專利名稱：一種能對(duì)目標(biāo)重組蛋白進(jìn)行離心法快速分離純化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能對(duì)目標(biāo)重組蛋白進(jìn)行離心法快速分離純化的方法。
背景技術(shù)：
近年來隨著對(duì)蛋白質(zhì)的研究和生產(chǎn)的需要，基因重組技術(shù)突飛猛進(jìn)，出現(xiàn)了很多基因工程產(chǎn)品，深刻地影響人類自身及其環(huán)境。而作為基因工程技術(shù)的下游工程中的基因重組蛋白的分離純化技術(shù)越來越顯示其重要性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，基因工程產(chǎn)品的分離純化成本約占到其全部成本的60% 80%。因此越來越多的生物工作者從事重組蛋白的分離純化工作。與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)分離純化方式相似，重組蛋白的分離純化也是利用其物理和化學(xué)性質(zhì)的差異，即以分子的大小，形狀，溶解度，等電點(diǎn)，親疏水性以及與其它分子的親和性等性質(zhì)建立起來的。當(dāng)前重組蛋白質(zhì)的純化主要是依靠層析和電泳技術(shù)。目前，親和標(biāo)簽已成為后基因組學(xué)時(shí)代純化重組蛋白常用手段。此方法無需了解蛋白質(zhì)的生化特性或生理活性， 就可通過帶標(biāo)簽的重組融合蛋白選擇性地與層析基質(zhì)上的配體結(jié)合，從而得以純化任何蛋白質(zhì)。此方法與常規(guī)的層析方法不同之處在于，針對(duì)不同的蛋白質(zhì)需要開發(fā)特定的配體和方法。采用保護(hù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能完整性的溫和條件，已成功地通過一步親和層析從粗提物中純化出了多種重組蛋白，純度達(dá)90%以上。其中6組氨酸標(biāo)簽的親和層析是目前的代表。但是，此方法依然存在一些不足如與融合標(biāo)簽結(jié)合的特異配基價(jià)格昂貴、鎳柱純化時(shí)金屬鎳離子容易脫落流出混入蛋白溶液、柱子有時(shí)會(huì)非特異性吸附蛋白質(zhì)；因此，限制了在大規(guī)模分離純化中的應(yīng)用。因此，發(fā)展簡(jiǎn)單易行、廉價(jià)、可靠的重組蛋白質(zhì)純化方法對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白及高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供了一種能對(duì)目標(biāo)重組蛋白進(jìn)行離心法快速分離純化的方法。本發(fā)明通過加入一定濃度鹽誘發(fā)融合標(biāo)簽蛋白發(fā)生相變聚集，通過優(yōu)化操作條件，采用離心法分離重組蛋白，效果顯著；該方法簡(jiǎn)單、快速、高效、經(jīng)濟(jì)，不需要特殊儀器，適用范圍廣、易于操作，生產(chǎn)成本低廉，因而適宜進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。為達(dá)到上述的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種能對(duì)目標(biāo)重組蛋白進(jìn)行離心法快速分離純化的方法，包括如下步驟1)通過融合標(biāo)簽蛋白基因上的限制性酶切位點(diǎn)，將目標(biāo)蛋白基因與融合標(biāo)簽蛋白基因連接，并導(dǎo)入到宿主菌中；2)使用不同鹽離子及相應(yīng)的濃度的緩沖溶液，在特定pH值中，通過控制溶液溫度使融合標(biāo)簽蛋白發(fā)生相變聚集得到蛋白質(zhì)溶液；幻對(duì)蛋白質(zhì)溶液通過離心法純化目標(biāo)蛋白。所述的一種能對(duì)環(huán)境條件敏感的融合標(biāo)簽蛋白及其基因，其命名為[KV8F]n，其中 η為重復(fù)數(shù)，其數(shù)值在1-1000之間，該序列已進(jìn)行菌種專利保藏(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC NO. 4185，保藏日期2010年9月17日)并申請(qǐng)了專利(專利申請(qǐng)?zhí)?201010562100. 5)。