專利名稱：：一種抗體的高效表達載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種動物細胞用高效表達載體及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：抗體是一種由抗原誘導(dǎo)、淋巴細胞(漿細胞)合成與分泌的、具有特殊氨基酸序列的免疫球蛋白分子?？贵w可與細菌、病毒或毒素等抗原結(jié)合，通過幾種不同機制中和或除去有害物質(zhì)。抗體作為治療劑的研究已經(jīng)經(jīng)歷一個世紀(jì)(DrewsJ.Drugdiscovery:ahistoryperspective.Science,2000,287(5460):1960-1964)?？贵w藥物是當(dāng)前生物技術(shù)制藥中特別活躍的領(lǐng)域，在某些疾病的治療中發(fā)揮了重要作用。1975年Kohler和Milstein報告用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體(monoclonalantibody，MAb)。單克隆抗體特異性高，性質(zhì)均一。通過細胞工程可以在體外定向地制備各種各樣的單克隆抗體。這在抗體生產(chǎn)中是具有劃時代意義的進展。目前抗體真核表達載體構(gòu)建主要基于兩種策略一是將輕鏈和重鏈分別克隆到兩個真核表達載體上，共轉(zhuǎn)染于哺乳動物細胞中，從而表達出完整抗體；二是將重鏈和輕鏈分別連接到一個具有雙向啟動子的真核表達載體的啟動子之后，或順序性連接在同一真核表達載體的一個啟動子上，然后再轉(zhuǎn)染到哺乳動物細胞中表達。在真核表達體系中，載體的構(gòu)建和宿主細胞的選擇對于決定表達量的高低是至關(guān)重要的。基于對真核表達調(diào)控的認(rèn)識，一個好的真核表達載體至少要具備以下幾個特征①具有一個或多個組成型或誘導(dǎo)型的強啟動子.例如cmV5、EFla等；②真核細胞選擇性的mRNA翻譯及翻譯后加工信號，包括Kozak序列、翻譯終止密碼子、mRNA切割及加尾信號、mRNA剪切信號等；③具有轉(zhuǎn)錄終止子；④具有原核啟動子和篩選標(biāo)志(如抗生素等)以便于載體在細菌中擴增；⑤必須具備真核表達篩選標(biāo)志，這些標(biāo)志包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選標(biāo)志如G418、Zeocin等，還有基因擴增標(biāo)志如DHFR(二氫葉酸還原酶)、GS(谷氨酸合成酶)，兩者原理相似，都既可以作為轉(zhuǎn)染陽性細胞的篩選標(biāo)志，又可擴增目的基因。在CHO細胞表達系統(tǒng)中，高水平表達重組蛋白的細胞株的獲得常常比較困難。最主要的因素是表達外源蛋白的細胞比率低和細胞培養(yǎng)過程中外源基因不穩(wěn)定(Lucas，B.K.,Giere,L.Μ.,DeMarco,R.Α.,Shen,Α.,Chisholm,V.,Crowley,C.W.,1996.High-levelproductionofrecombinantproteinsinCHOcellsusingadicistronicDHFRintronexpressionvector.NucleicAcidsRes.24，1774-1779.)。選擇具有擴增目的基因功能的表達系統(tǒng)如DHFR和GS系統(tǒng)會有效提高細胞集落中高表達細胞株的比例。但是，獲得高表達的細胞株往往需要經(jīng)歷多個細胞篩選步驟，其中單克隆的重復(fù)篩選和MTX加壓篩選過程需要需要耗費大量的時間。而且，這一過程有很大的不確定性。按某一MTX加壓程序?qū)毎M行處理絕非可重復(fù)地產(chǎn)生某個水平的單克隆抗體產(chǎn)率，或使得產(chǎn)率從前一個階段提高某個倍數(shù)。同時，經(jīng)過加壓處理的細胞株生長速率往往顯著降低(BiotechnolBioeng.1998Apr；58(1):73-84.CharacterizationofchimericantibodyproducingCHOcellsinthecourseofdihydrofolatereductase-mediatedgeneamplificationandtheirstabilityintheabsenceofselectivepressure.KimSJ,KimNS,RyuCJ,HongHJ,LeeGM.)。不但從累積細胞數(shù)這一方面影響單克隆抗體的產(chǎn)率，而且這樣生長能力薄弱的細胞株在工藝放大過程中會面臨很多困難，對大生產(chǎn)環(huán)境的適應(yīng)性不高。加壓帶來的基因擴增同時帶來了細胞基因組的不穩(wěn)定，會導(dǎo)致細胞株的生長、單克隆抗體產(chǎn)率、或其他生物性狀在經(jīng)過一段時間的連續(xù)培養(yǎng)后發(fā)生不可預(yù)測的變化(JBiotechnol.1999Aprl5；69(2-3):215-26.Changesduringsubclonedevelopmentandageingofhumanantibody-producingrecombinantCHOcells.StrutzenbergerK,BorthN,KunertR,SteinfellnerW，KatingerH.)