專利名稱：基于coi特異引物的螺旋粉虱分子鑒定技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應(yīng)用生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及應(yīng)用于螺旋粉虱分子鑒定的專用引物及鑒定螺旋粉虱的方法。
背景技術(shù)：
粉虱是農(nóng)林重要害蟲之一，屬于同翅目，粉虱科Homoptera =Aleyrodidae,是一類體型微小的植食性刺吸類害蟲，粉虱體型最大不超過3mm。成蟲兩性均有翅，翅面覆白色蠟粉。粉虱分布于世界各大動物區(qū)，主要是熱帶和亞熱帶，粉虱的寄主植物很廣泛，寄主植物多為木本植物，也包括許多農(nóng)作物，成幼蟲主要寄生于植物葉背面。粉虱的為害包括直接和間接兩個方面。直接為害即是從寄主植物葉內(nèi)大量吸取汁液造成寄主營養(yǎng)缺乏，影響寄主的正常生理活動；粉虱的間接為害方式一方面是其排出的大量蜜露招致灰塵污染葉面和霉菌寄生，影響寄主的光合作用和外觀品質(zhì)，在蔬菜花卉生產(chǎn)上更是嚴(yán)重的問題；另一方面是粉虱作為植物病毒的傳播媒介引起病毒病的大發(fā)生，如煙粉虱可傳播棉花煙草胡椒等的卷葉病毒在溫室大棚中粉虱傳播的病毒病似乎是比粉虱本身為害更嚴(yán)重的問題螺旋粉虱屬粉虱科Family Aleyrodidae,復(fù)孔粉虱屬Aleurodicus，英文名為 Spirallingwhitefly，是一種危險性入侵害蟲，正向世界各熱帶地區(qū)擴(kuò)散。原產(chǎn)于中美洲和加勒比地區(qū)。1905年在西印度群島的馬提尼克島的番石榴上首次被記錄，此后分別向東、西蔓延，隨后幾年在古巴、巴西、厄瓜多爾、秘魯，非洲西北角的加納利群島等地陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)， 再分別逐漸蔓延至太平洋地區(qū)及非洲西岸地區(qū)。1978年在夏威夷瓦胡島(Oahu)首次在欖仁樹上發(fā)現(xiàn)螺旋粉虱，1981年在夏威夷的所有主要島嶼上都有此蟲，其寄主多達(dá)64種植物，包括椰子樹、石榴和柑桔等。同年在薩摩亞和關(guān)島發(fā)現(xiàn)此蟲。1983年菲律賓發(fā)現(xiàn)此蟲。 1985年在馬來西亞的沙撈越該蟲大爆發(fā)，主要危害水果和蔬菜。1987年巴布亞新幾內(nèi)亞報道此蟲危害番石榴和芒果。1988年臺灣省高雄縣大寮鄉(xiāng)番石榴植株上發(fā)現(xiàn)螺旋粉虱，該蟲入侵臺灣后快速擴(kuò)散，每到一處便造成該地植物受損，蔬菜、果樹、行道樹及景觀樹種都被危害。1989年該蟲在印度尼西亞發(fā)現(xiàn)，可危害大豆等14科22種植物。1992年在非洲大陸首先于尼日利亞發(fā)現(xiàn)此蟲，然后到達(dá)多哥，在西班牙檸檬上也大爆發(fā)，在西班牙該蟲不是柑桔的主要害蟲，但可以危害棕櫚和香蕉。1993年傳到貝寧、加納和剛果。印度于1993 1994年的旱季螺旋粉虱大規(guī)模發(fā)生，危害木薯。2006年4月，在中國海南省陵水縣椰林鎮(zhèn)首次發(fā)現(xiàn)了螺旋粉虱寄生于番石榴(Psidium guajavaL.)和印度紫檀(Pterocarpus indicus Willd.)。隨后進(jìn)行廣泛調(diào)查，發(fā)現(xiàn)這種粉虱幾乎已遍布海南各市縣。目前在中國大陸地區(qū)和香港尚未發(fā)現(xiàn)有此蟲出現(xiàn)的報道。鑒于螺旋粉虱的寄主植物廣泛，已經(jīng)報道的寄主植物多達(dá)109科743種，包括蔬菜、果樹、觀賞植物和行道樹等，為害廣，繁殖快，給人們造成嚴(yán)重?fù)p失，防治也比較困難。目前在中國的為害還僅限于臺灣和海南，嚴(yán)格植物檢疫，防止此蟲的進(jìn)一步擴(kuò)散是防治該蟲的一項重要措施。但由于粉虱科昆蟲是一類體型微小的植食性昆蟲。與其它昆蟲類群相比， 目前的粉虱分類比較困難，粉虱的分類系統(tǒng)和種類鑒定，是依據(jù)于第四齡幼蟲；粉虱的一些種類，形態(tài)變異很大，其形態(tài)隨寄主不同而改變，不易區(qū)分。一些近緣種從外部形態(tài)上極難區(qū)分，必須依靠非形態(tài)特征進(jìn)行鑒別。粉虱是世界性的害蟲，其直接造成的為害和所傳播病毒病造成的損失是非常嚴(yán)重的，準(zhǔn)確識別和鑒定粉虱種類是采取治理對策的基礎(chǔ)。由于粉虱體型微小，識別比較困難，螺旋粉虱在熱帶及亞熱帶地區(qū)傳播甚快，造成嚴(yán)重危害，在我國螺旋粉虱被列為檢疫性有害生物。張桂芬等報道了基于RAPD技術(shù)研制的螺旋粉虱的特異性SCAR引物及其檢測方法 (CN101693924A)，但其針對的是單頭昆蟲，其試用的粉虱類的種類較少，且其靈敏度也沒有報道，因此研究建立一種高效、快速、準(zhǔn)確、靈敏且專一性強(qiáng)的螺旋粉虱的鑒別方法仍然十分必要迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服以往粉虱科昆蟲鑒定方法存在的缺陷，提高螺旋粉虱鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度，是一種易于操作、靈敏度高的螺旋粉虱的檢測和診斷方法。