專利名稱：家蠶BmSpry基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因領(lǐng)域，特別是涉及家蠶的控制家蠶對(duì)核型多角體病毒 (BmNPV)抗性的關(guān)鍵基因。
背景技術(shù)：
蠶桑生產(chǎn)是絲綢工業(yè)的基礎(chǔ)，在我國很多農(nóng)村地區(qū)，養(yǎng)蠶業(yè)是當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的支柱性產(chǎn)業(yè)和農(nóng)民的主要經(jīng)濟(jì)收入來源，蠶絲業(yè)每年為蠶農(nóng)創(chuàng)收上百億元。核型多角體病毒病是蠶業(yè)生產(chǎn)上最常見而且危害最嚴(yán)重的一類蠶病，引起該病的病原為核型多角體病毒 (BmNPV)，該病的傳染力極強(qiáng)并且難以控制，全國各蠶業(yè)主產(chǎn)區(qū)經(jīng)常因?yàn)樵摬〉谋l(fā)而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于BmNPV在蠶業(yè)生產(chǎn)上危害嚴(yán)重，科研工作者對(duì)它的病原特性、感染性和抵抗性作了持續(xù)深入的研究。目前的研究結(jié)果顯示不同的家蠶品種對(duì)BmNPV的抵抗性不一樣， 家蠶對(duì)BmNPV的抵抗性是由多基因控制的，其中至少有一個(gè)是主效基因。對(duì)家蠶抗性關(guān)鍵基因及其調(diào)控序列進(jìn)行克隆和鑒定，為闡明家蠶抵抗BmNPV的機(jī)制，以及培育抗性品種應(yīng)用于蠶業(yè)生產(chǎn)有著重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一段核苷酸序列及其制備方法，該序列為家蠶調(diào)控核型多角體病毒抗性的關(guān)鍵基因。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
家蠶BmSpry基因，所述家蠶BmSpry基因的核苷酸序列含有如SEQ ID NO 1所示。進(jìn)一步，所述家蠶汝基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。所述的家蠶汝基因的制備方法，以家蠶大造品種全蠶或者組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)的上游引物為F 5' - cggtcgtttcgttggagc-3’，設(shè)計(jì)的下游引物為R 5，- atttgcgtagaatccaaaatactaac-3，，PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 4 分鐘，然后 94°C變性 40秒、58 °C退火40秒、72 °C延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，得如SEQ ID NO 2所示的家蠶BmSpry基因。本發(fā)明的目的之二在于提供家蠶基因的應(yīng)用，該應(yīng)用為調(diào)控家蠶核型多角體病毒抗性提供了新方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
所述的家蠶基因在調(diào)節(jié)家蠶型多角體病毒抗性中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于通過對(duì)轉(zhuǎn)基因家蠶敏感系統(tǒng)LI-S進(jìn)行檢測，克隆得到了一個(gè)家蠶抗性關(guān)鍵基因徹分iT全長序列，包括213bp的5’非翻譯區(qū)序列(5’Untranslated region，5，UTR)、642bp 編碼區(qū)序列(Coding sequence，CDS)和 332 bp 的 3，非翻譯區(qū)序列 (3’UTR)。徹分^基因表達(dá)量降低一半導(dǎo)致家蠶對(duì)BmNPV的抵抗性降低了 100倍，本發(fā)明克隆和鑒定了一個(gè)影響家蠶對(duì)BmNPV抗性的關(guān)鍵基因。汝基因在培育家蠶抗BmNPV品種的理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用中都具有重要的價(jià)值。


圖1為LI-S和正常大造添食不同濃度BmNPV以后的死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖2為LI-S外源片段在家蠶基因組和染色體上的插入位點(diǎn)分析。圖3為RT-PCR檢測正常大造和LI-A以及LI-S中BmSpry的表達(dá)量。圖4為定量PCR檢測正常大造和LI-A以及LI-S中BmSpry的表達(dá)量。圖5為插入位點(diǎn)附近其他基因RT-PCR檢測結(jié)果。圖6為BmSpry基因的結(jié)構(gòu)示意圖(上)和全長序列及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列(下)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1轉(zhuǎn)基因家蠶LI-S和LI-A的構(gòu)建
