 (Enterococcus faecalis)申請人已于2011年7月沈日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 5092。有效效果(1)本發(fā)明的糞腸球菌CGMCC No. 5092的抗逆性強(qiáng)，可以耐受制粒高溫，耐受人工胃液，人工膽鹽，因此在經(jīng)過飼料制粒，動物胃腸道環(huán)境后，還有大量活菌可以順利進(jìn)入動物的腸道，在腸道中發(fā)揮益生功能，提高動物免疫力，降低養(yǎng)殖成本；(2)本發(fā)明的糞腸球菌可以有效抑制動物腸道內(nèi)常見致病菌大腸桿菌K88，K99和金黃色葡萄球菌。(3)本發(fā)明的糞腸球菌可以大量的產(chǎn)酸，能夠降低腸道內(nèi)的PH抑制有害菌的生長和繁殖，同時(shí)也有助于消化。(4)本發(fā)明的糞腸球菌經(jīng)過培養(yǎng)和高密度發(fā)酵可作為生物飼料添加劑加到養(yǎng)殖動物的飲水或者飼料中，改善動物腸道健康，提升動物免疫力，增加動物的生產(chǎn)性能。(5)本發(fā)明的糞腸球菌還可以作為發(fā)酵劑，對豆粕、棉粕、菜粕和/或玉米秸稈進(jìn)行處理，可以抑制霉菌的產(chǎn)生，增加養(yǎng)殖動物對豆粕、棉粕、菜粕或者玉米秸稈中營養(yǎng)成分的吸收。


圖1 圖1為糞腸球菌抑制大腸桿菌K88，K99和金黃葡萄球菌的抑菌圈圖片。圖2 糞腸球菌(CMGCC No. 5092)發(fā)酵玉米粉的圖片通過下列實(shí)施例將更具體的說明本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是為了說明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1糞腸球菌CGMCC No. 5092的篩選。1、初篩取樣品豬糞、牛糞和雞糞等樣品各5g，浸泡于20ml無菌0. 85%生理鹽水中，震蕩打散樣品，使樣品充分與生理鹽水接觸，70°C恒溫水浴鍋靜置3分鐘，取上清，5000rpm離心 10分鐘，棄去上清。將離心后的菌體沉淀加入IOml人工胃液中，37°C靜置池，然后離心，收集菌體后，將菌體沉淀加入IOml人工膽鹽中，37°C靜置4h，收集菌體，稀釋涂布于LB培養(yǎng)基。37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-24h后，對菌落進(jìn)行純化分離。對得到的菌進(jìn)行保存，并進(jìn)一步復(fù)篩。生理鹽水的配制方法是0. 85%氯化鈉溶液，高壓滅菌后備用。
人工胃液的配制方法是1 %胃蛋白酶，0. 85%氯化鈉，用濃鹽酸調(diào)pH值到2. 0，經(jīng)細(xì)菌過濾器過濾除菌后備用。人工膽鹽的配制方法是在液體肉湯中添加0. 3%的豬膽鹽(分析純)，高壓滅菌后備用。LB固體培養(yǎng)基的制作方法是蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊脂1. 5%， PH7.0，高壓滅菌后備用。2、復(fù)篩(1)將配置好、滅完菌的LB培養(yǎng)基溫度冷卻至45°C，加入過夜培養(yǎng)的大腸桿菌 K88、K99和金黃色葡萄球菌(每毫升培養(yǎng)基加入1微升菌液)，震蕩混勻，倒入無菌平板，水平凝固后，每個(gè)平板利用四個(gè)牛津杯進(jìn)行打孔，每只牛津杯中加入200 μ 1待測菌液，蓋好皿蓋，小心移至37°C培養(yǎng)箱，平皿正放靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)20h后，打開皿蓋，移去牛津杯，用卡尺測量抑菌圈直徑。實(shí)施例2糞腸球菌的分子鑒定利用細(xì)菌的通用引物對篩選到的菌株進(jìn)行PCR鑒定按細(xì)菌DNA提取試劑盒操作說明書提取模板DNA。使用16S rRNA保守序列的上游引物5，-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3，，見 SEQ ID No. 2 和下游引物 5，-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3，見 SEQ ID No. 3 擴(kuò)增細(xì)菌16s rRNA基因片段。經(jīng)過測序得到該菌屬于糞腸球菌，擴(kuò)增片段的測序結(jié)果見SEQ ID No. 1。實(shí)施例3糞腸球菌抗逆性的驗(yàn)證(1)耐高溫性將培養(yǎng)12h的糞腸球菌進(jìn)行離心收集，置入生理鹽水中進(jìn)行重懸后，取樣涂布，計(jì)活菌數(shù)；再將生理鹽水在70°C的水浴鍋里加熱十分鐘后，迅速冷卻，再進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，殘存活菌數(shù)為85.3%。