專利名稱：一種用β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶提高甜菊糖苷味質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬涉及一種用β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶提高甜菊糖苷味質(zhì)的方法屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甜菊糖(Steviasugar)是從甜葉菊、Stevia rebaudianum Bertoni)的葉子中提取的一種雙萜糖苷的混合物，是天然的強(qiáng)力甜味劑，其甜度為蔗糖的150-300倍。經(jīng)過(guò)大量而長(zhǎng)期的毒理及藥理學(xué)研究，已經(jīng)證明甜菊糖在體內(nèi)沒(méi)有潛在性、遺傳性等危害，其安全性已經(jīng)得到了 FAO和WHO等國(guó)際組織的認(rèn)可，2004年7月6日世界聯(lián)合衛(wèi)生組織正式通過(guò)允許甜菊糖在世界范圍內(nèi)通用的決議，伴隨著其安全性被世界認(rèn)可，其經(jīng)濟(jì)效益進(jìn)一步加大。 近年來(lái)，人們對(duì)于健康飲食愈發(fā)重視，作為甜味劑，甜菊糖因其穩(wěn)定性強(qiáng)，熱量低，熱量只相當(dāng)于蔗糖的1/300，無(wú)毒、無(wú)副作用等特點(diǎn)，成為人們尤其是肥胖病、糖尿病、高血壓、動(dòng)脈硬化、齲齒病患者等青睞的食品，具有廣泛而深遠(yuǎn)的發(fā)展前景。隨著甜菊糖的推廣，人們發(fā)現(xiàn)其具有一種苦澀的后味，雖然甜菊糖具有眾多的優(yōu)點(diǎn)，但在人們多年來(lái)形成的口味習(xí)慣的影響下，其經(jīng)濟(jì)效益在某些地區(qū)受到了嚴(yán)重的沖擊。 近年來(lái)，關(guān)于甜菊糖味質(zhì)改善的研究成為了繼甜菊糖安全性研究之后的又一熱點(diǎn)問(wèn)題；可以預(yù)見，建立一種高效的專一性的改善甜菊糖味是的方法必然會(huì)使整個(gè)甜菊糖產(chǎn)業(yè)達(dá)到一個(gè)新的高度。甜菊糖轉(zhuǎn)化技術(shù)的現(xiàn)狀，化學(xué)方法產(chǎn)物復(fù)雜，不易分離，可控性差，且效率不高；國(guó)內(nèi)有使用呋喃果糖苷酶作用甜菊糖與蔗糖的混合物達(dá)到甜菊糖味質(zhì)改善的先例，但其產(chǎn)物也是具有多樣性和不易分離的缺點(diǎn)，也有利用環(huán)糊精糖葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化甜菊糖苷以改善其味質(zhì)，采用的酶以α型為主，其產(chǎn)物成分復(fù)雜，是具有多種葡糖基一甜菊糖苷的混合物，不利于甜菊糖產(chǎn)業(yè)后續(xù)的分離提純步驟，增加的生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是為了克服上述己有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足而提供一種用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶提高甜菊糖苷味質(zhì)的方法，用β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)甜菊糖苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生葡萄糖基一甜菊糖苷，從而甜度可以得到顯著提升、而且成分單一、分離提純簡(jiǎn)單。本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶提高甜菊糖苷味質(zhì)的方法，它按下述步驟進(jìn)行 用水配制成含2-5重量％的甜菊糖苷和2-5重量％的淀粉的反應(yīng)液，將酶活為60-70U/ ml的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶加入反應(yīng)液中充分混合均勻，轉(zhuǎn)移酶的加入量為300-500 U/甜菊糖苷重量g，在溫度為37-50°C進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)48-72小時(shí)，再進(jìn)行分離、提純得到單一的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物葡萄糖基-甜菊糖苷產(chǎn)品，所述的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶是用從甜葉菊種植地土壤樣品中分離獲得β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株Υ-6接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中， 37°C進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵48-72小時(shí)，得到的酶活為60-70 U/ml的β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。
所述的高產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株Υ-6菌落呈圓形凸起，邊緣不整齊，淺黃色，半透明，表面濕潤(rùn)，有光澤。細(xì)胞直桿狀，單個(gè)或短鏈狀存在，不運(yùn)動(dòng)，可生長(zhǎng)溫度為 15-45°C，可生長(zhǎng)ρΗ為7-12，經(jīng)生理生化及16S rRNA基因序列分析與同源性比較，該菌株 Y-6為類芽孢桿菌(Ami如以7ΛΛ5 sp.)，用脫脂牛奶做成凍干管，-70 °C保存或30%甘油于-80 °C保存。
本發(fā)明的類芽孢桿菌(J^ienibacillus sp. Y_6)的保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，類芽孢桿菌保藏編號(hào)為CGMCC No. 5316，保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏時(shí)間2011年10月10日。