所述的步驟1)中限制性內(nèi)切酶采用 ApaI、BglII、KpnI、NheI、SphI, XbaI, SacI、 Nde I, Sfi I, EcoR I、pflMI、Hind III和Xho I中的一種或多種；限制性內(nèi)切酶與融合標(biāo)簽蛋白基因相連接；或者在目標(biāo)蛋白與融合標(biāo)簽蛋白基因間加入一段無規(guī)則結(jié)構(gòu)的序列， 然后插入到表達(dá)載體中，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE!3)或者BLR菌株中(二者均為商業(yè)化菌株，可直接從上海超研生物科技有限公司、上海博亞生物科技有限公司購(gòu)買)，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)異丙基-β -D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)使編碼基因(購(gòu)于Sigma公司)獲得融合高效表達(dá)，然后進(jìn)行細(xì)胞破碎。所述的無規(guī)則結(jié)構(gòu)的序列為(AGAGAGPEG)n, η的取值范圍在1_150。所述的高效表達(dá)為低溫誘導(dǎo)表達(dá)，包括如下步驟1)將甘油菌(購(gòu)于上海捷瑞生物工程有限公司)按1 100的體積比接入到含氨芐青霉素(Amp) (100mg/L)的LB液體中培養(yǎng)(OD6tltl值為0. 6-1. 0，時(shí)間為10-12h)，4°C保存，離心收集細(xì)胞；2)將細(xì)胞重懸浮于2ml 的含氨芐青霉素(Amp) (100mg/L) 2ml的Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)，(其配方為蛋白胨 (Tryptone) 10g，酵母提取物(Yeast extract) 5. 0g, NaCl 10g，蒸餾水 1000ml，pH7. 0。)液體中，再培養(yǎng)(OD6tltl值為0.6-1. 0，時(shí)間為10-12小時(shí))，以此接種；按1 100的接種量接種于TB培養(yǎng)基，(每900ml體積的TB培養(yǎng)基配方為蛋白胨12g，酵母粉Mg，丙三醇8ml ；) 中，置于37°C搖床，以200r/min的速度，培養(yǎng)4-5小時(shí)；加入IPTG誘導(dǎo)劑(終濃度為ImM) 誘導(dǎo)7小時(shí)；之后，4°C下以4000r/min的速度，離心15分鐘，按照IL菌液40mlPBS緩沖液重懸菌體。所述的細(xì)胞破碎采用超聲波法，包括如下步驟1)取出加入IPTG誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)7 小時(shí)后的錐形瓶，冰浴，使細(xì)胞停止生長(zhǎng)，將菌液分裝于100ml離心管中，使處于對(duì)稱位置的離心管質(zhì)量相等(配平)，離心，離心條件轉(zhuǎn)速4000r/min，時(shí)間15min ；2)離心機(jī)停止后， 取離心管，棄上清，按1 25 (PBS緩沖溶液菌液)的比例加入PBS緩沖溶液洗滌菌體，在旋渦混合器上充分振蕩，直至將離心管底的菌體沖洗干凈，收集；幻用超聲波破碎機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，條件為超^，停2s，80個(gè)循環(huán)，之后收集細(xì)胞破碎液。所述的步驟2)中的溶液溫度依據(jù)目標(biāo)蛋白的特性，選擇4°C -45°C范圍內(nèi)。所述的步驟2、中鹽離子緩沖溶液的鹽類型采用氯化鈉、硫酸鈉、硝酸鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉，氯化鉀、硫酸鉀、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鉀，硝酸銨、硫酸銨和氯化銨中的一種，其濃度范圍為0. lmol/L-2. 5mol/L，緩沖溶液的pH值范圍為5. 5-8. 5 ；將上述鹽加入到破壁后的細(xì)胞粗提液中，以誘發(fā)融合標(biāo)簽蛋白相變聚集。所述的步驟3)離心法包括如下步驟1)加入終濃度為0. 5% W/V聚乙烯亞胺， 振蕩，使其充分混勻，去除核酸；2)將步驟2)得到的蛋白質(zhì)溶液分裝于IOml的離心管，冰浴15min，離心，其條件為4°C，14000r/min，離心時(shí)間15min ；3)取出離心管，將上清液移到干凈的離心管，棄沉淀，按鹽溶液上清液=1 2的體積比加入鹽溶液，使溶液終濃度在0. 1-2. 5mol/L之間。4°C _45°C恒溫水浴15min，離心，離心條件為溫度:4°C _38°C， 轉(zhuǎn)速:12000-13500r/min，時(shí)間為5_15min ；4)取出離心管，迅速棄上清，每管加2mlPBS緩沖溶液，沿管壁緩慢滴加，使壁上的蛋白質(zhì)充分溶解，冰浴15min后離心，離心條件為4°C， 12000-15000r/min，時(shí)間為5-10min ；5)重復(fù)步驟3)和4) 一次；最終棄沉淀，收集上清，保存在-20°C冰箱中；6)透析后冷凍干燥；其中鹽溶液采用氯化鈉、硫酸鈉、硝酸鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉，氯化鉀、硫酸鉀、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鉀，硝酸銨、硫酸銨和氯化銨中的任
