專利名稱：乙醇胺提高微藻脂含量的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物燃料領(lǐng)域，涉及乙醇胺的一種用途。
背景技術(shù)：
隨著化石燃料的不斷消耗以及對環(huán)境的破壞作用，尋求可再生能源備受世界各國關(guān)注。生物質(zhì)能源作為一種可再生能源在整個能源系統(tǒng)中占有重要的地位。微藻生物柴油是一種具有較大發(fā)展?jié)摿Φ纳镔|(zhì)能源，與動植物為原料制備的生物柴油相比，它具有易于培養(yǎng)、不占用耕地、產(chǎn)油效率高等優(yōu)點。目前微藻生物柴油在國內(nèi)外取得了很大進(jìn)展，但是仍然面臨很多挑戰(zhàn)，如生產(chǎn)成本高和脂肪酸產(chǎn)量相對較低等，因此，越來越多的人致力于研究建立高效低成本的培養(yǎng)模式以及篩選高油微藻方面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供乙醇胺提高微藻脂含量的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下乙醇胺提高微藻脂含量的用途，將乙醇胺加入到培養(yǎng)微藻的培養(yǎng)基中。所述微藻為斜生柵藻 Scenedesmus obliquus 或小球藻 Chlorella sorokiniana。所述乙醇胺在培養(yǎng)微藻的培養(yǎng)基中的濃度為0. 5mM 5mM。實驗證明，向培養(yǎng)微藻的培養(yǎng)基中加入乙醇胺時，總脂含量提高10. 2% -152%, 從脂肪酸的角度分析，加入乙醇胺后提高了油酸(18 1)的含量，因此還提高了生物柴油的質(zhì)量。充分說明了乙醇胺在利用微藻生產(chǎn)生物柴油領(lǐng)域有很大的用途。


圖1為向3份培養(yǎng)斜生柵藻的培養(yǎng)基中分別加入乙醇胺使其濃度為0. 5mM、2mM或 5mM脂含量的變化。圖2為向3份培養(yǎng)小球藻的培養(yǎng)基中分別加入乙醇胺使其濃度為0. 5mM、2mM或 5mM脂含量的變化。圖3為向培養(yǎng)斜生柵藻培養(yǎng)基中加入乙醇胺使其濃度為0. 5mM脂肪酸profile的變化情況圖4為向培養(yǎng)斜生柵藻培養(yǎng)基中加入乙醇胺使其濃度為2mM脂肪酸profile的變化情況
具體實施例方式本發(fā)明的實施例是為了使本領(lǐng)域的人員能夠理解本發(fā)明，不用于對本發(fā)明作任何限制。斜生柵藻 Scenedesmus obliquus 或小球藻 Chlorella sorokiniana 均可在中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫買到，其保藏號分別為FACHB-417和FACHB-275。
培養(yǎng)微藻的培養(yǎng)基為BGll培養(yǎng)基，具體配方如下
先配置如下母液
母液1 (IL) =NaNO3 30g ；K2HPO4 · 3H20 0. 8g ；Na2CO3 0. 4g，用蒸餾水定容至 IL
母液2(100ml)檸檬酸0. 3g;檸檬酸鐵銨0. 3g;EDTA 0. 05g，用蒸餾水定容至 IOOml
母液3 (100ml) =CaCl2 · 2H20 1. 8g，用蒸餾水定容至 IOOml
母液4 (100ml) =MgSO4 · 7H20 3. 75g，用蒸餾水定容至 IOOml
母yf 5 (100ml) =H3BO3 2. 86g ；MnCl2 ‘ 4H20 1. 81g ；ZnSO4 ‘ 7H20 0. 222g ； Na2MoO4 ‘ 2H200. 39g ；CuSO4 ·5Η20 0. 079g ；Co (NO3)2 ·6Η20 0. 04947g，用蒸餾水定容至 IOOml
