專利名稱：一種報告基因質(zhì)粒載體、構(gòu)建方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種報告基因質(zhì)粒載體、構(gòu)建方法和用途。
技術(shù)背景
報告基因(importer gene)是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控。目前商用的人類和哺乳動物細(xì)胞的報告質(zhì)粒載體，如PGL3系列，因載體容量小，難以容納10 kb以上的DNA片段，常用于核心啟動子，或小于10 kb的DNA片段調(diào)控活性研究。
目前，人類基因啟動活性的研究主要集中在啟動核心區(qū)域，但是多個基因不具有強(qiáng)啟動子典型的序列特征。生物信息分析顯示人類基因的一些調(diào)控機(jī)制是新近進(jìn)化而來的。比如一些低復(fù)雜度重復(fù)僅存在于靈長類基因而不存在于哺乳動物。引人注意的是人類核心啟動子與靈長類相似，而人類遠(yuǎn)端啟動子區(qū)域是獨(dú)特的。對非人類基因遠(yuǎn)端啟動區(qū)域調(diào)控的研究不能反應(yīng)人類基因遠(yuǎn)端啟動區(qū)域的調(diào)控活性。
對遠(yuǎn)端啟動區(qū)域的調(diào)控研究，需要在完整啟動區(qū)域背景下進(jìn)行，人類完整啟動區(qū)域片段通常大于 ο 1Λ，而目前商用的人類和哺乳動物細(xì)胞的報告質(zhì)粒載體，如PGL3系列， 因載體容量小，難以容納10 kb以上的DNA片段。
故目前對人類遠(yuǎn)端啟動區(qū)域的調(diào)控研究，通常是通過逐段分割的手段進(jìn)行研究， 而缺乏在完整啟動區(qū)域背景的調(diào)控研究，所以研究得出的結(jié)論往往是錯誤的。
目前由于大片段DNA OlO 1Λ)研究在技術(shù)上比較困難，長期限制了對人類基因核心啟動區(qū)域上游的調(diào)控作用研究。因此，迫切需要大片段DNA的啟動調(diào)控研究工具，用以在完整啟動區(qū)域水平上進(jìn)行基因啟動子遠(yuǎn)端調(diào)控活性研究。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種報告基因質(zhì)粒載體，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。
也就是說，本發(fā)明目的是提供一種報告基因質(zhì)粒載體，并明確該載體在大片段DNA 啟動調(diào)控研究中的用途。
所述的大片段DNA是指序列長度為10 300 kb的DNA片段。
本發(fā)明所述的報告基因質(zhì)粒載體，其特征在于可以穩(wěn)定克隆10 300 1Λ的DNA 片段。
本發(fā)明所述的報告基因質(zhì)粒載體，其特征在于可以用于真核生物的大片段DNA啟動活性研究。
本發(fā)明提供了一種報告基因質(zhì)粒載體，其特征在于包含2個SV40 late poly (A)， 合成poly (A)，報告基因，氯霉素抗性基因，多克隆位點(diǎn)和重組選擇標(biāo)記LacZa。
本發(fā)明所述的報告基因質(zhì)粒載體，其上的SV40 late poly (A)和合成poly (A)，其功能可以關(guān)閉來自上游的任何轉(zhuǎn)錄活性。
本發(fā)明所述的報告基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建步驟包括①把含合成poly(A)，多克隆位點(diǎn)，報告基因，SV40 late poly (A)的片段，插入pBeloBACll載體，得到 pBeloBACll-M，(M= I 或 II 或III或IV)備用；②把 SV40 late poly(A)，插入 pBeloBACll-M,即得報告基因質(zhì)粒載體pBeloBACll_MN(M = I或II或III或IV，N = 1或2或 3 或 4)。
本發(fā)明所述的報告基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建步驟中的合成 poly(A)，多克隆位點(diǎn)，報告基因，SV40 late poly (A)可以從市售報告基因質(zhì)粒獲得。
本發(fā)明所述的報告基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于市售報告基因質(zhì)?？梢允莗GL3，pGL2系列螢火蟲熒光素酶報告基因質(zhì)粒，熒光蛋白系列報告基因質(zhì)粒，分泌性堿性磷酸酶系列報告基因質(zhì)粒。
本發(fā)明所述的報告基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于合成poly (A)，多克隆位點(diǎn)，報告基因，SV40 late poly (A)的獲得方法包括酶切和PCR擴(kuò)增。