意一種。所述的PBS緩沖溶液由A液和B液組成，其配方為A液0. 2mol/L磷酸氫二鈉溶液，包括Nei2HPO4 28. 4g, Na2HPO4 ·Η20 31. 6lg, Na2HPO4 · 2Η20 35. 6g, Na2HPO4 · 7Η20 53. 63g, Na2HPO4 · Iffl2O 71. 64g，加雙蒸水至 1000ml ；B 液0. 2mol/L 磷酸二氫鈉溶液=NaH2PO4 24. 0g, NaH2PO4 · H2O 27. 6g，NaH2PO4 · 2H20，31. 21g，加雙蒸水至 1000ml ；將 A 液和 B 液混合得到PH在5. 5-8. 5之間的緩沖液。本發(fā)明的有益效果是使用類彈性蛋白多肽(Elastin-Like Polypeptide, ELP) [KV8F]n，將其基因與目標(biāo)蛋白基因通過酶切連接，經(jīng)基因表達(dá)后，通過使用適宜的鹽及相應(yīng)的濃度，控制溶液的PH，使其在特定溫度下發(fā)生相變聚集，之后使用離心法對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化。每純化Ikg蛋白質(zhì)所需原材料的費(fèi)用分別為利用His尾巴親和層析$838124. 73， 使用MPACT-CN純化系統(tǒng)$989606. 23，而采用ELP體系僅$74509. 75，不到前兩者的10%。 采用ELP進(jìn)行非色譜純化操作簡(jiǎn)易、成本低廉，有望給重組蛋白的分離純化技術(shù)帶來革命性的變化。也就是說本發(fā)明提供了一套快速有效的控制ELP相變的方法，可用離心簡(jiǎn)便的將目標(biāo)蛋白純化，同時(shí)可濃縮蛋白溶液，避免了色譜分離的繁瑣操作及對(duì)蛋白樣品的稀釋。 且具有以下特點(diǎn)1)能簡(jiǎn)單、快速與目標(biāo)蛋白基因鏈接，實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)；2)對(duì)目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)和正常功能無明顯影響，安全性高；3)蛋白表達(dá)條件簡(jiǎn)單，純化方便，生產(chǎn)成本低廉，因而適宜進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明為重組蛋白的分離提供了一條新途徑，在生物分離領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中的表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-ELP-dhaT的構(gòu)建圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)1，3丙二醇氧化還原酶的電泳圖譜；圖3是本發(fā)明實(shí)施例2中的表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-SoxB-M2-S_ELP的構(gòu)建圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例2中融合蛋白木聚糖酶的電泳分析圖譜。
具體實(shí)施例方式
下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1本實(shí)施例以該方法分離1，3丙二醇氧化還原酶首先構(gòu)建融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒，步驟如圖1所示，圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中的表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-ELP-dhaT的構(gòu)建圖；過程為將 PUC19-ELP從大腸桿菌DH5 α (為商業(yè)化菌株，可直接從上海超研生物科技有限公司、上海博亞生物科技有限公司購(gòu)買)中抽提出來，用限制性內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切產(chǎn)生 318bp的ELP基因片段，切膠回收。