配制IL的BGll培養(yǎng)基時，分別.加入母液1，2，3，4，5的體積依次為50ml，^il， 2ml, 2ml, 1ml，然后加入蒸餾水補(bǔ)齊至1L，最后調(diào)pH至7. 0-7. 5 (本發(fā)明各實施例采用的是 pH 至 7. 0)。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實施例1
向斜生柵藻kenedesmus obliquus的培養(yǎng)基中加入乙醇胺溶液，使乙醇胺的濃度為0. 5mM，包括如下的步驟
(1)將斜生柵藻kenedesmus obliquus接種到BGll培養(yǎng)基中，加入乙醇胺水溶液，使乙醇胺的濃度為0. 5mM ；(為了驗證乙醇胺提高斜生柵藻脂含量，設(shè)三個平行，另外設(shè)置三個不加乙醇胺的BGll培養(yǎng)基培養(yǎng)斜生柵藻)；
(2)培養(yǎng)至穩(wěn)定期時取樣，4000rpm離心5分鐘，將得到的細(xì)胞用蒸餾水清洗三遍后，于低溫冷凍干燥機(jī)中凍干，保存于-80°C待用。
實施例2
向斜生柵藻kenedesmus obliquus的培養(yǎng)基中加入乙醇胺溶液，使乙醇胺的濃度為2mM，柵藻脂含量提高明顯。包括如下的步驟
(1)將斜生柵藻kenedesmus obliquus接種到BGll培養(yǎng)基中，加入乙醇胺水溶液，使乙醇胺的濃度為2mM ;(為了驗證乙醇胺提高斜生柵藻脂含量，設(shè)三個平行，另外設(shè)置三個不加乙醇胺的BGll培養(yǎng)基培養(yǎng)斜生柵藻)；
(2)同實施例1 ；
實施例3
向斜生柵藻kenedesmus obliquus的培養(yǎng)基中加入乙醇胺溶液，使乙醇胺的濃度為5mM，柵藻脂含量提高近一倍。具體步驟如下
(1)將斜生柵藻kenedesmus obliquus接種到BGll培養(yǎng)基中加入乙醇胺水溶液， 使乙醇胺的濃度為5mM ；(為了驗證乙醇胺提高斜生柵藻脂含量，設(shè)三個平行，另外設(shè)置三個不加乙醇胺的BGll培養(yǎng)基培養(yǎng)斜生柵藻)；
(2)同實施例1 ；
實施例4
向另外一種綠藻——小球藻Chlorella sorokiniana的培養(yǎng)基中加入乙醇胺溶液，使乙醇胺的濃度為0. 5mM，脂含量明顯提高。具體步驟如下
(1)將小球藻Chlorella sorokiniana接種到BGll培養(yǎng)基中加入乙醇胺水溶液，使乙醇胺的濃度為0. 5mM ；(為了驗證乙醇胺提高小球藻脂含量，設(shè)三個平行，另外設(shè)置三個不加乙醇胺的BGll培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻)；(2)同實施例1 ；實施例5向小球藻Chlorella sorokiniana的培養(yǎng)基中加入乙醇胺溶液，使乙醇胺的濃度為2mM，脂含量提高了一倍多。具體步驟如下(1)將小球藻Chlorella sorokiniana接種到BGll培養(yǎng)基中加入乙醇胺水溶液， 使乙醇胺的濃度為2mM ；(為了驗證乙醇胺提高小球藻脂含量，設(shè)三個平行，另外設(shè)置三個不加乙醇胺的BGll培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻)；(2)同實施例1 ；實施例6向小球藻Chlorella sorokiniana的培養(yǎng)基中加入乙醇胺溶液，使乙醇胺的濃度為5mM，脂含量再次提高。