該方法可以直接應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，對于螺旋粉虱的鑒定和控制具有十分重要的意義。本發(fā)明的技術(shù)方案如下首先從采集的各種粉虱科昆蟲提取總DNA，利用一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增一段COI基因片段，通過克隆轉(zhuǎn)化后對該DNA片段進(jìn)行序列分析，建立各種類粉虱科昆蟲的序列數(shù)據(jù)庫，在比較數(shù)據(jù)庫DNA的基礎(chǔ)上，設(shè)計一種螺旋粉虱的特異引物， 通過分析在特定條件下的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物結(jié)果，從而達(dá)到快速，準(zhǔn)確鑒定螺旋粉虱的目的。對需要鑒定的粉虱科昆蟲樣品，提取其總DNA，在給定的條件下，用設(shè)計的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳比較PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果，可以鑒定出螺旋粉虱。螺旋粉虱可以在443bp處產(chǎn)生一條清晰地條帶，而非螺旋粉虱昆蟲不能產(chǎn)生條帶，或者不能產(chǎn)生清晰地條帶。本發(fā)明設(shè)計的用于鑒別螺旋粉虱的分子鑒定方法，采用如下步驟1.粉虱科昆蟲的總DNA提前，按常規(guī)昆蟲DNA提取方法進(jìn)行，用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋到0. 1 μ g/ml-0. 4 μ g/ml.2.擴(kuò)增DNA片段，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即用特異的引物進(jìn)行擴(kuò)增，特異的引物對序列為Pl:5，-AAGATATATTTTCCAATTTTATCCC-3，P2 5，-TCGTATAGAATTAAGAATGTTAGGT-3，3.進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用DNA marker檢測PCR片段大小4.鑒定結(jié)果的判斷若出現(xiàn)明顯清晰的443bp大小的條帶，則可判斷為是螺旋粉虱，反之若無此條帶或條帶不清楚，則非螺旋粉虱類昆蟲本發(fā)明的效果是可解決判斷螺旋粉虱和其它粉虱科昆蟲判斷的難題，即使是在多頭粉虱科昆蟲里面混有一頭昆蟲，通過總DNA的提取，用本方法仍然可以檢測出來，提高一對螺旋粉虱鑒定所需的特異引物，PCR反應(yīng)條件，以及一段螺旋粉虱的特征DNA堿基序列。通過對螺旋粉虱DNA濃度的測定，研究發(fā)現(xiàn)在DNA稀釋到Ing/μ 1的濃度條件下，仍然能夠檢測出來，靈敏度高。粉虱科昆蟲由于體型較小，在多種粉虱科昆蟲混在一起的條件下，通過形態(tài)很難判斷是哪類昆蟲，尤其對于非昆蟲專業(yè)人士更加難以區(qū)別，急需找到一種可靠的鑒別方法。本發(fā)明利用螺旋粉虱和其它粉虱科昆蟲DNA堿基序列的差異，建立一種快速、簡便得分子鑒別方法，對于螺旋粉虱的防治以及檢疫具有重大價值。


圖1是用特異性引物擴(kuò)增粉虱科昆蟲電泳檢測圖譜，其中泳道M為DNA Marker, 泳道Fl為螺旋粉虱，泳道F2 F15按順序依次為黑剌粉虱Aleurocmthus sp,柑桔剌 粉風(fēng) Aleurocanthus citriperdus，雙鉤果粉風(fēng) Paraleyrodes pseudonaranjae Martin， ——點(diǎn)紅イ白粉成 Bemisia emiliae，粉威 Trialeurodes vaporariorum, Pentaleyrodes cinnamomi (Takahasni)，俾盤粉蟲し Palaealeurodicus machili (Takahashiノ，粉背氺Il 粉 蟲 1 Aleurocanthus inceratus Silvestri,九里香裸粉 i Dialeurodes sp,番為權(quán)槽 粉風(fēng) Aleurotracnelus anonae Corbett,柑柏‘粉風(fēng) Dialeurodes citri (Ashmead)，克 氏豐朱粉^I Dialeurodes Kirkaldyi (Kotinsky)，Tuberaleyrodes sp.，煙粉風(fēng) Bemisia tabaci(bennadiuso圖2為螺旋粉虱特異性擴(kuò)增靈敏度測定電泳檢測圖譜，其中泳道M為DNA marker ； 泳道400、200、100、50、25、12. 5、5、2和1分別表示擴(kuò)增螺旋粉虱DNA使用濃度為400ng/ U l,200ng/u 1，100ng/u l、50ng/ii l、25ng/ii 1U2. 5ng/u l、5ng/ii l、2ng/ii 1 禾ロ □ lng/ U I。