本發(fā)明所述的報告基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于步驟①中的合成 poly(A)，多克隆位點(diǎn)，報告基因和SV40 late poly (A)的片段，插入pBeloBACll載體的位點(diǎn)在ZacZa和氯霉素抗性基因之間(350 790 bp)。
本發(fā)明所述的報告基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于步驟②中SV40 late poly (A)片段，插入上述pBeloBACll-M的位點(diǎn)在sopC禾口 cos之間(9000 9500 bp)。
本發(fā)明通過構(gòu)建報告基因質(zhì)粒載體pBeloBACll-MN，建立新的評價基因活性表達(dá)系統(tǒng)。目前市售的報告基因載體，其上含報告基因，主要作用是為了在宿主細(xì)胞中容易檢測其表達(dá)，來代表目的片段的啟動調(diào)控活性。但目前市售的報告基因載體容量小，難以容納10 kb以上的DNA片段。pBeloBACll載體特點(diǎn)可以穩(wěn)定克隆大片斷DNA (10 300 kb)。但其不含報告基因和多克隆位點(diǎn)。PBeloBACll-MN載體集合了商業(yè)用報告基因和BAC質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)，可以穩(wěn)定克隆大片斷DNA，其上報告基因的表達(dá)可以代表目的片段的啟動調(diào)控活性， 是大片段DNA啟動調(diào)控研究的非常有價值的研究工具，填補(bǔ)了啟動子遠(yuǎn)端活性研究在完整啟動區(qū)域水平上的空白。
在本發(fā)明的報告基因質(zhì)粒構(gòu)建中，把從市售報告基因載體上得到包括合成poly (A)，多克隆位點(diǎn)，報告基因的片段，插入pBeloBACll載體的位點(diǎn)設(shè)計在L^Za和氯霉素抗性基因之間(350 790 bp)，以及把SV40 late poly (A)片段，插入pBeloBACll-M的位點(diǎn)設(shè)計在sopC和cos之間(9000 9500 bp)。使得本發(fā)明構(gòu)建的載體pBeloBACll-MN上的SV40 late poly (A)和合成poly (A)，可以關(guān)閉來自上游的任何轉(zhuǎn)錄活性，使pBeloBACll-MN熒光素酶表達(dá)近似背景值。本發(fā)明的報告表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定，成功用于18 1Λ完整人多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(human Dopamine transporter，力啟動子區(qū)活性研究,包含從-16672 bp \_hDAT±M 基因溶血磷脂膽堿?；D(zhuǎn)移酶 1 (lysophosphatidylcholine acyltransferase !,LPCATl )3，端位于-15993 bp]到+ 2223 bp ihDAT翻譯起始編碼子ATG)，填補(bǔ)了啟動子遠(yuǎn)端活性研究的空白。通過比對不同長度啟動子區(qū)的啟動活性大小，可以鑒定位于第二個外顯子上游-16672 -8331 bp的區(qū)域，-8331 -3477 bp，以及-3477 kb 2 kb的區(qū)域存在的調(diào)控元件。確證了力瀏/遠(yuǎn)端啟動區(qū)(-1322(T-8331 bp)的增強(qiáng)子作用，為力瀏/調(diào)控研究注入新的概念和內(nèi)容?？傊景l(fā)明為大片段DNA啟動活性調(diào)控研究提供了非常有價值的研究工具。


圖1是pGL3-enhancer吐載體結(jié)構(gòu)示意圖，其上含有熒光素酶(^^+)基因，^^+基 因為報告基因。圖2是pBeloBACll載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖3是pBeloBAC11-MN載體結(jié)構(gòu)示意圖。載體大小為10 kb。其中mini-F質(zhì)粒 元件包括復(fù)制子Ori2，repE，sopA，sopB 和sopC。 SV40 Iate poly(A)和合成ロ。poly (A), 其功能可以關(guān)閉來自上游的任何轉(zhuǎn)錄活性。luc+，熒光素酶基因；SV40增強(qiáng)子，增強(qiáng)luc+ 表達(dá)；氯霉素抗性基因；多克隆位點(diǎn)。包括7個-.Notl,ApaLl,Bamm,Hindlll,Srfl,Mlul, 和NheI可以克隆目的啟動子片段。NotI和歷HindIII可以失活重組選擇標(biāo)記ムばゐ。圖4是完整18，909hDAT啟動子區(qū)克隆進(jìn)入pBeloBACll-I 1的構(gòu)建流程圖。