一構(gòu)建轉(zhuǎn)基因增量表達(dá)載體pBac[IElP- lipase-l-3XP3-EGFPafm] 1用幻招/和/雙酶切載體pBSII-IEl-orf，回收獲得IEl啟動(dòng)子片段，并把其連入 L4440 載體，用 SV40 引物(SV40 F: 5 ‘-tgctctagaagatcataatcagccata-3，，SV40 R: 5 '-ggaagatctgcagtgaaaaaaatgctt-S' )hk piggyBac [3Xp3 EGFP afm]中擴(kuò)增出 SV40 終止信號(hào)，由于引物兩端分別加有損a /和勒#酶切位點(diǎn)，以此兩個(gè)酶雙酶切把SV40加入已經(jīng)帶有IEl啟動(dòng)子的L4440載體，這樣重組載體L4440-IE1P-SV40中既包含IEl啟動(dòng)子序列，又含有SV40終止信號(hào)。2 用 Bmlipase-1 弓丨物(Lipase-1 F: 5 '-ccggaattcatgcctgatggcgagggtgt- 3，， Lipase-I R: 5 '-ctagtctagattagaaaggccaactgctgcc-S') ^C H Φ J cDNA Φ Γ ±1 Bmlipase-I的CDS序列(如SEQ ID NO:3所示)，TA克隆連入pMD19_T simple載體，進(jìn)行 PCR和酶切檢測確定無誤，并送由上海生物工程有限公司測序做進(jìn)一步驗(yàn)證。3用損a /和分別雙酶切L4440-IE1P-SV40和Bmlipase-1 T克隆質(zhì)粒，連接重組后，得到含有增量表達(dá)骨架結(jié)構(gòu)(包含啟動(dòng)子、表達(dá)基因序列和終止信號(hào))的L4440-IElP- Bmlipase-l-SV40 重組載體。4 用 ^7/7 / 和 II 分別酶切 pSLfall80fa 載體禾Π L4440- IElP-Bmlipase-l-SV40 重組載體，連接重組后，得 1180- IElP- Bmlipase-l_SV40 重組載體。5用限制性內(nèi)切酶Asc I分別酶切1180- IElP- Bmlipase-l_SV40及 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]質(zhì)粒。由于pSLfall80fa載體骨架在多克隆位點(diǎn)兩端都含有一個(gè)Asc /位點(diǎn)，切下的增量表達(dá)骨架結(jié)構(gòu)便可與經(jīng)Asc /酶切后5’端去磷酸化的piggyBac 3Xp3 EGFP afm線性片段連接，形成最終的轉(zhuǎn)基因增量表達(dá)載體pBac[IElP-Bmlipase-l-s v40-3XP3-EGFPafm]。上述實(shí)驗(yàn)的完成參見了西南大學(xué)陳杰的《增量表達(dá)抗病毒蛋白Bmlipase-1的家蠶轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的建立》一文。二轉(zhuǎn)基因顯微注射和陽性個(gè)體的篩選
1將家蠶大造品種蠶卵浸酸解除滯育以后，放于15°C和80%濕度的黑暗環(huán)境中催青直至孵化，將蟻蠶收好置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中飼養(yǎng)，化蛾以后將雌雄蠶蛾交配4h，拆對(duì)后產(chǎn)下的蠶卵為非滯育蠶卵，用于下一步的顯微注射；
2將產(chǎn)下的蠶卵在干凈的載玻片上排列整齊，在蠶卵產(chǎn)后2h用Eppendorf顯微注射儀將實(shí)施例1所得的轉(zhuǎn)基因增量表達(dá)載體pBac [IElP-Bmlipase-l-sv40-3XP3-EGFPafm] 和輔助質(zhì)粒A3H，一起注射進(jìn)932粒大造蠶卵中，用無毒膠水封口以后置于25°C、相對(duì)濕度 80%的環(huán)境中催青孵化，將孵化的510頭GO代蟻蠶用桑葉收集飼養(yǎng)至化蛾；
3 GO代蠶蛾通過自交或回交共獲得32蛾圈Gl代蠶卵，用Olympus 電動(dòng)宏觀熒光顯微鏡觀察篩選并獲得7個(gè)陽性蛾圈，轉(zhuǎn)化效率為21. 88%。三轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的抗性檢測