用相同的雙酶切割pET-22b(+)質(zhì)粒，并用Nde I和Hind III將剛才回收的ELP基因片段連接上去得到pET-22b-ELP，轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α中保存。 抽提pUC57-dhaT質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到大量含有Xho I和Hind III識(shí)別位點(diǎn)的dhaT基因。經(jīng)切膠純化后的dhaT基因長(zhǎng)度為1211bp，將之前得到的pET_22b_ELP用Hind III和 Xho I雙酶切處理，然后與dhaT基因序列相連接形成pET-22b-ELP-dhaT質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒構(gòu)建完成后分別用Hind III and Xho I雙酶切鑒定；Nde I and Xho I雙酶切鑒定；Hind III單酶切鑒定；將陽性克隆送到Genscript Co. ,Ltd.測(cè)序。最后將測(cè)序正確的質(zhì)粒抽提并分別轉(zhuǎn)化到E. coli BL21 (DE3)和BLR(DE3)菌株(為商業(yè)化菌株，可直接從上海超研生物科技有限公司、上海博亞生物科技有限公司購(gòu)買)。之后步驟為1.菌株活化將含質(zhì)粒pET-22b-ELP_dhaT的E. coli BL21 (DE3)和 BLR(DE3)1)將甘油菌按1 100的體積比接入到含氨芐青霉素Amp (100mg/L)的LB液體中培養(yǎng)，其中OD600值為0. 6-1. 0，時(shí)間為10-12h ；4°C保存，離心收集細(xì)胞；2)將細(xì)胞重懸浮于2ml的含氨芐青霉素Amp(100mg/L)2ml的Luria-Bertani培養(yǎng)基LB (其配方為蛋白胨 (Tryptone) 10g，酵母提取物(Yeast extract) 5. Og, NaCl 10g，蒸餾水 1000ml，pH7. O。)液體中，再培養(yǎng)，其中0D_值為0.6-1. 0，時(shí)間為10-12小時(shí)；以此接種；按1 100的接種量接種于TB培養(yǎng)基(配方每900ml體積的TB培養(yǎng)基配方為蛋白胨12g，酵母粉Mg，丙三醇8ml)中，置于37°C搖床，以200r/min的速度，培養(yǎng)4-5小時(shí)；加入終濃度為ImM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)7小時(shí)；之后，4°C下以4000r/min的速度，離心 15分鐘，按照IL菌液40mlPBS緩沖液(其配比見表IpH為7. 0的配方)重懸菌體。之后進(jìn)行細(xì)胞破碎，其步驟為1)將低溫誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液冰浴，使細(xì)胞停止生長(zhǎng)，將菌液分裝于 IOOrnl離心管中，使處于對(duì)稱位置的離心管質(zhì)量相等，離心，離心條件轉(zhuǎn)速4000r/min，時(shí)間 15min ；2)離心機(jī)停止后，取離心管，棄上清，按PBS緩沖溶液菌液=1 25的比例加入 PBS緩沖溶液洗滌菌體(其配比見表IpH為7. 0的配方)，在旋渦混合器上充分振蕩，直至將離心管底的菌體沖洗干凈，收集；幻用超聲波破碎機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，條件為超^，停2s， 80個(gè)循環(huán)，之后收集細(xì)胞破碎液。將得到的細(xì)胞粗提液按一下步驟處理，得到純化的1，3丙二醇氧化還原酶。1)加入終濃度為0.5% W/V聚乙烯亞胺，振蕩，使其充分混勻，去除核酸；2)將步驟2)得到的蛋白質(zhì)溶液分裝于IOml的離心管，冰浴15min，離心，其條件為4°C，14000r/min，離心時(shí)間 15min ；3)取出離心管，將上清液移到干凈的離心管，棄沉淀，按鹽溶液(氯化鈉、硫酸鈉、 硝酸鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉，氯化鉀、硫酸鉀、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鉀，硝酸銨、硫酸銨和氯化銨溶液中的一種)上清液=1 2的體積比加入鹽溶液，使其終濃度在0. Imol/ L-2. 5mol/L之間，pH值范圍為5. 5-8. 5 ；以誘發(fā)融合標(biāo)簽蛋白相變聚集。