。這些不良影響限制了這類方法在構(gòu)建商業(yè)單克隆抗體細胞株中的應(yīng)用。雖然CH0-DG44細胞經(jīng)MTX加壓而制成的單克隆抗體表達細胞株仍可以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)所需要的表達穩(wěn)定性，但可能產(chǎn)生的細胞株之間的遺傳性狀的不同會導(dǎo)致細胞生長條件，營養(yǎng)成分的需求，對生長外環(huán)境因素的反應(yīng)有很大的差別。這種差別使得建立一個通用的平臺工藝變得非常困難。不同細胞株之間的差異化無疑加大了工藝優(yōu)化的困難程度，使優(yōu)化經(jīng)驗的分享變得不可能。另一類方法不使用基因擴增方法，而是在受轉(zhuǎn)染對細胞集落中直接篩選為數(shù)較少的高表達細胞株。此方法獲得的細胞株往往生長速率較高，并保持遺傳性狀的高穩(wěn)定性，滿足大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)對細胞株的要求。但是，為增加高表達細胞株的比例，很多表達載體中力口入了有助于提高表達量的基因兀件。Ease(expressionaugmentingsequenceelement)(TeriL.Aldrich,Improvedbicistronicmammalianexpressionvectorsusingexpressionaugmentingsequenceelement(EASE)Cytotechnology28:9-17,1998.；TeriL.Aldrich,EASEVectorsforRapidStableExpressionofRecombinantAntibodiesBiotechnol.Prog.2003,19,1433-1438)Rβ-globinMARs(matrixattachmentregion)(TeriL.Aldrich,EASEVectorsforRapidStableExpressionofRecombinantAntibodiesBiotechnol.Prog.2003，19，1433-1438)等基因原件皆為專利保護產(chǎn)品。使用這類原件，抑或其他商業(yè)來源的表達質(zhì)粒原件將導(dǎo)致單克隆抗體生產(chǎn)背負一定程度的專利費用。但無疑這類元件上的使用所代表的方向是有實效的。
發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，本發(fā)明的所解決的技術(shù)問題在于提供一種抗體高效表達載體，能夠同時表達抗體的重鏈和輕鏈，避免現(xiàn)有技術(shù)中存在的抗體重鏈和輕鏈表達不均衡的問題，同時增加抗體蛋白的表達率，并且能夠提高后續(xù)單克隆抗體細胞株篩選的有效性。一方面，本發(fā)明提供了一種抗體高效表達載體，該高效表達載體含有抗性基因和兩個基因整合用的目的基因結(jié)合位點，兩個目的基因結(jié)合位點能夠分別結(jié)合抗體分子的重鏈基因和輕鏈基因，兩個目的基因結(jié)合位點分別位于高效表達載體中的兩個表達單元中，分別形成抗體的重鏈表達單元和輕鏈表達單元，所述表達單元中還包括位于所述目的基因結(jié)合位點上游的強表達誘導(dǎo)性啟動子。優(yōu)選地，所述高效表達載體中還包括復(fù)制起始位點，所述抗性基因包括位于所述復(fù)制起始位點的青霉素抗性基因和位于所述復(fù)制起始位點下游的新霉素抗性基因。優(yōu)選地，所述復(fù)制起始位點與所述新霉素抗性基因之間包括新霉素抗性基因的即刻早期啟動啟動子。優(yōu)選地，所述即刻早期啟動啟動子為猿猴病毒40即刻早期啟動啟動子。優(yōu)選地，所述重鏈表達單元和輕鏈表達單元中均含有位于所述目的基因結(jié)合位點上游的巨細胞病毒啟動子。優(yōu)選地，所述重鏈表達單元和輕鏈表達單元中均包括16S雜合內(nèi)含子，16S雜合內(nèi)含子位于啟動子與基因結(jié)合位點，其下游還包括16S拼接受體，16S雜合內(nèi)含子和16S拼接受體能夠有助于抗體分子mRNA的成熟剪切。優(yōu)選地，該高效表達載體還包括引入功能基因和抗體分子編碼基因的酶切位點。另一方面，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題還在于提供一種高效表達載體的構(gòu)建方法，完全避免使用有專利的、或有商業(yè)來源的真核細胞表達元件。將該方法構(gòu)建的高效表達載體用于建立一個非基因擴增的細胞株構(gòu)建方法，通過創(chuàng)造性使用對蛋白表達有促進和抑制作用的表達控制元件，使得整合而成的表達質(zhì)?？梢詫崿F(xiàn)在穩(wěn)定細胞系中單克隆抗體蛋白的高表達。