1將實(shí)施例2所得的7個(gè)陽性蛾圈各自單蛾圈飼養(yǎng)，繼代擴(kuò)大得到7個(gè)轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)Li， 隨機(jī)選擇3個(gè)轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)進(jìn)行后續(xù)的抗性檢測。2取3個(gè)轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)和正常大造品種，在4齡起蠶時(shí)期以半致死劑量單頭經(jīng)口添食BmNPV病毒，4個(gè)系統(tǒng)各設(shè)置3個(gè)重復(fù)區(qū)，每個(gè)重復(fù)區(qū)100頭蠶，同時(shí)每個(gè)系統(tǒng)設(shè)置3個(gè)不攻毒對(duì)照區(qū)，死亡率統(tǒng)計(jì)到化蛾時(shí)期；
3攻毒結(jié)果顯示3個(gè)轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中有兩個(gè)系統(tǒng)(分別命名為LI-A和LI-B)提高了家蠶對(duì)BmNPV的抗性(符合我們的預(yù)期結(jié)果)，但其中一個(gè)系統(tǒng)(命名為LI-SWfBmNPV的抗性明顯降低?？剐詸z測結(jié)果顯示和正常大造系統(tǒng)相比較，轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)LIA—直具有明顯的抗性效果，能降低35%左右的死亡率。LI-S對(duì)BmNPV的抵抗性比正常親本低了 100倍左右。 具體為
(1)將LI-A、LI-S和正常大造蠶卵浸酸(鹽酸比重為1.073，溫度為46°C，時(shí)間為5分鐘)解除滯育以后，放于25°C和85%濕度的環(huán)境中催青10天左右直至孵化，將蟻蠶收好置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中飼養(yǎng)(溫度25°C，濕度80%)。(2)在四齡起蠶經(jīng)口添食BmNPV病毒檢測抗性。將新鮮的桑葉切成直徑一厘米的小塊，然后將病原涂抹在切好的桑葉小塊上面，一頭蠶單獨(dú)吃一小塊涂抹過病原的桑葉，只有將這小塊桑葉吃完了的蠶才被挑選出來繼續(xù)飼養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)死亡率到化蛾。攻毒數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(圖1)顯示，在四齡起蠶以IO4多角體/頭經(jīng)口添食感染BmNPV后，正常親本(大造)和 LI-S的死亡率分別為10%和50%左右；在以IO6多角體/頭經(jīng)口添食感染BmNPV后，正常親本(大造)和LI-S的死亡率分別為50%和80%左右。和正常親本相比，LI-S對(duì)BmNPV的抵抗性降低了 100倍左右。實(shí)施例2檢測LI-S中外源片段的插入位點(diǎn)一反向PCR鑒定LI-S外源片段的插入位點(diǎn)
取20 μ g實(shí)施例1提及的LI-S的基因組在37°C用湯e//Jl切過夜，酶切產(chǎn)物純化后用Solution I (購買自TaKaRa)進(jìn)行連接，以自連產(chǎn)物為模板，用轉(zhuǎn)座子特異的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增(pb-left F: 5 '-atcagtgacacttaccgcattgaca-3，，pb-left R: 5 '-tgacgagct tgttggtgaggattct-3')，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4分鐘，然后94°C變性40秒、54°C退火40秒、72 °C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，然后與PMD19-T載體連接，連接反應(yīng)在T4 DNA連接酶作用下，16°C過夜連接，然后轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽性克隆后送往上海生工生物技術(shù)有限公司測序。將測序結(jié)果在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果(圖2)顯示外源片段插入在nsCafl898的12392322處，其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示，其距離最近的上游基因35. 8Kb，距離最近的下游基因14. 6Kb。二 LI-S外源片段插入位點(diǎn)的再次確定