4°C _45°C恒溫水浴15min，離心，離心條件為溫度:4°C _38°C，轉(zhuǎn)速:12000_13500r/min，時(shí)間為5_15min ；4) 取出離心管，迅速棄上清，每管加anlPBS緩沖溶液，(所述的PBS緩沖溶液由A液和B液組成，其配方為=A 液0. 2mol/L 磷酸氫二鈉溶液，包括=Na2HPO4 28. 4g，Na2HPO4 · H2O 31. 61g， Na2HPO4 · 2H20 35. 6g, Na2HPO4 · 7H20 53. 63g, Na2HPO4 · 12H20 71. 64g，加雙蒸水至 1000ml ；B 液0. 2mol/L 磷酸二氫鈉溶液=NaH2PO4 24. 0g, NaH2PO4 · H2O 27. 6g，NaH2PO4 · 2H20，31. 21g， 加雙蒸水至1000ml ；將A液和B液按照表1配比混合即可得到pH在5. 5-8. 5之間的緩沖液。)沿管壁緩慢滴加，使壁上的蛋白質(zhì)充分溶解，冰浴15min后離心，離心條件為4°C， 12000-15000r/min，時(shí)間為5-10min ；5)重復(fù)步驟3)和4) 一次；最終棄沉淀，收集上清，保存在-20°C冰箱中；6)透析后冷凍干燥。最后得到純化的1，3丙二醇氧化還原酶，電泳圖見圖2 ；圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的 SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)1，3丙二醇氧化還原酶的電泳圖譜；其中M泳道是蛋白Marker ；1 泳道是無細(xì)胞抽提物；2泳道是經(jīng)2. OM NaCl純化一次的融合蛋白；3泳道是經(jīng)0. 5M K2CO3純化一次后的融合蛋白；4泳道是經(jīng)0.5M Na2CO3純化一次后的融合蛋白。經(jīng)計(jì)算，其純度可達(dá)98%。實(shí)施例2本實(shí)施例以該方法分離木聚糖酶，首先構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-22 b-SoxB-M2-S-ELP, 在本例中，目的基因SoxB-M2-S-ELP為全基因合成，表達(dá)載體和宿主菌分別為pET_22b和 E. coli BLR(DE3)。重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-SoxB-M2-S_ELP的構(gòu)建流程見圖3。之后提取質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BLR(為商業(yè)化菌株，可直接從上海超研生物科技有限公司、上海博亞生物科技有限公司購(gòu)買)中。圖3是本發(fā)明實(shí)施例2表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-SoxB-M2-S-ELP 的構(gòu)建圖。pET-22b-ELP為我們自行設(shè)計(jì)的序列，已進(jìn)行菌種專利保藏(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC N0.4185，保藏日期2010年9月17日。)； 其中的 SoxB-M2 基因序列來源于文獻(xiàn) Zhang S, Zhang K, Chen X，et al. Five mutations in N-terminus confer thermostability on mesophilic xylanase. Biochemical and biophysical research communications, 2010, 395 (2) :200-206.；而 S 的序列來源于另一篇文獻(xiàn) Wheeldon IR, Campbell Ε, Banta S. A chimeric fusion protein engineered withdisparate functionalities-enzymatic activity and self-assembly. Journal of molecular biology, 2009, 392 (1) :129-142.兩篇文獻(xiàn)均已公開發(fā)表。質(zhì)粒導(dǎo)入重組菌后，菌體培養(yǎng)及收集步驟為1)將甘油菌按1 100的體積比接入到含氨芐青霉素Amp (100mg/L)的LB液體中培養(yǎng)，其中OD6tltl值為0. 6-1. 0，時(shí)間為 10-1 ;4°C保存，離心收集細(xì)胞；2)將細(xì)胞重懸浮于2ml的含氨芐青霉素Amp (lOOmg/ L)2ml的Luria-Bertani培養(yǎng)基LB (其配方為蛋白胨(Tryptone) 10g，酵母提取物(Yeast extract) 5. 