本發(fā)明的提供的一種高效表達載體的構(gòu)建方法包括如下步驟一、pExplOl的構(gòu)建，pExplOl全序列是經(jīng)由DNA合成產(chǎn)生的SEQIDNO:1，此質(zhì)粒的骨架部分來自于pCI-Neo，包含青霉素抗性基因、復(fù)制起始位點，質(zhì)粒功能區(qū)有猿猴病毒40啟動子，巨細胞病毒啟動子，SV40多聚腺嘌呤信號序列，SV40內(nèi)含子；二、pExpl02的構(gòu)建，在pExplOl的基礎(chǔ)上，加入新霉素抗性基因而構(gòu)建；三、pExpl03的構(gòu)建，將具有SEQIDNO5序列的兔β_球蛋白聚腺苷酸化信號序列插入pExplOl中，作為蛋白高表達質(zhì)粒的中間體；四、pExpl04的構(gòu)建，將一個完整的CMV表達單元裝入pExpl02；五、pExpl05的構(gòu)建，將抗CD20抗體gamma鏈cDNA序列SEQIDNO:11插入pExpl03中CMV表達單元，即獲得pExpl05，此質(zhì)粒為構(gòu)建雙基因表達單克隆抗體的表達質(zhì)粒的前體；六、pExpl06的制備，將抗CD20抗體kappa鏈cDNA序列SEQIDNO14插入pExpl04中CMV表達單元，即獲得pExpl06，此質(zhì)粒為構(gòu)建雙基因表達單克隆抗體的表達質(zhì)粒的前體；七、pExpllO的構(gòu)建，通過整合pExpl05和pExpl06，將兩個分別表達單克隆抗體gamma鏈和kappa鏈基因的表達盒整合到一個質(zhì)粒中生成。優(yōu)選地，所述新霉素抗性基因具有SEQIDNO:2的序列，其由PCR法從pSV2_Ne0質(zhì)粒中獲取。優(yōu)選地，步驟四中CMV表達單元是從pExplOl由PCR擴增得到。本發(fā)明中的質(zhì)粒可同時表達單克隆抗體的重鏈和輕鏈。為達到這一目的，此表達質(zhì)粒含有兩個表達單元(業(yè)界也常將表達單元稱作表達盒)，分別表達單克隆抗體的重鏈和輕鏈基因，表達載體同時含有抗體重鏈和輕鏈表達盒的目的是避免細胞中輕鏈和重鏈的表達水平因為兩者基因拷貝數(shù)的不同而產(chǎn)生不平衡。其中，在本發(fā)明的一個具體實施例中，單克隆抗體重鏈表達盒包括人巨細胞病毒主要立即早期抗原啟動子(CMVpromoter)，16S雜合內(nèi)含子(CMV-SV4016Shybridintron)，和兔β-球蛋白聚腺苷酸化信號(RBGpoly-A)序列。在內(nèi)含子和poly-A序列之間是單克隆抗體重鏈cDNA。其中，由于設(shè)計了獨特的限制性內(nèi)切酶位點，重鏈cDNA的可變區(qū)序列即可以和不變區(qū)序列一起切入/切出，也可以獨立切入/切出。單克隆抗體輕鏈表達盒包括人巨細胞病毒主要立即早期抗原啟動子(CMVpromoter)，16S雜合內(nèi)含子(CMV-SV4016Shybridintron)，和猿猴病毒SV40晚聚腺苷酸化信號(SV40polyA)序列。在內(nèi)含子和poly-A序列之間是單克隆抗體輕鏈cDNA。其中，由于設(shè)計了獨特的限制性內(nèi)切酶位點，輕鏈cDNA的可變區(qū)序列即可以和不變區(qū)序列一起切入/切出，也可以獨立切入/切出。單克隆抗體輕鏈和重鏈表達盒中的16S雜合內(nèi)含子(hybridintron)將有助于單克隆抗體分子的mRNA成熟剪切，增加蛋白表達率。本發(fā)明中的質(zhì)粒還含有表達新霉素抗性基因的表達盒。獲得此質(zhì)粒的細胞將會產(chǎn)生對新霉素(Neomycin，ΝΕ0)的抗藥性，用于對轉(zhuǎn)染陽性細胞的篩選。新霉素抗性基因即新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，其表達盒位于單克隆抗體重鏈表達盒下游，且與單克隆抗體重鏈表達方向相反。新霉素抗性基因表達盒從上游到下游依次為SV40即刻早期啟動子(SV40promoter)，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶cDNA，SV40“Small-t〃抗原內(nèi)含子，和SV40早聚腺苷酸化信號(SV40polyA)序列。其中，SV40早聚腺苷酸化信號序列與上述單克隆抗體輕鏈表達盒中的SV40晚聚腺苷酸化信號(SV40polyA)序列是一致的，但從基因表達方向上看序列是互補的。以上對新霉素抗性基因表達盒的設(shè)計使得新霉素的表達受到多方面的限制。這一限制的目的為提高篩選的有效性，確保獲得新霉素抗藥性的細胞都可以有較高水平的單克隆抗體分子的表達。與單克隆抗體重鏈和輕鏈表達盒相比，首先，表達新霉素基因的啟動子為SV40即刻早期啟動子。相較CMV啟動子，SV40啟動子的強度在CHO細胞中僅有前者的15.6%。其二，新霉素表達盒中的SV40"small-t"內(nèi)含子據(jù)報道對新霉素表達有抑制作用。其三，新霉素表達盒所用多聚腺嘌呤信號(poly-Α)序列為SV40早polyA。相對于反方向讀取的晚polyA，其活性有6倍的差距。以上表達載體的構(gòu)建策略皆是為降低新霉素陽性克隆的低表達背景，增加高表達克隆的篩選幾率。將單克隆抗體重鏈表達盒與新霉素抗性基因表達盒在質(zhì)粒上安排成“頭對頭”的方向可以進一步拉大兩者表達量上的差距。重鏈基因雖然使用了較SV40多聚腺嘌呤信號(poly-A)序列更有效的兔β-球蛋白聚腺苷酸化信號(RBGpoly-A)序列，但從重鏈強啟動子的表達未被polyA阻斷的部分仍終止于下游晚SV40聚腺苷酸化信號序列。