具體實(shí)施例方式1.粉虱科昆蟲的總DNA提前，按常規(guī)方法進(jìn)行，用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃 度稀釋到 0. lug/ml-O. 4ug/ml.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(一)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以20ul為參考，各物品的用量分別為
IOXPCR反應(yīng)緩沖液2 Ul
MgCl2 (25mM)2 u 1
dNTP (各 IOmM)1. 6 y 1
引物 Pl 和 P2 (IOuM)各 0.8 u 1
供試用DNA模板0.4 Ul
Taq DNA 聚合酶0. 2 y 1
滅菌去離子水補(bǔ)齊至總量為20 u 1(ニ)PCR反應(yīng)條件反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性5min，然后按以下條件進(jìn)行觀個循環(huán)。94°C預(yù)變性 50秒60°C退火 30 秒72°C 延伸 50 秒循環(huán)結(jié)束后，在72°C保持7分鐘補(bǔ)齊，反應(yīng)結(jié)束后在4°C保存。(三)PCR反應(yīng)的電泳監(jiān)測取上述反應(yīng)液4ill與1 ill載樣緩沖液混合，用2 %的瓊脂糖進(jìn)行電泳，EB染色，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行自衛(wèi)檢測。 4.鑒定結(jié)果的判斷若出現(xiàn)明顯清晰的443bp大小的條帶，則可判斷為是螺旋粉虱，反之若無此條帶或條帶不清楚，則非螺旋粉虱類昆蟲。
權(quán)利要求
1.一對螺旋粉虱快速分子檢測的特異性引物，其特征在于引物DNA的序列為Pl :5’ -AAGATATATTTTCCAATTTTATCCC-3’ ；P2 :5’ -TCGTATAGAATTAAGAATGTTAGGT-3’ 上述的引物對在螺旋粉虱總DNA中可以特異性擴(kuò)增出443bp大小的產(chǎn)物。
2.螺旋粉虱鑒定方法，步驟包括權(quán)利要求1所述螺旋粉虱快速分子檢測特異性引物用法包括(1)粉虱科昆蟲的總DNA提前，按常規(guī)方法進(jìn)行，用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋到 0. 1 μ g/ml 0. 4 μ g/ml。(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增用引物Pl和P2，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物(3)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳分析。(4)鑒定結(jié)果的判斷根據(jù)電泳顯示的PCR擴(kuò)增條帶的有無來判斷，若有明顯清晰的 443bp大小的條帶，則可判斷為是螺旋粉虱，反之若無此條帶或條帶不清楚，或片段大小非 443bp大小，則非螺旋粉虱類昆蟲。
全文摘要
本發(fā)明屬于應(yīng)用生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供一種當(dāng)前危害和擴(kuò)散很快的入侵昆蟲螺旋粉虱的快速鑒定的專用引物及其螺旋粉虱分子鑒定的使用方法。本發(fā)明提供的螺旋粉虱特異性引物對，其上游序列為P15’-AAGATATATTTTCCAATTTTATCCC-3’；下游引物為P25’-TCGTATAGAATTAAGAATGTTAGGT-3’，可以用來對螺旋粉虱與其它粉虱科昆蟲的鑒別，本發(fā)明的技術(shù)方案不僅能提高螺旋粉虱鑒別的效率和準(zhǔn)確性，同時操作簡便快捷，具有廣泛的適用性，不僅可以用于單頭昆蟲的鑒定，同時可用于多種昆蟲混雜在一起檢測。檢測靈敏度高，檢測限可達(dá)DNA濃度1ng/μl，通過本發(fā)明方法能夠快速準(zhǔn)確判斷粉虱科昆蟲中是否混有螺旋粉虱的存在，具有重要的理論意義和實(shí)用價值。
文檔編號C12N15/11GK102433381SQ20111037916
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者代鵬, 張敬寶, 張方平, 朱文靜, 牛黎明, 符悅冠, 胡好遠(yuǎn), 韓冬銀, 馬光昌, 黃武仁 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所