專利名稱：一種堿性果膠酶pel168s核苷酸優(yōu)化序列及其高效表達方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到堿性果膠酶pel 168s核苷酸優(yōu)化序列及其高效表達方法。
背景技術(shù)：
堿性高溫果膠酶在生物脫膠中有著無與倫比的作用。隨著社會的發(fā)展，國家對企業(yè)要求越來越高，節(jié)能減排成為企業(yè)的熱門話題。苧麻生物脫膠和織物的生物煮練是ー種綠色環(huán)保的脫膠方法，相比化學(xué)脫膠法，生物脫膠具有提高精干麻質(zhì)量，不損傷纖維，無污染等優(yōu)點。生物脫膠技術(shù)成為國內(nèi)外苧麻研究者的研究熱點，也是未來苧麻脫膠的主要發(fā)展方向。但是，在苧麻脫膠過程中所需要的高溫堿性果膠酶，一般來源于芽孢桿菌和大腸桿菌，它們在原核細胞中可以大量表達，可若想得到大量較純凈的果膠酶，就必須進行一系列復(fù)雜的純化過程。為了便于純化，人們開始采用以畢赤酵母為表達菌株，畢赤酵母只分泌很少的自身蛋白，加上畢赤酵母最小生長培養(yǎng)基中只有少量的蛋白，這意味著分泌的外源蛋白是培養(yǎng)基中蛋白的主要成份，然而由于來源基因密碼子偏好的問題，使堿性果膠酶的產(chǎn)量偏低。因此，如何運用全基因重組合成法尋找新的堿性果膠酶基因序列，使其序列的5’ 端為EcoR I酶切位點、3’端為Not I酶切位點，整個序列不含有SalI、PmeI等限制性酶切位點；選擇合適的表達載體，使表達的蛋白更易于純化且具有更高的活性，極大的降低堿性果膠酶的生產(chǎn)成本，増加企業(yè)對其的利用率成為了我們的研究主題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是I、本發(fā)明提供并公開了ー種序列的5’端為EcoRI酶切位點、3’端為NotI酶切位點，整個序列不含有Sail、PmeI等限制性酶切位點編碼堿性果膠酶pell68s的優(yōu)化基因序列及其基因制備優(yōu)化方法2、本發(fā)明還提出了上述pell68s核苷酸優(yōu)化序列的高表達方法。本發(fā)明目的之一的步驟為(I)采用常規(guī)的PCR重疊引物延伸法。將pell68基因序列(Bacillus subtilis 168,GenBank登錄號AL009126)輸入DNAworks軟件,在密碼子頻率表中(Codon Frequency Table)選擇P. pastoris,并在屏蔽限制性酶切位點選項中選擇Sail、PmeI等酶切位點,得到相關(guān)的pell68在畢赤酵母中表達的一系列優(yōu)化基因序列及引物序列。(2)為了便于表達質(zhì)粒的構(gòu)建，在引物I的前端添加了 EcoRI限制性酶切位點，引物42的5’端引入了 NotI限制性酶切位點。(3)以上述引物序列互為模板，采用從兩端引物向中間引物濃度遞減的方法進行全長的擴增，即引物I、引物42濃度為80nmol/L，依次遞減，但中間引物21、引物22濃度最低為 0. 625nmol/L。具體反應(yīng)條件是 94°C預(yù)變性 5min，然后 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 90s， 30個循環(huán)，再72°C延伸IOmin。(4)PCR產(chǎn)物用0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)量和特異性，并用DNA純化試劑盒純化，和T載體連接轉(zhuǎn)化，挑選轉(zhuǎn)化子經(jīng)過測序驗證后得到和設(shè)計結(jié)果一致的pel 168s優(yōu)化序列。(5)優(yōu)化后的pell68s序列與原始序列pell68相比，序列中的15% -25%的堿基被優(yōu)化且其中的畢赤酵母低頻密碼子均被高頻或次高頻密碼子所替換，為了避免DNA序列中形成的ニ級結(jié)構(gòu)對表達的影響，pell68s基因序列除去了編碼產(chǎn)物自身的21個氨基酸的信號肽序列。其中優(yōu)化后的pell68s序列與原始序列pell68相比，效果最好的是序列中的 294個堿基被優(yōu)化且其中的畢赤酵母低頻密碼子均被高頻或次高頻密碼子所替換。本發(fā)明目的之ニ的步驟為(I)用本發(fā)明目的I中的PCR合成的基因序列經(jīng)過限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI處理后，與同樣經(jīng)過EcoRI和NotI處理的表達載體pPIC9K連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pell68s-9k。(2)重組質(zhì)粒pell68s-9k經(jīng)Sail線性化后轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，得到陽性重組菌株 GS115/pell68s-9k。