具體實施例方式以下通過實施例進(jìn)ー步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目 的，不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明實施例中所使用的質(zhì)粒載體pGL3-enhancer載體購自Promega公司； pBeloBACll載體購自New England Biolabs&g。所使用的電轉(zhuǎn)感受態(tài)購自化Invitrogen公司。實施例1 :pBeloBACll- I質(zhì)粒構(gòu)建
1)從pGL3-enhancer載體上NotI/BamHI位點(diǎn)酶切下包括合成poly (A)，多克隆位點(diǎn)， 熒光素酶報告基因(7此+)的片段。酶切體系如下
pGL3-enhancer 載體 0. 4 u g(l yl) BSA0. 5 u 1
NotI0. 5 u 1
BamEI0. 5 u 1
10XNEBBuffer 35 u 1
H2O42. 5 u 1
37V,2 h。2)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用QIAquick Gel Extraction燈セ，進(jìn)行膠回收0嫩片段。3)T4DNA聚合酶，使步驟2)得到的包括合成poly (A)，多克隆位點(diǎn)，熒光素酶報告 基因Uuc+)的DNA片段形成平端。4) 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，QIAquick Gel Extraction燈セ，進(jìn)行膠回收DNA片段。5)5r/I酶切ロ86108六以1，酶切體系為 pBeloBAClli^^ 0.4iig(l u 1)
BSA0. 5 u 1
Srfl0. 5 u 1
10 X Stratagene Buffer 5 u 1
H2O43 u 137°C，2 h。
6 )回收步驟5 )得到的Srfl線性化pBe 1 oBAC 11載體。力卩5 M NH4Ac 5 μ 1，混合后，加 125 μ 1 100% 乙醇，-80°c，4 h ； 14, 000 rpm，4°C，30 min。棄上清，沉淀加 70% 乙醇 0.3 ml, 14, 000 rpm，4°C，15 min。棄上清，沉淀溶解在 ddH20。
7) T4DNA連接酶連接步驟4)和步驟6) DNA片段，連接反應(yīng)體系20 μ 1，T4DNA連接酶2 μ1，16 過夜。
8)大質(zhì)粒(10 3001Λ)的轉(zhuǎn)化冰上操作。
①在冰冷的1. 5 ml試管里，步驟7)連接產(chǎn)物1 μ 1與10 μ 1 ddH20混合，加10 μ 1 電轉(zhuǎn)感受態(tài)(One Shot T0P10 Electrocomp Ε. coli, Cat# C404050, Invitrogen, CA, USA)。
②混合物轉(zhuǎn)到冰冷的2 mm 電轉(zhuǎn)杯(Cat# 4307 000. 593，Eppendorf, Hamburg, Germany)。
(3) % ^ g Gibco BRL Cell Porator Electroporation System (cat# 71600-050 和 11609-039，Gibco BRL)。設(shè)置4 k 歐，330 μ F, fast charge 400 kV 電擊ο
④電擊后，混合物轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)液0. 5 ml, 225 rpm, 37°C 1 hr，接種在氯霉素抗性平皿。37°C培養(yǎng)12-16 h0
9)鑒定。菌落PCR粗步鑒定插入方向，取正向插入克隆，細(xì)菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，測序驗證。得到 pBeloBACll- I。
10)保存轉(zhuǎn)化 pBeloBACll- I 菌種。
實施例2 :pBel0BACl 1- I 1報告基因質(zhì)粒載體構(gòu)建1)以 pGL3-enhancer 載體為模板，PCR擴(kuò)增含 SV40 late poly (A)片段。引物 F: 5，_C CCCCACATGTCAGACATGATAAGATACATTGAT (PciI site下劃線)，引物R: 5，-TTTTTTGGTAACC TACCACATTTGTAGAGGTTTTAC (feiEII site 下劃線)。PCR 反應(yīng)體系 H2O42 μ 110Χ Pfu Buffer 5 μ 1 IOmM dNTP 1 μ 1 Template100 ngPrimers0. 2 μ 1Pfu1 μ 1Total50 μ 1PCR條件采用程序95°C 5 min ； 95°C 30 sec, 60°C 30 sec, 72°C 30 sec，30循環(huán)；72°C 2min延伸。PCR 產(chǎn)物取2 μ 1凝膠電泳，條帶清晰單一。