根據(jù)反向PCR的結(jié)果和家蠶基因組序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物對(duì)插入位點(diǎn)再次進(jìn)行檢測 (LlS-Pb-l F :5'-acaagcacgcctcacgg-3', R :5'_tacaacaagcaaacatagcga_3' ；LIS_Pb_2 F 5' - taccgcattgacaagcac-3，, R 5' _actcgatatgcctgctcc_3，),每對(duì)弓丨物的上游弓丨物在插入的載體序列上，下游引物在家蠶基因組上。以LI-S基因組為模板，用LIS-Pb-I和 LIS-Pb-2兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4分鐘，然后94°C變性40 秒、52 °C退火40秒、72 °C延伸35秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出目地條帶，將目的條帶回收連接轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆測序。測序結(jié)果顯示反向PCR的結(jié)果是正確的，LI-S的外源片段確實(shí)插入在家蠶基因組nscaf 1898的 12392322 處(圖 2)。實(shí)施例3檢測LI-S外源片段插入位點(diǎn)附近基因的表達(dá)量變化情況
在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中下載插入位點(diǎn)附近的基因序列和對(duì)應(yīng)的EST序列，結(jié)果顯示在距離插入位點(diǎn)150kb范圍內(nèi)，插入位點(diǎn)上游基因BGI000882、BGI001264、BGI001265 (上述基因詳見家蠶基因組數(shù)據(jù)庫)有EST證據(jù)，插入位點(diǎn)下游基因BGI000879、BGI001266、 BGI001267、BGI001268、BGI001269 (上述基因詳見家蠶基因組數(shù)據(jù)庫)有EST證據(jù)。 選擇上述基因設(shè)計(jì)檢測引物(BGI001266QRT F 5' -cgtgaaggcgctgttctacca-3，，R 5，-gcggcgggactagataatactgg-3，；其他基因檢測引物略)。插入位點(diǎn)下游距離最近的基因?yàn)锽GI001266基因。通過RT-PCR進(jìn)行檢測，RT-PCR 的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4分鐘，然后94°C變性40秒、58°C退火40秒、72°C延伸30秒， 共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了 LI-S中BGI001266基因表達(dá)量降低以外(圖3)，其他基因的表達(dá)量在LI_A、LI_S和正常大造中沒有區(qū)別(圖5)；定量PCR的結(jié)果顯示，和正常大造和LI-A相比，LI-S中BGI001266 的表達(dá)量降低了一半(圖4)。LI-A外源片段插入在家蠶基因組12號(hào)染色體的nsCaf2987 上(TTACAGCGACTTAAACTTCTTTAA-piRRyBac-TTAAAGTTGCTATTTTCATCAG)，LI-A 插入位點(diǎn)附近的基因表達(dá)量沒有受到影響。由于LI-S和LI-A唯一的區(qū)別就是外源片段在家蠶基因組上的插入位點(diǎn)不一樣，所以，LI-S對(duì)BmNPV病毒抵抗性大幅降低是由外源片段的插入導(dǎo)致 BGI001266表達(dá)量降低引起的。實(shí)施例4克隆BGI001266基因全長序列
在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中下載該基因的EST序列，根據(jù)家蠶基因組序列和該基因的 EST 序列，設(shè)計(jì)引物克隆該基因(BGI001266qc F 5' -cggtcgtttcgttggagc-3，，R :5，-atttgcgtagaatccaaaatactaac-3，)。以家蠶大造品種5齡3天幼蟲cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4分鐘，然后94°C變性40秒、58°C退火40秒、72°C延伸 1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出目地條帶，將目的條帶回收連接轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆測序。測序結(jié)果顯示我們克隆了 BGI001266的1190bp全長序列，如SEQ ID NO:2所示， 包括 213bp 的 5，UTR、642bp CDS (如 SEQ ID NO: 1 所示)和 332 bp 的 3，UTR。該基因的GC含量高達(dá)71. 5%，有兩個(gè)外顯子，編碼區(qū)序列(Coding sequence，CDS)位于第2外顯子上面。LI-S外源片段的插入位點(diǎn)距離該基因有14. 6Kb。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因具有一個(gè)Spry的結(jié)構(gòu)域，我們將其命名為iMST/T。在 NCBI站點(diǎn)上用BLAST完成序列同源性分析，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)該基因的報(bào)道，說明BmSpry基因是一個(gè)新基因。