(2)人工胃液的耐受性取0. 5ml培養(yǎng)1 糞腸球菌的菌液，溶于4. 5ml生理鹽水中，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)活菌數(shù)。再取定量上述菌液加入4. 5ml人工膽鹽培養(yǎng)基中，37°C靜置池，平板計(jì)數(shù)法計(jì)殘存活菌數(shù)，殘存活菌數(shù)為92.2%。(3)人工膽汁液的耐受性取0. 5ml培養(yǎng)1 糞腸球菌的菌液，溶于4. 5ml生理鹽水中，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)活菌數(shù)。而后另取0. 5ml上述菌液加入4. 5ml人工膽汁液培養(yǎng)基中，37°C靜置池，平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)殘存活菌數(shù)，殘存活菌數(shù)為86. 2%。結(jié)果以上幾個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明中從豬大腸中分離到的糞腸球菌的抗逆性較強(qiáng)， 可以耐受較高的溫度，耐受人工胃液，人工膽鹽，因此作為飼料添加劑使用，能夠保證大量的菌體順利通過動物的腸道，在腸道中存活，發(fā)揮其益生功能。實(shí)施例4糞腸球菌(CGMCC No. 5092)的益生功能(1)抑菌功能驗(yàn)證過夜培養(yǎng)的致病性大腸桿菌K88，K99和金黃色葡萄球菌菌液用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。 分別在3管5ml的大腸桿菌K88、K99和金黃色葡萄球菌中加入5ml糞腸球菌菌液。37°C培養(yǎng)4h，平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算殘存的大腸桿菌K88、K99和金黃色葡萄球菌的活菌數(shù)。殘存致病性大腸桿菌K88、K99和金黃色葡萄球菌的活菌數(shù)為24. 7%,30. 2%和31. 8%。(2)在豆粕或者玉米粉中抑制霉菌的驗(yàn)證取培養(yǎng)1 的糞腸球菌的菌液20ml，與30g玉米粉或者豆粕進(jìn)行均勻混合，空白實(shí)驗(yàn)為20ml無菌水與30g玉米粉或者豆粕進(jìn)行均質(zhì)混合，然后分別在3d、5d、8d和IOd對兩瓶里面的玉米或豆粕及霉菌的生長情況進(jìn)行觀察。通過實(shí)驗(yàn)表明，在5天后，沒有加入糞腸球菌菌液的玉米粉和豆粕中均有霉菌絲長出，而加入糞腸球菌菌液的玉米粉和豆粕的顏色仍然新鮮，有所分解但無霉菌斑或者霉菌絲的出現(xiàn)。實(shí)施例5糞腸球菌(CGMCC No. 592)飼料添加劑的制備(1)糞腸球菌的高密度發(fā)酵發(fā)酵糞腸球菌時(shí)用的發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成紅糖18g/L，蛋白胨4g/L，牛肉膏3g/L，酵母浸粉，0. 8/L，七水合硫酸鎂0. 4g/L，硫酸錳0. 005g/L, pH為7. 2。發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度為37°C，發(fā)酵時(shí)間為12h，pH值為7. 2，轉(zhuǎn)速為IOOrpm，初始接種量為2%。發(fā)酵結(jié)束后，得到7. 3X109cfu/ml的菌液。(2)糞腸球菌(CMGCC No. 5092)飼料添加劑的制備對糞腸球菌進(jìn)行高溫噴霧干燥，其保護(hù)劑成分為黃原膠，海藻糖，麥芽糊精，進(jìn)風(fēng) 180°C，出風(fēng)70°C，得到流散性好，易溶于水、活菌數(shù)在4X 101(lCfU/g的糞腸球菌菌粉。實(shí)施例6糞腸球菌(CGMCC No. 5092)在發(fā)酵玉米粉過程中的作用將玉米粉和水以1 0.5的比例充分混勻，以的接種量接種糞腸球菌CGMCC No. 5092菌粉，添加量為107/g，發(fā)酵溫度為37°C，發(fā)酵時(shí)間為3d。發(fā)酵容器為250mL的錐形瓶，而后置入培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵?？瞻讓φ諡椴唤臃N糞腸球菌菌粉的玉米粉與水(1 0.5) 的混合物，對照2為接種量接種枯草芽孢桿菌菌粉的玉米粉和水(1 0. 的混合物。