2)純化步驟1)PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物加5 M NH4Ac 5 μ 1，混合后，加125 μ 1 100% 乙醇，-80°C，4 h, 14, 000 rpm, 4°C，30 min。棄上清，沉淀加 70% 乙醇 0· 3 ml, 14, 000 rpm, 4°C, 15 min。棄上清，沉淀溶解在ddH20。
3)PciI/fe EII雙酶切步驟2)純化的DNA片段。酶切體系為步驟2)純化的DNA片段0. 4μ g(l μ 1)BSAPcilBst^llIOXNEBBuffer 3 H2O37°C，2 h。0. 5 μ 1 0. 5 μ 1 0. 5 μ 1 5 μ 1 42. 5 μ 1
4) 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，用QIAquick Gel Extraction Kit，進(jìn)行膠回收DNA片段。
b)Pcil/Bst^ll雙酶切實施例1得到的pBeloBACll- I質(zhì)粒，酶切體系為 pBeloBACll- I0. 4μ g(l μ 1)BSAPcilBst^llIOXNEBBuffer 3H2O0. 5 μ 1 0. 5 μ 1 0. 5 μ 1 5 μ 1 42. 5 μ 1 37°C，2 h。
6)回收步驟 5)得到的Pcil/feiEII 線性 pBeloBACll- I 質(zhì)粒。加 5 M NH4Ac 5 μ 1,混合后，加 125 μ 1 100% 乙醇，-80°C，4 h ； 14, 000 rpm，4°C，30 min。棄上清，沉淀加 70% 乙醇 0.3 ml, 14, 000 rpm，4°C，15 min。棄上清，沉淀溶解在 ddH20。
7) T4DNA連接酶連接步驟4)和步驟6) DNA片段，連接反應(yīng)體系20 μ 1，T4DNA連接酶1 μ1，16 過夜。
8)連接產(chǎn)物1 μ 1電轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)感受態(tài)，轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)液0. 3 ml中，225 rpm，37°C 1 hr 37°C ο取適量，接種氯霉素抗性培養(yǎng)皿，37°C，12 — 16h。得到含pBeloBACll- I 1報告基因質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化子菌落。
9)鑒定。菌落PCR粗步鑒定含正確插入子菌落，細(xì)菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，測序驗證。
10)保存轉(zhuǎn)化 pBeloBACll- I 1 菌種。
實施例3 :pBeloBACll- II質(zhì)粒構(gòu)建1)從pGL3-enhanCer載體上勒們/5^1位點(diǎn)酶切下包括合成poly (A)，多克隆位點(diǎn)， 熒光素酶報告基因(A/c+)的片段。酶切體系如下 pGL3_enhancer 載體 0. 4 μ g(l μ 1) BSA0. 5 μ 1Bgll0. 5 μ 1Sail0. 5 μ 1IOXNEBBuffer 35 μ 1H2O42. 5 μ 1溫度37度，2小時。
2) 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，用QIAquick Gel Extraction Kit，進(jìn)行膠回收DNA片段。
3)T4DNA聚合酶，使步驟2)得到的包括合成poly (A)，多克隆位點(diǎn)，熒光素酶報告基因Uuc+)的DNA片段形成平端。
4) 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，QIAquick Gel Extraction Kit，進(jìn)行膠回收DNA片段。
5) T4DNA連接酶連接步驟4)和實施例1步驟6)得到的Srfl線性化pBeloBACll 載體，連接反應(yīng)體系20 μ1，Τ4 ΝΑ連接酶2 μ1，16 過夜。
6)連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)感受態(tài)，操作同實施例1步驟8)，電擊后，混合物轉(zhuǎn)入 LB培養(yǎng)液0.5 ml, 225 rpm,37°C 1 hr，接種在氯霉素抗性平皿。37°C培養(yǎng)12-16 h。
7)鑒定。菌落PCR粗步鑒定插入方向，取正向插入克隆，細(xì)菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，測序驗證。得到 pBeIoBACl 1- II。
10)保存轉(zhuǎn)化 pBeloBACll- II菌種。