這種情況下，單克隆抗體重鏈基因和新霉素抗性基因?qū)⒏偁庍@一共用的聚腺苷酸化信號序列。因為這一聚腺苷酸化信號序列從單克隆抗體重鏈一側(cè)讀來的強度高于從新霉素抗性基因一側(cè)的強度(晚SV40polyA強于早SV40polyA)，競爭將進一步削弱新霉素抗性基因的表達水平。因為本發(fā)明的單克隆抗體表達質(zhì)粒不是應(yīng)用基因擴增方法獲得單克隆抗體的高表達(如GS系統(tǒng)和DHFR系統(tǒng))，不能采用將篩選抗性基因(本發(fā)明中為新霉素抗性基因)減低至極限值。本發(fā)明中的新霉素抗性基因的目的是獲得轉(zhuǎn)染陽性的CHO細胞，并使得這些細胞中單克隆抗體表達量高的細胞比例不會太低。微量表達篩選基因產(chǎn)物，并僅僅依賴增加篩選強度獲得的陽性克隆往往富集了很多與單克隆抗體表達水平無關(guān)的基因突變細胞，對提高高表達細胞株篩選效率沒有幫助。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的技術(shù)方案具備如下技術(shù)效果本發(fā)明的高效表達載體，能夠同時表達抗體的重鏈和輕鏈，避免現(xiàn)有技術(shù)中存在的抗體重鏈和輕鏈表達不均衡的問題，同時增加抗體蛋白的表達率，并且能夠提高后續(xù)單克隆抗體細胞株篩選的有效性。另外，采用本發(fā)明的高效表達載體，即不使用基因擴增而獲得的細胞株有較好的生長能力，利用本發(fā)明的高效表達載體進行單克隆抗體表達可以獲得高表達率，圖1質(zhì)粒pExplOl結(jié)構(gòu)示意圖。pExplOl序列為全合成，包含啟動子、poly-A序列、內(nèi)含子等表達控制元素、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)元素、及后續(xù)質(zhì)粒構(gòu)建所需內(nèi)切酶位點。圖2質(zhì)粒pExpl02結(jié)構(gòu)示意圖。pExpl02是在pExplOl基礎(chǔ)上，加入新霉素cDNA制成。圖3質(zhì)粒pExpl03結(jié)構(gòu)示意圖。pExpl03是在pExplOl基礎(chǔ)上，加入兔b_球蛋白聚腺苷酸化信號序列而成。圖4質(zhì)粒pExpl04結(jié)構(gòu)示意圖。pExpl04是在pExpl02中加入一個完整的CMV表達盒。這樣pExpl04就可以同時表達抗體的重鏈和輕鏈基因。圖5質(zhì)粒pExpl05結(jié)構(gòu)示意圖。pExpl05是將抗CD20抗體gamma鏈cDNA插入pExpl03的CMV表達盒中制成。圖6質(zhì)粒pExpl06結(jié)構(gòu)示意圖。pExpl06是將抗CD20抗體kappa鏈cDNA插入pExpl04的CMV表達盒中制成。圖7質(zhì)粒pExpllO結(jié)構(gòu)示意圖。pExpllO是整合pExpl05和pExpl06制成。這樣pExpllO可同時表達抗⑶20抗體的重鏈和輕鏈。具體實施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實施手冊中所述的條件。1、本發(fā)明的高表達質(zhì)粒的構(gòu)建以下質(zhì)粒構(gòu)建過程中，PCR產(chǎn)物均由Qiagen公司試劑盒MinEluteGelExtractionKit(Cat.No.28604)進行純化后再行酶切。在酶切時需要更換內(nèi)切酶緩沖液的，則使用Qiagen公司的試劑盒QIAquickPCRPurificationKit(Cat.No.28104)除去內(nèi)切酶Bstl1071是來自Fermentas公司(Cat.No.ER0701)以外，其他內(nèi)切酶均來自NewEnglandBiolab公司。在DNA制備中，使用了Eppendorf公司的試劑盒FastPlasmidMiniKit(VffRCat.No.47746-464)進行10微克左右規(guī)模的提取，而用了Qiagen公司的試劑盒EndoFreePlasmidMaxiKit(Cat.No.12362)進行DNA500微克規(guī)模的提取。所有以上操作均根據(jù)產(chǎn)品供應(yīng)商提供的用戶操作手冊來完成。每一步質(zhì)粒構(gòu)建工作完成后，用內(nèi)切酶進行診斷酶切，并根據(jù)生成的DNA片段大小判斷并選出正確的克隆。這些結(jié)論后來又通過DNA測序加以驗證。1.1、ρΕχρ101的構(gòu)建為了避免使用任何商業(yè)來源的質(zhì)粒作為構(gòu)建本發(fā)明質(zhì)粒的材料，pExplOl全序列是經(jīng)由DNA合成產(chǎn)生的SEQIDNO1。此質(zhì)粒的骨架部分來自于pCI-Neo，包含青霉素抗性基因(Amp(r))、復(fù)制起始位點(repori.)。其他質(zhì)粒功能區(qū)有猿猴病毒40(SV40)啟動子，巨細胞病毒(CMV)啟動子，SV40多聚腺嘌呤信號序列(poly-A)，SV40內(nèi)含子。1.2、pExpl02的構(gòu)建pExpl02是在pExplOl的基礎(chǔ)上，加入新霉素抗性基因(Neo)而構(gòu)建的。