BmSpry的全長序列以及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如圖6所示。查閱相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道(Hong Joo Kim. Modulation of signalling by Sprouty: a developing story. (J) NATURE REVIEWS. 2004; Mark A. Lemmon. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. (J) Cel1. 2010; Susumu Katsuma. ERK- and JNK-Dependent Signaling Pathways Contribute to Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus Infection. (J) J Virol. 2007)，我們發(fā)現(xiàn)Spry基因是MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)通路上游的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，BmNPV感染家蠶后利用MAPKs信號(hào)通路來進(jìn)行復(fù)制增殖，當(dāng)用抑制劑分別抑制家蠶細(xì)胞中MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)通路的ERK和JNK蛋白后，家蠶細(xì)胞中的病毒含量明顯減少。在LI-S系統(tǒng)中，由于外源片段插入到BmSpry基因上游，可能破壞了汝aS^f基因的調(diào)控序列，從而導(dǎo)致的表達(dá)量降低一半，導(dǎo)致對(duì)MAPKs信號(hào)通路的抑制能力減弱。 當(dāng)BmNPV感染家蠶后，病毒能更加容易的利用該信號(hào)通路進(jìn)行復(fù)制增殖，最終導(dǎo)致家蠶對(duì) BmNPV的抵抗性嚴(yán)重降低。所以，BmSpry基因是控制家蠶對(duì)BmNPV的抵抗性的關(guān)鍵基因。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.家蠶汝基因，其特征在于，所述家蠶汝基因含有如SEQID NO: 1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶徹分^基因，其特征在于，所述家蠶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.權(quán)利要求1所述的家蠶基因的制備方法，其特征在于以家蠶大造品種全蠶或者組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)的上游引物為F 5' - cggtcgtttcgttggagc-3'， 設(shè)計(jì)的下游引物為R 5' - atttgcgtagaatccaaaatactaac-3，，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 4分鐘，然后94°C變性40秒、58 °C退火40秒、72 °C延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72 °C延伸 10分鐘，得如SEQ ID N0:2所示的家蠶汝基因。
4.權(quán)利要求1所述的家蠶基因在調(diào)節(jié)家蠶核型多角體病毒抗性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物基因領(lǐng)域，特別是涉自于家蠶的控制家蠶對(duì)核型多角體病毒(BmNPV)抗性的關(guān)鍵基因，所述家蠶BmSpry基因含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；其以家蠶cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增而得，其在調(diào)節(jié)家蠶型多角體病毒抗性中的應(yīng)用；BmSpry基因表達(dá)量降低一半導(dǎo)致家蠶對(duì)BmNPV的抵抗性降低了100倍，本發(fā)明克隆和鑒定一個(gè)影響家蠶對(duì)BmNPV抗性的關(guān)鍵基因；BmSpry基因在培育家蠶抗BmNPV品種的理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用中都具有重要的價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102392025SQ20111037830
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月24日
發(fā)明者夏慶友, 徐漢福, 王根洪, 程廷才, 蔣亮, 金盛凱, 陸改 申請(qǐng)人:西南大學(xué)