實施例4 :pBeloBACll- II 1報告基因質(zhì)粒載體構(gòu)建I)Pcil/Bstmi雙酶切實施例6得到的pBeloBACll- II質(zhì)粒載體，酶切體系為pBeloBACll- II0.4 μ g(l μ 1)BSA0. 5 μ 1Pcil0. 5 μ 1BstEII0. 5 μ 1IOXNEBBuffer 35 μ 1H2O42. 5 μ 137°C，2 h。
2)回收步驟1)得到的Z^il/feiEII線性pBeloBACll- II質(zhì)粒載體。加5 M NH4Ac 5 μ 1，混合后，加 125 μ 1 100% 乙醇，-80°C，4 h ;14，000 rpm,4°C,30 min。棄上清，沉淀加 70% 乙醇 0.3 ml, 14, 000 rpm，4°C，15 min。棄上清，沉淀溶解在 ddH20。
3)T4DNA連接酶連接和步驟2)DNA片段和實施例2步驟4)得到的DNA片段，連接反應(yīng)體系20 μ 1，T4DNA連接酶1. 5 yl，16°C過夜。
4)連接產(chǎn)物1 μ 1電轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)感受態(tài)，轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)液0. 3 ml中，225 rpm，37°C 1 hr 37°C ο取適量，接種氯霉素抗性培養(yǎng)皿，37°C，12 — 16h。得到含pBeloBACll- II 1報告基因質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化子菌落。
5)鑒定。菌落PCR粗步鑒定含正確插入子菌落，細(xì)菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，測序驗證。
6)保存轉(zhuǎn)化 pBeloBACll- II 1 菌種。
實施例5 :pBeloBACll- II 2報告基因質(zhì)粒載體構(gòu)建1)以 pGL3-enhancer 載體為模板，PCR 擴(kuò)增含 SV40 late poly(A)片段。引物 F: 5，_C CCCCACCTGGTCAGACATGATAAGATACATTGAT (SexAI site 下劃線)，引物R: 5，-TTTTTTGTTAAC TACCACATTTGTAGAGGTTTTAC Qipal site 下劃線)。PCR 反應(yīng)體系H2O42 μ 110X Pfu Buffer5 μIOmM dNTP1 μ 1Template100 ngPrimers0. 2μ 1Pfu1 μ 1Total50 μ 1PCR條件采用程序950C 5 min ； 95°C 30 sec, 60°C 30 sec, 72°C 30 sec，30循環(huán)；72°C 2min 延伸。PCR 產(chǎn)物取2 μ 1凝膠電泳，條帶清晰單一。
2)純化步驟1)PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物加5 M NH4Ac 5 μ 1，混合后，加125 μ 1 100% 乙醇，-80°C，4 h，14，000 rpm,4°C,30 min。棄上清，沉淀加 70% 乙醇 0. 3 ml, 14, 000 rpm, 4°C, 15 min。棄上清，沉淀溶解在ddH20。
3)Sexkl/ffpal雙酶切步驟2)純化的DNA片段。酶切體系為步驟2)純化的DNA片段0. 4μ g(l μ 1)BSASexAIHpalIOXNEBBuffer 4 H2O0. 5 μ 1 0. 5 μ 1 0. 5 μ 1 5 μ 1 42. 5 μ 1 37°C，2 h。
4) 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，用QIAquick Gel Extraction Kit，進(jìn)行膠回收DNA片段。
b) Sexkl/Hpal雙酶切實施例3得到的pBeloBACll- II質(zhì)粒，酶切體系為 pBeIoBACl 1- II0. 4μ g(l μ 1)BSA0. 5 μ 1Sexkl0. 5 μ 1Hpal0. 5 μ 1IOXNEBBuffer 45 μ 1H2O42. 5 μ 137°C，2 h。
6)回收步驟 5)得到的線性 pBeloBACll- II 質(zhì)粒。加 5 M NH4Ac 5 μ 1，混合后，加 125 μ 1 100% 乙醇，-80°C，4 h ； 14, 000 rpm,4°C, 30 min。棄上清，沉淀加 70% 乙醇 0.3 ml, 14, 000 rpm，4°C，15 min。棄上清，沉淀溶解在 ddH20。
7) T4DNA連接酶連接步驟4)和步驟6) DNA片段，連接反應(yīng)體系20 yl，T4DNA連接酶1.5 μ1，16 過夜。