2微克pExplOl質(zhì)粒加入1微升SalI限制性內(nèi)切酶(20，000U/mL,NEB公司)進行酶切，然后向酶切反應(yīng)中加入6XDNA染料，在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，90V電壓進行50分鐘，將酶切開的DNA條帶從膠中切下，用QiagenGelExtraction試劑盒將DNA片段從膠中回收。新霉素抗性基因DNA片段SEQIDNO2由PCR法從pSV2_Neo質(zhì)粒中得到。PCR引物見SEQIDNO3和SEQIDNO:4。PCR使用Stratagene公司PfuTurbo試劑盒，包括dNTP和10倍PCR緩沖液。將兩個IOOuM引物各IuL,10倍PCR緩沖液5uL,2mMdNTP5uL,及5uLpSV40-Neo底物(lOng/uL)，0.5uLPfuTurbo(5U/uL)加入27.5uL無菌蒸餾水中，置于ThermoCyclerPCR儀中進行如下反應(yīng)95°C加熱2分鐘，94°C變性30秒，引物退火(55°C)30秒，擴增(72°C)1分鐘。之后將變性、退火、擴增三步重復(fù)5次，再將退火溫度升溫至60°C，重復(fù)三步25次。隨后再72°C進行5分鐘，溫度降為4°C終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進行電泳(90V，50分鐘)，將810bp條帶從膠中切下，用QiageneGelextraction試劑盒回收DNA片段。此純化的DNA片段經(jīng)MlI酶切，再一次經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收，作為連接的底物。連接反應(yīng)包括約Iug的上述MlI酶切的新霉素抗性基因片段，少量的(0.lug)pExplOl酶切片段，NEB公司連接酶(luL，400，000U/mL)及10倍緩沖液，于室溫一小時進行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取IuL反應(yīng)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，并在含青霉素的LB瓊脂上得到抗性細菌集落。抗性集落被接種于SuperBroth細菌培養(yǎng)液中，加入50ug/mL青霉素并置于37°C培養(yǎng)箱，每分鐘300轉(zhuǎn)搖動培養(yǎng)16-M小時。DNA由SDS-堿法從培養(yǎng)細菌中提取。1.3、pExpl03的制備pExpl03是將兔β-球蛋白聚腺苷酸化信號(RBGpoly-A)序列SEQIDNO:5插入pExplOl中，作為蛋白高表達質(zhì)粒的中間體。RBGpoly-A序列PCR底物為pHCMV-G。所用正、反引物序列見SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。PCR所得520bp產(chǎn)物經(jīng)NotI酶切，經(jīng)瓊脂糖電泳純化，得到連接片段。PExplOl經(jīng)NotI酶切，再經(jīng)經(jīng)瓊脂糖電泳純化，所得線性DNA與純化的RBGpoly-A片段連接。連接反應(yīng)經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，擴增和DNA純化，獲得pExpl03質(zhì)粒。1.4、pExpl04的制備pExpl04是將一個完整的CMV表達盒裝入pExpl02。因為pExpl02已經(jīng)有一個CMV表達盒，這樣pExpl04就有了表達雙基因的能力，適合同時表達單克隆抗體分子的重鏈和輕鏈基因。pExpl02由Bstll07I和MluI雙酶切以后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、純化、回收，得到6272bp片段，并用于連接反應(yīng)。CMV表達盒是從pExplOl由PCR擴增得到。PCR正、反引物見SEQIDNO9和SEQIDNO:10。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、純化后被Bstll07I和MluI酶切，并再一次進行瓊脂糖凝膠電泳分離和純化。回收的如SEQIDN0:8所示的DNA片段為904bp。以上兩個酶切片段經(jīng)連接反應(yīng)和感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化，得到含pExpl04質(zhì)粒的抗性細菌菌落。后續(xù)細菌培養(yǎng)和DNA提取即獲得pExpl04。1·5、pExpl05的制備將抗CD20抗體gamma鏈cDNA序列SEQIDNO11插入pExpl03中CMV表達盒，即獲得pExpl05。此質(zhì)粒為構(gòu)建雙基因表達單克隆抗體的表達質(zhì)粒的前體。抗⑶20抗體gamma鏈cDNA是PCR法將目標(biāo)序列從另一表達質(zhì)粒pS_⑶20-G1中得到。正、反引物分別為SEQIDN0:12和SEQIDN0:13。