0g, NaCl 10g，蒸餾水 1000ml，pH7. 0。)液體中，再培養(yǎng)，其中 OD6tltl 值為 0. 6-1. 0， 時(shí)間為10-12小時(shí)；以此接種；按1 100的接種量接種于TB培養(yǎng)基(配方每900ml體積的TB培養(yǎng)基配方為蛋白胨12g，酵母粉Mg，丙三醇8ml)中，置于37°C搖床，以200r/min 的速度，培養(yǎng)4-5小時(shí)；加入終濃度為ImM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo) 7小時(shí)；之后，4°C下以4000r/min的速度，離心15分鐘，按照IL菌液40mlPBS緩沖液(其配比見表IpH為7.0的配方)重懸菌體。之后進(jìn)行細(xì)胞破碎，其步驟為1)將低溫誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液冰浴，使細(xì)胞停止生長(zhǎng)，將菌液分裝于100ml離心管中，使處于對(duì)稱位置的離心管質(zhì)量相等，離心，離心條件轉(zhuǎn)速4000r/min，時(shí)間15min ；2)離心機(jī)停止后，取離心管，棄上清，按PBS緩沖溶液菌液=1 25的比例加入PBS緩沖溶液洗滌菌體(其配比見表IpH 為7. 0的配方)，在旋渦混合器上充分振蕩，直至將離心管底的菌體沖洗干凈，收集；幻用超聲波破碎機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，條件為超^，停^，80個(gè)循環(huán)，之后收集細(xì)胞破碎液。將得到的細(xì)胞粗提液按一下步驟處理，得到純化的木聚糖酶。將得到的細(xì)胞粗提液按一下步驟處理，得到純化的1，3丙二醇氧化還原酶。1)加入終濃度為0.5% W/V聚乙烯亞胺，振蕩，使其充分混勻，去除核酸；2)將步驟2)得到的蛋白質(zhì)溶液分裝于IOml的離心管，冰浴15min，離心，其條件為4°C，14000r/min，離心時(shí)間 15min ；3)取出離心管，將上清液移到干凈的離心管，棄沉淀，按鹽溶液(氯化鈉、硫酸鈉、 硝酸鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉，氯化鉀、硫酸鉀、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鉀，硝酸銨、硫酸銨和氯化銨溶液中的一種)上清液=1 2的體積比加入鹽溶液，使其終濃度在0. Imol/L-2. 5mol/L之間，pH值范圍為5. 5-8. 5 ；以誘發(fā)融合標(biāo)簽蛋白相變聚集。4°C _45°C恒溫水浴15min，離心，離心條件為溫度:4°C _38°C，轉(zhuǎn)速:12000_13500r/min，時(shí)間為5_15min ；4) 取出離心管，迅速棄上清，每管加anlPBS緩沖溶液，(所述的PBS緩沖溶液由A液和B液組成，其配方為=A 液0. 2mol/L 磷酸氫二鈉溶液，包括=Na2HPO4 28. 4g，Na2HPO4 · H2O 31. 61g， Na2HPO4 · 2H20 35. 6g, Na2HPO4 · 7H20 53. 63g, Na2HPO4 · 12H20 71. 64g，加雙蒸水至 1000ml ；B 液0. 2mol/L 磷酸二氫鈉溶液=NaH2PO4 24. 0g, NaH2PO4 · H2O 27. 6g，NaH2PO4 · 2H20，31. 21g， 加雙蒸水至1000ml ；將A液和B液按照表1配比混合即可得到pH在5. 5-8. 5之間的緩沖液。)沿管壁緩慢滴加，使壁上的蛋白質(zhì)充分溶解，冰浴15min后離心，離心條件為4°C， 12000-15000r/min，時(shí)間為5-10min ；5)重復(fù)步驟3)和4) 一次；最終棄沉淀，收集上清，保存在-20°C冰箱中；6)透析后冷凍干燥。最后得到純化的木聚糖酶，電泳圖見圖4。圖4是本發(fā)明實(shí)施例2中融合蛋白木聚糖酶的電泳分析圖譜。經(jīng)計(jì)算，其純度可達(dá)64. 3%。
由于融合標(biāo)簽蛋白ELP-KV8F能發(fā)生相變現(xiàn)象，同時(shí)它對(duì)要分離的其它目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)無明顯影響。因此，將其編碼基因與需要分離的目標(biāo)蛋白進(jìn)行融合后，表達(dá)出的融合蛋白，可通過精確控制鹽類型及濃度和緩沖液PH值，使融合標(biāo)簽蛋白ELP發(fā)生獨(dú)特的相變現(xiàn)象，經(jīng)高速離心分離，從而達(dá)到對(duì)目標(biāo)蛋白的快速、簡(jiǎn)單的分離，而且該方法不需要借助目前常用的色譜法。