所述的表達載體是商用載體pPIC9k。也可用其他的畢赤酵母表達載體(如 pPIC3. 5k、pPICZa等)構(gòu)建含有所述基因的重組表達載體。使用所述基因構(gòu)建重組表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，它們可單獨使用或與其它的啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。(3)發(fā)酵培養(yǎng)陽性重組菌株GS115/pell68s-9k，制備得到所述耐熱堿性果膠酶蛋白質(zhì)。(4)同上的方法構(gòu)建未優(yōu)化序列的重組質(zhì)粒pell68_9k，Sail線性化后轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，篩選到陽性重組菌株GS115/pell68-9k，并在相同的條件下進行誘導(dǎo)表達。(5)步驟(3)和步驟(4)表達上清液中堿性果膠酶活性的比較。本發(fā)明采用了以畢赤酵母GS115為表達菌株，運用全基因合成法合成新的基因 (pel 168s)。并根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏愛性,利用DNAworks軟件優(yōu)化從GenBank中檢索到的pell68基因序列,全部選用偏好性大于10%的密碼子,設(shè)計合成了優(yōu)化的pell68s基因。為了便于蛋白的表達，在合成的序列兩端分別引入了 EcoRI和NotI的酶切位點，且優(yōu)化的pel 168s序列中不含有Sail、PmeI等限制性酶切位點。同時為了便于蛋白分泌表達, 在表達載體的選擇上，采用了含有釀酒酵母a因子信號肽序列的pPIC9k表達載體，引導(dǎo)蛋白進行胞外分泌表達，上清液中目的蛋白的含量達到95%以上。使表達的蛋白更易于純化且具有更高的活性。極大的降低了堿性果膠酶的生產(chǎn)成本，増加了企業(yè)對其的利用率。


圖I為合成Pell68s基因產(chǎn)物的0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖片。圖2為優(yōu)化前pel 168基因和優(yōu)化后pel 168s基因所產(chǎn)酶活性比較圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進ー步的說明下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施一、pell68s優(yōu)化基因序列的合成(I)采用實驗室常規(guī)的PCR重疊引物延伸法。將pell68基因序列(Bacillus subtilis 168,GenBank登錄號AL009126)輸入DNAworks軟件,在密碼子頻率表中(Codon Frequency Table)選擇P. pastoris,并在屏蔽限制性酶切位點選項中選擇SalI、PmeI等酶切位點，得到相關(guān)的pell68s在畢赤酵母中表達的一系列優(yōu)化基因序列，其中效果最好的是序列中的294個堿基被優(yōu)化，且序列中除去了 21個氨基酸的信號肽的pel 168s優(yōu)化基因序列(如表I所示)及引物序列(如下表2所示)。pel 168s優(yōu)化基因序列表I(其中豎線表示上下對應(yīng)的堿基相同，空格表示對應(yīng)的堿基不同)
權(quán)利要求
1.一種堿性果膠酶pell68s核苷酸優(yōu)化序列，其特征在于優(yōu)化后的pell68s序列與原始序列pell68相比，序列中的15% -25%的堿基被優(yōu)化且其中的畢赤酵母低頻密碼子均被高頻或次高頻密碼子所替換，序列中除去了 21個氨基酸的信號肽，整個序列不含有Sail、 PmeI限制性酶切位點。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種堿性果膠酶pel168s核苷酸優(yōu)化序列，其特征在于優(yōu)化后的pell68s序列與原始序列pell68相比，序列中294個堿基被優(yōu)化且其中的畢赤酵母低頻密碼子均被高頻或次高頻密碼子所替換，序列中除去了 21個氨基酸的信號肽，序列的5’ 端添加了 EcoRI酶切位點、3’端引入了 NotI酶切位點，整個序列不含有SalI、PmeI限制性酶切位點。