所獲PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和分離、純化，得到1455bp片段。此片段經(jīng)BamHI和B10I雙酶切，再進一步由瓊脂糖凝膠電泳分離和純化，即用于連接反應(yīng)。pExpl03經(jīng)BamHI和BioI雙酶切后，由瓊脂糖凝膠電泳分離、純化，線性DNA即用于同抗CD20GlcDNA片段進行連接反應(yīng)。所獲抗性克隆經(jīng)培養(yǎng)和DNA制備，即獲得pExpl05。1·6、pExpl06的制備將抗CD20抗體kappa鏈cDNA序列SEQIDNO14插入pExpl04中CMV表達盒，即獲得pExpioe。此質(zhì)粒為構(gòu)建雙基因表達單克隆抗體的表達質(zhì)粒的前體。抗CD20抗體kappa鏈cDNA是PCR法將目標(biāo)序列從另一表達質(zhì)粒pS-CD20_K中得到。正、反引物分別為SEQIDN0:15和SEQIDN0:16。所獲PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和分離、純化，得到713bp片段。此片段經(jīng)BglII和MluI雙酶切，再進一步由瓊脂糖凝膠電泳分離和純化，即用于連接反應(yīng)。pExpl03經(jīng)BglII和MluI雙酶切后，由瓊脂糖凝膠電泳分離、純化，線性DNA即用于同抗⑶20kappa鏈cDNA片段進行連接反應(yīng)。所獲抗性克隆經(jīng)培養(yǎng)和DNA制備，即獲得pExpl06o1·7、pExpllO的制備pExpllO是同時表達單克隆抗體重鏈基因和輕鏈基因的高表達質(zhì)粒。在本發(fā)明中選擇表達的是抗CD20的單克隆抗體基因。pExpllO是通過整合pExpl05和pExpl06，將兩個分別表達單克隆抗體gamma鏈和kappa鏈基因的表達盒整合到一個質(zhì)粒中生成的。ρΕχρΙΟδ和ρΕχρ106分別被RneI和EcoRI雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，分別將3287bp的SEQIDNO17和6552bp兩個片段分離、純化。所獲DNA片段經(jīng)連接反應(yīng)，感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化、DNA制備等步驟，即獲得pExpllO。2、CH0_kl宿主細胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天，將宿主細胞(CH0-K1馴化于EXcel302無血清培養(yǎng)基中(SAFC公司)傳代。懸浮培養(yǎng)的宿主細胞取1毫升，置于BeckmanCoulter細胞計數(shù)儀中進行計數(shù)，獲得細胞密度和活力數(shù)據(jù)。將EXcel302無血清培養(yǎng)基在37°C水浴箱中預(yù)熱，然后將宿主細胞用此新鮮培養(yǎng)基稀釋到le6細胞每毫升的密度，置于250毫升搖瓶(Corning或相似品牌產(chǎn)品)中，在CD2培養(yǎng)箱中(Thermo公司3950型)，置于平面搖床上(NewbrunswickScientific公司hnova2100型)以37°C、5%二氧化碳、IOOrpm轉(zhuǎn)速的培養(yǎng)條件下進行搖瓶培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將細胞置于數(shù)個50mL離心管內(nèi)，以900rpm/5分鐘的條件進行離心(Beckman臺式離心機)。將上清液棄去，細胞沉淀用10毫升經(jīng)過37°C預(yù)熱的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(DMEM/F12+2mML-Gln)打散并進行細胞計數(shù)。將細胞用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基稀釋到5e5細胞/毫升的密度，置于250毫升搖瓶中用同上的方法進行培養(yǎng)。在生物安全柜中準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染溶液。根據(jù)需轉(zhuǎn)染的細胞體積，按每毫升細胞4μgDNA的量將質(zhì)粒DNA加入無菌離心管中，并加入轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基使得DNA濃度達到40ug每毫升。將PEI粉末用室溫的無菌純水溶解，稀釋到1毫克每毫升制成母液，再分裝保存在-20°C。使用時，將PEI母液自冰箱中取出融化，按每毫升細胞8微克的量加入無菌離心管中，使得PEI/DNA比例為2:1。然后將PEI用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基稀釋至與DNA相同體積。將PEI溶液混入DNA溶液中，使用Vortex混合器使兩者混合。將混合的DNA和PEI靜置20分鐘，然后加到細胞中去。