結(jié)果與空白對照相比，玉米粉經(jīng)過糞腸球菌發(fā)酵后，其顏色、粘稠度和風(fēng)味均明顯改善(圖幻，其中接種糞腸球菌CGMCC No. 5092的發(fā)酵玉米粉和接種枯草芽孢桿菌的發(fā)酵玉米粉的顏色、粘稠度和風(fēng)味改善更為明顯。在室溫繼續(xù)放置未發(fā)酵玉米粉和發(fā)酵玉米粉一周后，觀察到未發(fā)酵玉米粉被霉菌污染，發(fā)酵玉米粉未被污染。放置兩周后，枯草芽孢桿菌和糞腸球菌發(fā)酵的玉米粉仍然沒有被霉菌污染，但是糞腸球菌發(fā)酵的玉米粉其風(fēng)味更佳，說明糞腸球菌CGMCC No. 5092具有防止霉菌感染的功效，且作用比枯草芽孢桿菌作用更佳·實(shí)施例7糞腸球菌飼料添加劑對蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、死淘率和抗體水平的影響用日齡相同的產(chǎn)蛋后期海蘭蛋雞9000只，分三組，每幢一組3000只，分三個(gè)重復(fù)， 每個(gè)重復(fù)1000只。分組情況如下A組，空白對照組，飼喂蛋雞基礎(chǔ)日糧；B組，在蛋雞基礎(chǔ)日糧中添加抗生素(金霉素)80g/t ；C組，在蛋雞基礎(chǔ)日糧中添加糞腸球菌飼料添加劑0. 18%。前7天為預(yù)試期，后觀天為試驗(yàn)期，并按上述分組重復(fù)試驗(yàn)3次，測定雞舍內(nèi)NH3、 H2S濃度、雞蛋破損率、哈夫單位、產(chǎn)蛋率、蛋重、死淘率、蛋殼光潔度、抗體水平等指標(biāo)。結(jié)果列于表(1)表1對蛋雞生產(chǎn)性能、蛋白質(zhì)、死淘率的影響
權(quán)利要求
1.一株糞腸球菌(Enterococcus faecal i s)，保藏編號為 CGMCC No. 5092。
2.權(quán)利要求1所述的糞腸球菌，其特征在于該菌16sRNA基因序列如SEQID No 1所示。
3.權(quán)利要求1所述的糞腸球菌在制備飼料添加劑中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求3所述的糞腸球菌在制備飼料添加劑中的應(yīng)用，其特征在于所述的飼料添加劑主要應(yīng)用于禽畜或水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中，飼料中糞腸球菌的活菌數(shù)為106-108cfu/g。
5.一種包含權(quán)1所述的糞腸球菌的飼料添加劑，其特征在于飼料添加劑中糞腸球菌的活菌數(shù)為 109-101QCfU/g。
6.權(quán)利要求1所述的糞腸球菌在制備發(fā)酵劑中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6所述的糞腸球菌在制備發(fā)酵劑中的應(yīng)用，其特征在于所述的發(fā)酵劑為用于豆粕、棉粕、青草和/或玉米秸稈的發(fā)酵劑，發(fā)酵劑加入豆粕、棉粕、青草和/或玉米秸稈后的活菌數(shù)為106-107cfu/g。
8.一種包含權(quán)1所述的糞腸球菌的發(fā)酵劑，其特征在于發(fā)酵劑中糞腸球菌的活菌數(shù)為 108-10lclcfu/g。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株糞腸球菌(Enterococcus faecalis)及其應(yīng)用與其飼料添加劑和發(fā)酵劑。本發(fā)明的糞腸球菌具有良好的抗逆性功能和益生功能可以在保護(hù)劑保護(hù)下對其進(jìn)行高溫干燥、也可耐受90℃制粒溫度；對大腸桿菌k88、k99和金黃葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用，產(chǎn)酸和纖維素酶的能力很強(qiáng)，可以降低pH值和分解一些纖維素。用本發(fā)明的糞腸球菌制備的生物飼料添加劑在禽畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖中可以替代部分抗生素，減少抗生素的使用，提高動物的免疫力，提高飼料的轉(zhuǎn)化率，提高養(yǎng)殖效益。本發(fā)明的糞腸球菌也可用于豆粕、棉粕、青草等的發(fā)酵，可以有效防止飼料霉變，提高飼料中營養(yǎng)的利用率。
文檔編號C12N1/20GK102517227SQ20111037822
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月24日
發(fā)明者付維來, 劉婷, 杜建濤, 王麗英, 王安如, 王松 申請人:內(nèi)蒙古四季春飼料有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 北京科高大北農(nóng)飼料有限責(zé)任公司