權(quán)利要求
1.一種能對(duì)目標(biāo)重組蛋白進(jìn)行離心法快速分離純化的方法，其特征在于包括如下步驟1)通過融合標(biāo)簽蛋白基因上的限制性酶切位點(diǎn)，將目標(biāo)蛋白基因與融合標(biāo)簽蛋白基因連接，并導(dǎo)入到宿主菌中；2)使用不同鹽離子及相應(yīng)的濃度的緩沖溶液，在特定PH值中，通過控制溶液溫度使融合標(biāo)簽蛋白發(fā)生相變聚集得到蛋白質(zhì)溶液；幻對(duì)蛋白質(zhì)溶液通過離心法純化目標(biāo)蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的一種能對(duì)目標(biāo)重組蛋白進(jìn)行離心法快速分離純化的方法，其特征在于所述的融合標(biāo)簽蛋白及其基因，其命名為[KV8F]n，其中η為重復(fù)數(shù)，其數(shù)值在 1-1000之間，該序列已進(jìn)行菌種專利保藏(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC NO. 4185，保藏日期:2010年9月17日)。
3.如權(quán)利要求1所述的一種能對(duì)目標(biāo)重組蛋白進(jìn)行離心法快速分離純化的方法，其特征在于所述的步驟1)中限制性內(nèi)切酶采用ApaI、BglII、KpnI、NheI、SphI、XbaI、SacI、 Nde I、Sfi I、EcoRI、pflM I,Hind III和Xho I中的一種或多種；限制性內(nèi)切酶與融合標(biāo)簽蛋白基因相連接；或者在目標(biāo)蛋白與融合標(biāo)簽蛋白基因間加入一段無規(guī)則結(jié)構(gòu)的序列， 然后插入到表達(dá)載體中，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)或者BLR菌株中，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)異丙基-D-硫代半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)使編碼基因獲得融合高效表達(dá)， 然后進(jìn)行細(xì)胞破碎。
4.如權(quán)利要求3所述的一種能對(duì)目標(biāo)重組蛋白進(jìn)行離心法快速分離純化的方法，其特征在于所述的無規(guī)則結(jié)構(gòu)的序列為(AGAGAGPEG)n，η的取值范圍在1_150。
5.如權(quán)利要求3所述的一種能對(duì)目標(biāo)重組蛋白進(jìn)行離心法快速分離純化的方法，其特征在于所述的高效表達(dá)為低溫誘導(dǎo)表達(dá)，包括如下步驟1)將甘油菌按1 100的體積比接入到含氨芐青霉素Amp (100mg/L)的LB液體中培養(yǎng)，其中OD6tltl值為0. 6-1. 0，時(shí)間為10-1 ；4°C保存，離心收集細(xì)胞；2)將細(xì)胞重懸浮于2ml的含氨芐青霉素Amp (lOOmg/ L) 2ml的Luria-Bertani培養(yǎng)基LB液體中，再培養(yǎng)，其中OD6tltl值為0. 6-1. 0，時(shí)間為10-12 小時(shí)；以此接種；按1 100的接種量接種于TB培養(yǎng)基中，置于37°C搖床，以200r/min的速度，培養(yǎng)4-5小時(shí)；加入終濃度為ImM異丙基-β -D-硫代半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)7 小時(shí)；之后，4°C下以4000r/min的速度，離心15分鐘，按照IL菌液40mlPBS緩沖液重懸菌體。
6.如權(quán)利要求3所述的一種能對(duì)目標(biāo)重組蛋白進(jìn)行離心法快速分離純化的方法，其特征在于所述的細(xì)胞破碎采用超聲波法，包括如下步驟1)將低溫誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液冰浴， 使細(xì)胞停止生長(zhǎng)，將菌液分裝于100ml離心管中，使處于對(duì)稱位置的離心管質(zhì)量相等，離心，離心條件轉(zhuǎn)速4000r/min，時(shí)間15min ；2)離心機(jī)停止后，取離心管，棄上清，按PBS緩沖溶液菌液=1 25的比例加入PBS緩沖溶液洗滌菌體在旋渦混合器上充分振蕩，直至將離心管底的菌體沖洗干凈，收集；幻用超聲波破碎機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，條件為超^，停2s，80 個(gè)循環(huán)，之后收集細(xì)胞破碎液。