經(jīng)轉(zhuǎn)染對細胞在37°C/5%二氧化碳培養(yǎng)箱中搖瓶培養(yǎng)4小時后，向搖瓶內(nèi)加入相同體積的37°C預(yù)熱的PowerCHO(L0NZA公司，貨號12-770Q)生長培養(yǎng)基，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)。48小時以后，開始穩(wěn)定胞株篩選。向細胞培養(yǎng)液中加入新霉素anvitrogen公司，50毫克/毫升母液)，使終濃度達到450微克每毫升。繼續(xù)相同條件培養(yǎng)，并每三天為細胞更換一次培養(yǎng)液(即重復(fù)2.1中離心、計數(shù)、加培養(yǎng)液的操作)并加入新鮮的新霉素。3、單克隆篩選使用新霉素篩選穩(wěn)定細胞株7天后，細胞計數(shù)并按以下條件將細胞接種于96-孔板配制JRH302培養(yǎng)基并添加FBS(Invitrogen公司)。將細胞稀釋為15個細胞每毫升。用多通道移液器，將200uL/孔細胞懸液加入96-孔板，平均每孔3個細胞。共鋪200個96-孔板。將這些96孔板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中(Sanyo公司)，在37°C/5%二氧化碳的條件下靜置培養(yǎng)。第7天，向96孔板中補新鮮培養(yǎng)液每孔100微升。4、單克隆擴增、馴化和篩選4.1待單細胞克隆長大為約50個細胞每集落時，用ELISA法測上清液中單克隆抗體濃度。將羊-抗人IgG-FC單克隆抗體O微克每毫升用0.IM碳酸鈣溶液稀釋，JacksonImmunoResearchLabs，貨號109-005-098)加入ELISA專用96孔板，每孔100微升。用封口膜將96孔板封住，置于2-8°C冰箱中至少8小時。使用前用ELISA洗板機(Biotek405型)將96孔板清洗3次(清洗液為PBS加0.03%Tween-20)。洗板后，加入阻斷液(0.5%BSA稀釋于PBS+0.03%Tween-20)，每孔200微升，并放置室溫至少1小時。然后用4.1.1方法洗板三次。將單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品(已知濃度的人IgG-kappa單克隆抗體)用阻斷液稀釋至3微克每毫升，然后12遞次稀釋成7管。將此標(biāo)準(zhǔn)品梯度樣品加入96孔板的第一列，每孔100微升。使用多通道移液器，將100微升的細胞培養(yǎng)上清液從培養(yǎng)單克隆的96-孔板中移至ELISA板中，但跳過第一列(已用于標(biāo)準(zhǔn)品)。將ELISA板置于平板搖床上，在室溫下以200-300rpm轉(zhuǎn)速搖動一小時。孵育后同上洗板三次。將鼠抗人kappa單克隆抗體-辣根過氧化物酶(HRP)螯合體(SouthernBiotechnologyAssociates，貨號2060-05)用阻斷液稀釋2000倍，加入上述ELISA板中，每孔100微升。將ELISA板置于平板搖床上，在室溫下以200-300rpm轉(zhuǎn)速搖動一小時。孵育后同上洗板六次。洗板后向ELISA板中加入100微升每孔的TMB溶液。在室溫孵育約15_30分鐘，直到標(biāo)準(zhǔn)品最高濃度的孔中呈現(xiàn)深藍色。即刻向ELISA板中加入2M的硫酸。每孔50微升，來停止顯色反應(yīng)。將ELISA板搖動混合，然后放入讀板機(ABI公司spectrum型)中在450納米下讀取數(shù)據(jù)，并減去650納米背景。4.2、根據(jù)每板中相對于標(biāo)準(zhǔn)品的讀數(shù)，選出共48個高表達克隆。將37°C預(yù)熱的JRH302+1%FBS克隆培養(yǎng)基加入24-孔板(每孔1毫升)。用200微升移液器將上述選出的高表達細胞轉(zhuǎn)移出96-孔板，接種入24-孔板。4.3、將M孔板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每3天更換新鮮培養(yǎng)液。待細胞在24-孔板生長起來后，轉(zhuǎn)入6-孔板。首先用真空吸液器吸走舊培養(yǎng)液，每孔加入200微升胰酶溶液。待細胞脫壁后加入1毫升37°C預(yù)熱的JRH302+1%FBS克隆培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入6孔板。每孔再加入克隆培養(yǎng)基3毫升，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每3天更換新鮮培養(yǎng)液。4.4、待細胞在6-孔板中生長起來后，同上方法將細胞轉(zhuǎn)入T-75方瓶瓶。待有足夠細胞后，設(shè)4-天/14-天產(chǎn)率實驗。將T-75方瓶中的培養(yǎng)液用真空吸液器吸走，然后加入2毫升胰酶。待細胞脫壁后，加入10毫升克隆培養(yǎng)液。取1毫升細胞用細胞計數(shù)儀計數(shù)，按2e5細胞每孔種入6孔板中，并加入克隆培養(yǎng)基至每孔4毫升。6-孔板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，在37°C/5%二氧化碳條件下靜置培養(yǎng)。