從甜葉菊葉片提取出的甜菊糖中，甜菊糖苷(St)是其主要成分，約占60%_70%，甜度為蔗糖的270-300倍，由于甜菊糖苷結(jié)構(gòu)的特殊性，食用后具有一定的不愉快后苦味；其次是甜菊糖A苷(RA)，約占15%-20%，甜度為蔗糖的350-450倍，且其甜味最接近蔗糖，口感較好；其他組分含量均較少。
環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(EC 2. 4.1.19)是α -淀粉酶家族中的一員，系統(tǒng)分類名稱為1，4- α -D-葡萄糖基-4- α -D-轉(zhuǎn)移酶，能夠催化淀粉發(fā)生葡萄糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)生環(huán)糊精，根據(jù)酶主要催化產(chǎn)生的環(huán)糊精種類而分為α-、β-和γ-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶三類。本發(fā)明選用的β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，它具有多種催化活性，能進(jìn)行環(huán)化、偶合、歧化、水解等反應(yīng)，是一類具有廣泛應(yīng)用的酶，用β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)甜菊糖苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化， 能夠在甜菊糖苷的13或19位碳上引入糖基，使其轉(zhuǎn)化為葡萄糖基甜菊糖苷，明顯改善甜菊糖苷的甜度、口感及味質(zhì)，轉(zhuǎn)化后的甜菊糖苷產(chǎn)品品質(zhì)更好，甜度更高，一般轉(zhuǎn)化率可達(dá) 70-85%。
nPaenibaciIlus sp. Υ_6接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵，利用其產(chǎn)生的 β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作為催化劑，以淀粉作為糖基供體，甜菊糖苷作為糖基受體，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化作用后甜菊糖苷整體分子將變成疏水性，得到味質(zhì)改善的葡萄糖基一甜菊糖苷。
β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的選育采用平皿梯度稀釋涂布、透明圈、定性及定量的篩選方法，從甜葉菊種植地土壤樣品中分離獲得高產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株Υ-6。該菌株可在溫度為25-50°C的條件下良好生長(zhǎng)，并且可以耐受較廣的PH7 - 12范圍，環(huán)境適應(yīng)能力很強(qiáng)。
β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的制備將菌株Ami如sp. Y-6接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行分離得到的酶液即為反應(yīng)所需的β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，酶活為60-70U/ml。
由于釆取上述技術(shù)方案使本發(fā)明技術(shù)與已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)及效果(a)本發(fā)明選擇菌株Y-6為高產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶具有多種催化活性，能進(jìn)行環(huán)化、偶合、歧化、水解等反應(yīng)，是一類具有廣泛應(yīng)用的酶，此菌株的獲得可以豐富現(xiàn)有的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株資源。
(b)菌株Υ-6可在溫度為25_50°C的條件下生長(zhǎng)，并且可以耐受較廣的ρΗ7- 12，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，具有進(jìn)一步開發(fā)成高效工程菌株的潛力。
(C)本發(fā)明利用菌株Υ-6進(jìn)行環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)，通過(guò)以淀粉作為糖基供體，甜菊糖苷作為糖基受體的反應(yīng)體系，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化作用后得到味質(zhì)改善的葡萄糖基一甜菊糖苷，降低了其苦澀味，明顯的提高了甜菊糖的味質(zhì)，為甜菊糖的市場(chǎng)化推廣提供了 一定的基礎(chǔ)。(d)本發(fā)明的方法，利用該菌株產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)甜菊糖苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物甜度可以得到顯著提升，且具有轉(zhuǎn)化率高、成分單一等優(yōu)點(diǎn)，不僅可以顯著提高其味質(zhì)，還可以解決以往環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物成分復(fù)雜、不易分離提純等問(wèn)題。(e)該方法簡(jiǎn)單、易控制、產(chǎn)品口感好、甜度高。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
用從甜葉菊種植地土壤樣品中分離獲得高產(chǎn)β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株Υ-6接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在溫度為37°C進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵48-72小時(shí)，得到酶活為60-70 U/ml的 β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，備用，取2g甜菊糖苷和2g淀粉溶解于水中得到IOOml的反應(yīng)液，將8. 57ml酶活為70U/ml的β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶加入反應(yīng)液中充分混合均勻，在溫度為37°C進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)72小時(shí)，再進(jìn)行分離、提純得到單一的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物葡萄糖基-甜菊糖苷產(chǎn)品，轉(zhuǎn)化率可達(dá)70%。實(shí)施例2