8)連接產(chǎn)物1 μ 1電轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)感受態(tài)，轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)液0. 3 ml中，225 rpm, 37°C 1 hr 370C ο取適量，接種氯霉素抗性培養(yǎng)皿，37°C，12-16h。得到含pBeloBACll- II 2報告基因質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化子菌落。
9)鑒定。菌落PCR粗步鑒定含正確插入子菌落，細(xì)菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，測序驗證。
10)保存轉(zhuǎn)化 pBeloBACll- II 2 菌種。
實施例6 :pBel0BACl 1- I 2報告基因質(zhì)粒載體構(gòu)建 DSexkl/Hpal雙酶切實施例1得到的pBeloBACll- I質(zhì)粒載體，酶切體系為 pBeloBACll- I0. 4μ g(l μ 1)BSA0. 5 μ 1Sexkl0. 5 μ 1Hpal0. 5 μ 1IOXNEBBuffer 45 μ 1H2O42. 5 μ 137°C，2 h。
2)回收步驟5)得到的Sexkl/Hpal線性pBeloBACll- I質(zhì)粒載體。加5 M NH4Ac 5 μ 1，混合后，加 125 μ 1 100% 乙醇，-80°C，4 h ;14，000 rpm,4°C,30 min。棄上清，沉淀加 70% 乙醇 0.3 ml, 14, 000 rpm，4°C，15 min。棄上清，沉淀溶解在 ddH20。
3) T4DNA連接酶連接步驟2)和實施例5步驟4)得到的DNA片段，連接反應(yīng)體系 20 μ 1，T4DNA 連接酶 1. 5 yl，16°C過夜。
8)連接產(chǎn)物1 μ 1電轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)感受態(tài)，轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)液0. 3 ml中，225 rpm，37°C 1 hr 37°C ο取適量，接種氯霉素抗性培養(yǎng)皿，37°C，12 — 16h。得到含pBeloBACll- I 2報告基因質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化子菌落。
9)鑒定。菌落PCR粗步鑒定含正確插入子菌落，細(xì)菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，測序驗證。
10)保存轉(zhuǎn)化 pBeloBACll- I 2 菌種。
實施例7 克隆完整18 kb啟動子區(qū)進(jìn)入pBeloBACll- I 1完整18 kb啟動子區(qū)共18，895 bp，包含從-16672 bp 0 Γ上游基因^/ 77 3， 端位于-15993 bp)到+ 2223 bp 0 Γ翻譯起始編碼子 ATG)。依據(jù) Genbank accession number NM_001044 (18-0CT-2009)，以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為+ 1。用細(xì)菌人工染色體(BAC， Bacterial artificial chromosome)克隆(AC091933. 2)為模板。克隆步驟如下 1)構(gòu)建 pBACll—hDAT7. 9KB克隆 7,777 bp BsaM/BcoRY 片斷(-5930 bp 到 +1847 bp) (AC091933. 2)進(jìn)入 pGL3-Enhancer 載體(Promega)lSsaI 位點(diǎn)，產(chǎn)生 pGL3e_hDAT7. 7KB 質(zhì)粒。以 AC091933. 2 為模板，引物5，-CGCTGCTGCTGGATCCAAAT-3，{BairMl，下劃線)，5，-GGGGGGGATCCATGGAGGCC TCAAGACAG-3，(fe HI，下劃線)擴(kuò)增片段(+1099 bp 到+1968 bp)，及拙HI 酶切后，869 bp 片段，替換 pGL3e-hDAT7. 7KB 上 748 bp BairMl/BglW 片段，得到 pGL3e_hDAT7. 9KB (-5930 bp到+1968 bp)。該質(zhì)粒缺乏翻譯起始編碼子ATG前255 bp。由于高拷貝pGL3_Enhancer 載體很難載納更大的插入子。