第4天和第14天，各取1毫升細胞培養(yǎng)上清，用HPLC-蛋白A柱法測單克隆抗體濃度(方法見GEHealthcare蛋白A柱使用手冊)。4.5、根據(jù)4.4條件下單克隆抗體的表達水平(見下表)，將克隆排序，取前10位進行懸浮馴化和無血清馴化，使用EXcel302培養(yǎng)基。權(quán)利要求1.一種抗體的高效表達載體，其特征在于該高效表達載體含有抗性基因和兩個基因整合用的目的基因結(jié)合位點，兩個目的基因結(jié)合位點能夠分別結(jié)合抗體分子的重鏈基因和輕鏈基因，兩個目的基因結(jié)合位點分別位于高效表達載體中的兩個表達單元中，分別形成抗體的重鏈表達單元和輕鏈表達單元，所述表達單元中還包括位于所述目的基因結(jié)合位點上游的強表達誘導(dǎo)性啟動子。2.如權(quán)利要求1的所述的高效表達載體，其特征在于所述高效表達載體中還包括復(fù)制起始位點，所述抗性基因包括位于所述復(fù)制起始位點的青霉素抗性基因和位于所述復(fù)制起始位點下游的新霉素抗性基因。3.如權(quán)利要求2的所述的高效表達載體，其特征在于所述復(fù)制起始位點與所述新霉素抗性基因之間包括新霉素抗性基因的即刻早期啟動啟動子。4.如權(quán)利要求3的所述的高效表達載體，其特征在于所述即刻早期啟動啟動子為猿猴病毒40即刻早期啟動啟動子。5.如權(quán)利要求1的所述的高效表達載體，其特征在于所述重鏈表達單元和輕鏈表達單元中均含有位于所述目的基因結(jié)合位點上游的巨細胞病毒啟動子。6.如權(quán)利要求1的所述的高效表達載體，其特征在于所述重鏈表達單元和輕鏈表達單元中均包括16S雜合內(nèi)含子，16S雜合內(nèi)含子位于啟動子與基因結(jié)合位點，其下游還包括16S拼接受體，16S雜合內(nèi)含子和16S拼接受體能夠有助于抗體分子mRNA的成熟剪切。7.如權(quán)利要求1的所述的高效表達載體，其特征在于該高效表達載體還包括引入功能基因和抗體分子編碼基因的酶切位點。8.一種抗體的高效表達載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟一、pExplOl的構(gòu)建，pExplOl全序列是經(jīng)由DNA合成產(chǎn)生的SEQIDNO:1，此質(zhì)粒的骨架部分來自于pCI-Neo，包含青霉素抗性基因、復(fù)制起始位點，質(zhì)粒功能區(qū)有猿猴病毒40啟動子，巨細胞病毒啟動子，SV40多聚腺嘌呤信號序列，SV40內(nèi)含子；二、pExpl02的構(gòu)建，在pExplOl的基礎(chǔ)上，加入新霉素抗性基因而構(gòu)建；三、pExpl03的構(gòu)建，將具有SEQIDNO:5序列的兔β-球蛋白聚腺苷酸化信號序列插入pExplOl中，作為蛋白高表達質(zhì)粒的中間體；四、pExpl04的構(gòu)建，將一個完整的CMV表達單元裝入pExpl02；五、pExpl05的構(gòu)建，將抗CD20抗體gamma鏈cDNA序列SEQIDNO:11插入pExpl03中CMV表達單元，即獲得pExpl05，此質(zhì)粒為構(gòu)建雙基因表達單克隆抗體的表達質(zhì)粒的前體；六、pExpl06的制備，將抗CD20抗體kappa鏈cDNA序列SEQIDNO14插入pExpl04中CMV表達單元，即獲得pExpl06，此質(zhì)粒為構(gòu)建雙基因表達單克隆抗體的表達質(zhì)粒的前體；七、pExpllO的構(gòu)建，通過整合pExpl05和pExpl06，將兩個分別表達單克隆抗體gamma鏈和kappa鏈基因的表達盒整合到一個質(zhì)粒中生成。9.如權(quán)利要求8所述高效表達載體的制備方法，其特征在于所述新霉素抗性基因具有SEQIDNO2的序列，其由PCR法從pSV2_Neo質(zhì)粒中獲取。10.如權(quán)利要求8所述高效表達載體的制備方法，其特征在于步驟四中CMV表達單元是從pExplOl由PCR擴增得到的具有如SEQIDNO8所示序列。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗體的高效表達載體，該高效表達載體含有抗性基因和兩個基因整合用的目的基因結(jié)合位點，兩個目的基因結(jié)合位點能夠分別結(jié)合抗體分子的重鏈基因和輕鏈基因，兩個目的基因結(jié)合位點分別位于高效表達載體中的兩個表達單元中，分別形成抗體的重鏈表達單元和輕鏈表達單元，所述表達單元中還包括位于所述目的基因結(jié)合位點上游的強表達誘導(dǎo)性啟動子。本發(fā)明的高效表達載體能夠同時表達抗體的重鏈和輕鏈，避免現(xiàn)有技術(shù)中存在的抗體重鏈和輕鏈表達不均衡的問題，同時增加抗體蛋白的表達率，并且能夠提高后續(xù)單克隆抗體細胞株篩選的有效性。文檔編號C12N15/66GK102559750SQ201110380100公開日2012年7月11日申請日期2011年11月25日優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日發(fā)明者王笑非,陳倩怡申請人:佛山安普澤生物醫(yī)藥有限公司