取3g甜菊糖苷和3g淀粉溶解于水中得到IOOml的反應(yīng)液，將35ml酶活為60U/ml的 β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶加入反應(yīng)液中充分混合均勻，在溫度為37°C進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)72小時(shí)，再進(jìn)行分離、提純得到單一的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物葡萄糖基-甜菊糖苷產(chǎn)品，轉(zhuǎn)化率可達(dá)75%。實(shí)施例3
取4g甜菊糖苷和4g淀粉溶解于水中得到IOOml的反應(yīng)液，將26. 67ml酶活為60U/ml 的β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶加入反應(yīng)液中充分混合均勻，在溫度為50°C進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)48 小時(shí)，再進(jìn)行分離、提純得到單一的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物葡萄糖基-甜菊糖苷產(chǎn)品，轉(zhuǎn)化率可達(dá)78%。實(shí)施例4
取5g甜菊糖苷和5g淀粉溶解于水中得到IOOml的反應(yīng)液，將35. 71ml酶活為70U/ml 的β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶加入反應(yīng)液中充分混合均勻，在溫度為50°C進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)48 小時(shí)，再進(jìn)行分離、提純得到單一的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物葡萄糖基-甜菊糖苷產(chǎn)品，轉(zhuǎn)化率可達(dá)85%。
權(quán)利要求
1.一種用β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶提高甜菊糖苷味質(zhì)的方法，其特征在于它按下述步驟進(jìn)行用純凈水配制成含2-5%重量的甜菊糖苷和2-5%重量的淀粉的反應(yīng)液，將酶活為 60-70U/ml的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶加入反應(yīng)液中充分混合均勻，轉(zhuǎn)移酶的加入量為 300-500U/甜菊糖苷重量g，在溫度為37-50°C進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)48-72小時(shí)，再進(jìn)行分離、提純得到單一的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物葡萄糖基-甜菊糖苷產(chǎn)品，所述的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶是用從甜葉菊種植地土壤樣品中分離獲得β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株Υ-6接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37°C進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵48-72小時(shí)，得到的酶活為60-70U/ml的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的高產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株Υ-6菌落呈圓形凸起，邊緣不整齊，淺黃色，半透明，表面濕潤(rùn)，有光澤，細(xì)胞直桿狀，單個(gè)或短鏈狀存在，不運(yùn)動(dòng)，可生長(zhǎng)溫度為15_45°C，可生長(zhǎng)ρΗ為7-12，經(jīng)生理生化及16S rRNA 基因序列分析與同源性比較，該菌株Y-6為類芽孢桿菌(Ami如以7ΛΛ5 sp.)，該菌株在中國(guó)科學(xué)院微生物菌種保藏中心的保藏號(hào)為CGMCC No. 5316，利用脫脂牛奶做成凍干管，-70 °C保存或30%甘油于-80 °C保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶提高甜菊糖苷味質(zhì)的方法，其特征在于用水配制成含2-5％重量的甜菊糖苷和2-5％重量的淀粉的反應(yīng)液，將酶活為60-70U/ml的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶加入反應(yīng)液中充分混合均勻，轉(zhuǎn)移酶的加入量為300-500U/甜菊糖苷重量g，在溫度為37-50℃進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)48-72小時(shí)，再進(jìn)行分離、提純得到單一的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物葡萄糖基-甜菊糖苷產(chǎn)品，該方法具有方法簡(jiǎn)單、易控制、產(chǎn)品口感好、甜度高的優(yōu)點(diǎn)及效果。
文檔編號(hào)C12P19/56GK102492757SQ20111037973
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者于學(xué)健, 袁紅莉 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)