3.一種堿性果膠酶pell68s核苷酸優(yōu)化序列方法，其特征在于優(yōu)化步驟為(1)采用實驗室常規(guī)的PCR重疊引物延伸法，將pell68基因序列(Bacillussubtilis 168,GenBank登錄號AL009126)輸入DNAworks軟件,在密碼子頻率表中(Codon Frequency Table)選擇P. pastoris,得到相關(guān)的pel 168s在畢赤酵母中表達的優(yōu)化基因序列pel 168s 及引物序列；(2)以上述引物序列互為模板，采用從兩端引物向中間引物濃度遞減的方法進行全長的擴增，即引物I、引物42濃度為80nmol/L，依次遞減，但中間引物21、引物22濃度最低為0.625nmol/L;具體反應(yīng)條件是 94°C預(yù)變性 5min，然后 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 90s，30 個循環(huán)，再72°C延伸IOmin ；(3)PCR產(chǎn)物用0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)量和特異性，并用DNA純化試劑盒純化， PCR產(chǎn)物和T載體連接轉(zhuǎn)化，挑選轉(zhuǎn)化子測序后得到和設(shè)計結(jié)果一致的pel 168s優(yōu)化序列；(4)為了便于表達質(zhì)粒的構(gòu)建，在合成的序列兩端分別引入了EcoRI和NotI的酶切位點，且優(yōu)化的pell68s序列中不含有Sail、PmeI等限制性酶切位點。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的ー種堿性果膠酶pell68s核苷酸優(yōu)化序列，其特征在于所述重組載體為將堿性果膠酶pell68s核苷酸優(yōu)化序列插入出發(fā)載體pPIC9K，或載體 PPIC3. 5k、載體pPICZ a的多克隆位點得到的重組表達質(zhì)粒；所述重組菌是將堿性果膠酶 pell68s核苷酸優(yōu)化序列插入出發(fā)載體pPIC9K的多克隆位點得到的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115得到的。
5.一種堿性果膠酶pell68s核苷酸優(yōu)化序列的高表達方法，其特征在于步驟為(1)用權(quán)利要求I或2所述的堿性果膠酶pell68s核苷酸優(yōu)化序列經(jīng)PCR合成，再經(jīng)過限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI處理后，與同樣經(jīng)過EcoRI和NotI處理的表達載體pPIC9K 連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pell68s-9k ；(2)重組質(zhì)粒pell68s-9k經(jīng)Sail線性化后轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，得到陽性重組菌株 GS115/pell68s-9k ；(3)將陽性重組菌株接種于25ml的BMGY培養(yǎng)基中，28°C，200rpm培養(yǎng)48h，至OD為 10-20 ；(4)將培養(yǎng)好的菌液5000rpm離心5分鐘，去掉上清，轉(zhuǎn)接于25ml的BMMY培養(yǎng)基中， 25°C，200rpm培養(yǎng)84h，期間每隔12h補加甲醇至終濃度I %進行誘導(dǎo)；(5)溫度4°C，5000rmp離心過濾IOmin收集上清，上清液中含有大量的活性堿性果膠酶。
全文摘要
本發(fā)明提出并公開了一種堿性果膠酶pel168s核苷酸優(yōu)化序列及其高效表達方法，它是使用DNAworks軟件，將pel168基因序列(Bacillus subtilis 168，GenBank登錄號AL009126)進行優(yōu)化，屏蔽了限制性酶切位點SalI、PmeI，在其引物3’端添加了EcoRI限制性酶切位點，引物5’端引入了NotI限制性酶切位點。經(jīng)PCR擴增，連接轉(zhuǎn)化，測序驗證，得到堿性果膠酶pel168s的優(yōu)化基因序列。用該序列構(gòu)建重組質(zhì)粒pel168s-9k，并轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，得陽性重組菌株GS115/pel168s-9k。發(fā)酵培養(yǎng)陽性重組菌株，可制備得到所述耐熱堿性果膠酶蛋白質(zhì)。使用本發(fā)明堿性果膠酶pel168s核苷酸優(yōu)化序列利用畢赤酵母生產(chǎn)堿性果膠酶，目的蛋白表達量高，純化過程簡單，極大的降低了堿性果膠酶的生產(chǎn)成本，增加了企業(yè)對其的利用率。
文檔編號C12N15/56GK102604977SQ20111037966
公開日2012年7月25日 申請日期2011年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月22日
發(fā)明者張成杰, 張桂敏, 馬延和 申請人:湖北大學(xué)