7.如權(quán)利要求1所述的一種能對(duì)目標(biāo)重組蛋白進(jìn)行離心法快速分離純化的方法，其特征在于所述的步驟2)中的溶液溫度依據(jù)目標(biāo)蛋白的特性，選擇4°C -45°C范圍內(nèi)。
8.如權(quán)利要求1所述的一種能對(duì)目標(biāo)重組蛋白進(jìn)行離心法快速分離純化的方法，其特征在于所述的步驟幻中鹽離子緩沖溶液的鹽類型采用氯化鈉、硫酸鈉、硝酸鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉，氯化鉀、硫酸鉀、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鉀，硝酸銨、硫酸銨和氯化銨中的一種，其濃度范圍為0. lmol/L-2. 5mol/L，緩沖溶液的pH值范圍為5. 5-8. 5 ；將上述鹽加入到破壁后的細(xì)胞粗提液中，以誘發(fā)融合標(biāo)簽蛋白相變聚集。
9.如權(quán)利要求1所述的一種能對(duì)目標(biāo)重組蛋白進(jìn)行離心法快速分離純化的方法，其特征在于所述的步驟幻離心法包括如下步驟1)加入終濃度為0.5% W/V聚乙烯亞胺， 振蕩，使其充分混勻，去除核酸；2)將步驟2)得到的蛋白質(zhì)溶液分裝于IOml的離心管，冰浴15min，離心，其條件為4°C，14000r/min，離心時(shí)間15min ；3)取出離心管，將上清液移到干凈的離心管，棄沉淀，按鹽溶液上清液=1 2的體積比加入鹽溶液，使溶液終濃度在0. 1-2. 5mol/L之間。4°C _45°C恒溫水浴15min,離心，離心條件為溫度:4°C _38°C， 轉(zhuǎn)速:12000-13500r/min，時(shí)間為5_15min ；4)取出離心管，迅速棄上清，每管加2mlPBS緩沖溶液，沿管壁緩慢滴加，使壁上的蛋白質(zhì)充分溶解，冰浴15min后離心，離心條件為4°C， 12000-15000r/min，時(shí)間為5-10min ；5)重復(fù)步驟3)和4) 一次；最終棄沉淀，收集上清，保存在-20°C冰箱中；6)透析后冷凍干燥；其中鹽溶液采用氯化鈉、硫酸鈉、硝酸鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉，氯化鉀、硫酸鉀、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鉀，硝酸銨、硫酸銨和氯化銨中的任意一種。
10.如權(quán)利要求5或6或9所述的一種能對(duì)目標(biāo)重組蛋白進(jìn)行離心法快速分離純化的方法，其特征在于所述的PBS緩沖溶液由A液和B液組成，其配方為A液0. 2mol/L磷酸氫二鈉溶液，包括Na2HPO4 28. 4g, Na2HPO4 ·Η20 31. 6lg, Na2HPO4 · 2Η20 35. 6g, Na2HPO4 · 7Η20 53. 63g，Na2HPO4 · 12Η20 71. 64g，加雙蒸水至 1000ml ；B 液0. 2mol/L 磷酸二氫鈉溶液 NaH2PO4 24. 0g, NaH2PO4 · H2O 27. 6g, NaH2PO4 · 2H20，31. 21g，加雙蒸水至 1000ml ；將 A 液和 B液混合得到pH在5. 5-8. 5之間的緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能對(duì)目標(biāo)重組蛋白進(jìn)行離心法快速分離純化的方法，包括如下步驟1)通過融合標(biāo)簽蛋白基因上的限制性酶切位點(diǎn)，將目標(biāo)蛋白基因與融合標(biāo)簽蛋白基因連接，并導(dǎo)入到宿主菌中；2)使用不同鹽離子及相應(yīng)的濃度的緩沖溶液，在特定pH值中，通過控制溶液溫度使融合標(biāo)簽蛋白發(fā)生相變聚集得到蛋白質(zhì)溶液；3)對(duì)蛋白質(zhì)溶液通過離心法純化目標(biāo)蛋白。本發(fā)明通過加入一定濃度鹽誘發(fā)融合標(biāo)簽蛋白發(fā)生相變聚集，通過優(yōu)化操作條件，采用離心法分離重組蛋白，效果顯著；該方法簡(jiǎn)單、快速、高效、經(jīng)濟(jì)，不需要特殊儀器，適用范圍廣、易于操作，生產(chǎn)成本低廉，因而適宜進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/00GK102432668SQ20111038050
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者張光亞, 林毅, 陳國(guó) 申請(qǐng)人:華僑大學(xué)