2)為了成功克隆完整18 kb啟動子，首先/i^I/Aaill雙酶切pBACll—hDAT7. 9KB 切去5，端3. 2 1Λ，3，端的切口 UaiII)用"Γ4 DNA聚合酶修平后自連，得到9. 8 1Λ質(zhì)粒。 (見圖4第①步)3)補(bǔ)齊255 bp 片斷。PCR 擴(kuò)增 255 bp 片斷，引物 F 5，-TTGGTGGCTCATGCCTGTCATCT (位于力瀏/第一個內(nèi)含子&ORV位點(diǎn)上游414bp)，引物R: 5’- GGGGGAAGCTTGGCGCGCCGGG CACACTGGGAGTTGAGGAA QiincIlll 斜體，AscI 下劃線)。PCR 條件95°C 5 min ； 95°C 30 sec, 680C for 1 min，30 循環(huán)；68°C 2min 延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物 819 bp。^boRV/歷iiZIII 雙酶切后，用PCR酶切后產(chǎn)物379 bp替換9. 8 1Λ質(zhì)粒中的124 bp EcoRV/Hindlll六m。這樣， 補(bǔ)齊255 bp的缺口，形成10 1Λ質(zhì)粒。(見圖4第②步)4)用pBeloBACll- I 1 載體替換 pGL3_Enhancer 載體。Nhel/Asull 雙酶切片斷，包含力瀏/ ΝΑ和Λ/c+基因前169 bp片斷，插入pBeloBACll- I 1載體。AswII從Fermentas (Cat# ER0121)購買，雙酶切使用 TangoTM Ix Buffer (Cat# BTO, Fermentas)。(見圖 4第③步)5)完整克隆。用BAC克隆(AC091933. 2)的17，043 bp Mlul酶切片斷代替第4)得到的質(zhì)粒中的ΙΑ/Ι/ΙΛ/Ι (3. 1 kb)片斷。插入方向鑒定雙酶切得到12. 5 kb片斷為正確的插入方向。酶切使用1 :1 NEB buffer 3和4 (如果是反方向則得到8. 5 1Λ片斷)(見圖 4 第④步)。得到 ρ BeloBACll- I l_hDAT18 kb，簡稱 18 k。
實施例8 不同長度的力啟動區(qū)報告基因構(gòu)建18 k完整啟動區(qū)報告基因質(zhì)粒經(jīng)船el酶切，自連后，切除-833廣-13220 bp得到10 k 啟動子區(qū)報告基因質(zhì)粒，簡稱10 k。18 k完整啟動區(qū)報告基因質(zhì)粒經(jīng)酶切，自連后，切除-3477 -15596 bp得到5 k 啟動子區(qū)報告基因質(zhì)粒，簡稱5 k。所有報告基因克隆經(jīng)PCR初步鑒定后，送測序確證。
實施例9 完整力啟動區(qū)域的啟動活性研究細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)2個來源于人的多巴胺細(xì)胞系SK-N-AS，SH-SY5Y購于ATCC。培養(yǎng)條件37°C，5% C02，濕化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)液Dulbecco，s modified Eagle's medium (DMEM)添加10% (ν/ν)胎牛血清，青霉素(100 U/mL)，鏈霉素(100 U/mL)(均購于hvitrogen， Carlsbad, CA, U.S.A.)。SN4741來源于小鼠永生化胚胎黑質(zhì)演化細(xì)胞系由Michael J. Bannon ^gCffayne State University School of Medicine, Detroit, USA)貝曾;i^。 SN4741培養(yǎng)條件33°C，5% CO2，濕化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)液DMEM添加10% (ν/ν)胎牛血清，青霉素(100 U/mL)，鏈霉素(100 U/mL)及 0. 6% 葡萄糖(Sigma, St. Louis, MO, USA)。
瞬時轉(zhuǎn)染第1天，細(xì)胞傳代至M孔板，每孔0. 5 ml培養(yǎng)液。第2天，細(xì)胞至50% 70%融合。等摩爾質(zhì)粒DNA (18 k, 10 k, 5 k和空白載體 pBeloBACll- I 1),2. 4 μ 1 Superfect reagent (Qingen), 19 μ 1 DMED，溫和混合，靜置 20 min，加入150 μ 1完全培養(yǎng)液。棄細(xì)胞培養(yǎng)液，將混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)孔。同時設(shè)立Mork (不加DNA)為對照。每次實驗設(shè)置復(fù)孔。 第3天，加新鮮完全培養(yǎng)基500 μ L·第4天，轉(zhuǎn)染后48 h，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗1篇。加入IX細(xì)胞裂解液(PLS Promega) 100 “1，搖床上1 h。-20°c待測。
熒光素酶活性分析應(yīng)用熒光素酶測定試劑盒(Cat# E1500，Promega)，檢測系統(tǒng) Bio-Tek Synergy HT/KC4。報告基因活性計算(熒光素酶活性讀值-背景讀值)/蛋白量。背景為Mork的熒光讀值(背景值不高于啟動子報告基因測得值的1%)。轉(zhuǎn)染載體 pBeloBACll- I 1和背景值近似。
遠(yuǎn)端啟動區(qū)的增強(qiáng)子的確證不同長度的力啟動子活性研究18k，10 k 和5 k質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3個細(xì)胞系SK-N-AS，SN4741和SH-SY5Y，比較不同長度的力瀏/啟動子活性。熒光素酶報告顯示長啟動子18 k活性遠(yuǎn)高于短啟動子(10 k和5 k):在SK-N-AS細(xì)胞18 k啟動活性是10 k的5. 6倍，5 k的5. 5倍，在SN4741細(xì)胞18 k啟動活性是10 k的 7. 3倍，5 k的6. 8倍，在SH-SY5Y細(xì)胞18 k啟動活性是10 k的1. 8倍，5 k的2. 9倍。均達(dá)到顯著性水平，表明遠(yuǎn)端-13220 bp -8331 bp有增強(qiáng)子調(diào)控活性。
權(quán)利要求
1.一種報告基因質(zhì)粒載體，其特征在于可以穩(wěn)定克隆10 300 1Λ的DNA片段。
2.權(quán)利要求1所述的報告基因質(zhì)粒載體，其特征在于可以用于真核生物的10 300kb 的DNA片段表達(dá)調(diào)控研究。
3.權(quán)利要求1和2所述的報告基因質(zhì)粒載體，其特征在于包含2個SV40late poly (A)，合成poly (A)，報告基因，氯霉素抗性基因，多克隆位點(diǎn)和重組選擇標(biāo)記L3cZa。
4.權(quán)利要求1一 3所述的報告基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建步驟包括① 把含合成poly (A)，多克隆位點(diǎn)，報告基因，SV40 late poly (A)的片段，插入pBeloBACll載體，得到pBeloBACll-M，備用；②把SV40 late poly (A)，插入pBeloBACll-M，即得報告基因質(zhì)粒載體 pBeloBACll-MN。
5.權(quán)利要求4所述的報告基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建步驟中的合成 poly(A)，多克隆位點(diǎn)，報告基因，SV40 late poly(A)可以從市售報告基因質(zhì)粒載體獲得。
6.權(quán)利要求5所述的報告基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于市售報告基因質(zhì)粒可以是pGL3，pGL2系列螢火蟲熒光素酶報告基因質(zhì)粒，熒光蛋白系列報告基因質(zhì)粒，分泌性堿性磷酸酶系列報告基因質(zhì)粒。
7.權(quán)利要求5所述的報告基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于合成poly(A)，多克隆位點(diǎn)，報告基因，SV40 late poly (A)的獲得方法包括酶切和PCR擴(kuò)增。
8.權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟①中的合成poly(A)，多克隆位點(diǎn)，報告基因和SV40 late poly (A)的片段，插入pBeloBACll載體的位點(diǎn)在LacZa和氯霉素抗性基因之間。
9.權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟②中SV40late poly(A)片段，插入 pBeIoBACIl-M的位點(diǎn)在sopC和cos之間。
10.權(quán)利要求1-9所述的報告基因質(zhì)粒載體，其特征在于SV40late poly (A)和合成 poly (A)，可以關(guān)閉來自上游的任何轉(zhuǎn)錄活性，使質(zhì)粒載體pBeloBACll-MN報告基因的表達(dá)近似背景值。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種報告基因質(zhì)粒載體以及提供該報告基因質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明還公開了該報告基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明構(gòu)建的報告基因質(zhì)粒載體用于真核生物的10～300kb的DNA片段表達(dá)調(diào)控活性研究。
文檔編號C12Q1/68GK102517315SQ201110382300
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者朱茉莉, 李娜, 李宏彬, 李嵩箕, 楊俊 , 梁金英, 翟德勝, 袁會峰, 趙營, 馬麗娟 申請人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院