具體步驟如下(1)將小球藻Chlorella sorokiniana接種到BGll培養(yǎng)基中加入乙醇胺水溶液， 使乙醇胺的濃度為5mM ；(為了驗證乙醇胺提高小球藻脂含量，設(shè)三個平行，另外設(shè)置三個不加乙醇胺的BGll培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻)；(2)同實施例1 ；實施例7提取細(xì)胞總脂，具體如下將實施例1至6中步驟⑵得到的凍干細(xì)胞20mg分別置于15ml的玻璃瓶中，加入2ml甲醇和Iml氯仿，在25°C下靜置M小時后，渦旋2分鐘；加入Iml氯仿，振蕩1分鐘， 然后加入1. 8ml蒸餾水，渦旋2分鐘，將溶液2000rpm，離心兩分鐘，取下層，用Whatman —號濾紙過濾至事先稱重(記為Wl)的干凈瓶中；水浴蒸發(fā)后，殘渣在104°C下進(jìn)一步干燥至恒重。稱重，記為W2?？傊?W2-W1(% dew)由圖1可以看出，實施例1中向斜生柵藻培養(yǎng)基中加入終濃度為0. 5mM的乙醇胺后，斜生柵藻總脂含量有所提高，但提高得不明顯(12. 5%至13.8% )，可能是因為加入的濃度過低；實施例2中向斜生柵藻培養(yǎng)基中加入終濃度為2mM的乙醇胺溶液后，斜生柵藻的總脂含量明顯提高(12. 5%至20. 3% )，說明此濃度的乙醇胺對脂積累有明顯的促進(jìn)作用； 實施例3中向斜生柵藻培養(yǎng)基加入終濃度為5mM的乙醇胺溶液后，斜生柵藻的總脂含量提高了一倍(12. 5%至22. 7% )，說明此濃度的乙醇胺對脂積累有更大的促進(jìn)作用。由圖2可以看出，實施例4中向小球藻培養(yǎng)基中加入終濃度為0. 5mM的乙醇胺溶液后，小球藻的總脂含量明顯提高(11. 3%至17. 7%)；實施例5中向小球藻培養(yǎng)基中加入終濃度為2mM的乙醇胺后，小球藻的總脂含量進(jìn)一步提高(11.3%至對.6%)；實施例6中向小球藻培養(yǎng)基中加入終濃度為5mM的乙醇胺后，小球藻的總脂含量再次明顯提高 (11. 3%至 26. 5% )。實施例8提取并檢測脂肪酸，分析加入乙醇胺后含量提高的脂肪酸。具體步驟如下①稱取實施例1至2中步驟⑵得到的凍干細(xì)胞IOmg加入1. 5M的KOH-CH3OH溶液anl，振蕩混勻后于85°C水浴1. 5小時，取出后加入內(nèi)標(biāo)十七烷酸10ug，充分混勻后取500 μ L進(jìn)行后續(xù)實驗；
②加入HCl-CH3OH溶液(1:1，V/V)振蕩2分鐘，使之完全反應(yīng)，離心后取上清；
③加入正己烷進(jìn)行萃取，離心后從上層吸取萃取液；
④裝瓶進(jìn)行GC-MS檢測
采用GC-MS對脂肪酸進(jìn)行定性定量，條件如下
色譜柱DB-5氣相色譜柱(30m*0. 25mm, 0. 25 μ m)；
進(jìn)樣量lyL;
分流比10 1 ；
進(jìn)樣口溫度280°C;
GC interface 溫度270°C ；
氦氣流速恒壓，9 IKPa ；
升溫程序70°C保持2min，以5°C -min"1的速度升到290°C，并在290°C保持6min ；
電離電壓70eV;
源溫250°C；
掃描范圍50-800m/z；
掃描速度2scan · s人
圖3顯示，實施例1中向斜生柵藻培養(yǎng)基中加入終濃度為0. 5mM的乙醇胺后，亞油酸(18 2)的含量明顯增加。
圖4顯示，實施例2中向斜生柵藻培養(yǎng)基中加入終濃度為2mM的乙醇胺溶液后， 十六碳二烯酸(16 2)、油酸(18 1)和亞油酸(18 2)的含量明顯增加，尤其是油酸的含量提高很多，根據(jù)文獻(xiàn)報道，生物柴油中含有油酸的量越多，生物柴油質(zhì)量越好。因此，加入乙醇胺后，利用微藻生產(chǎn)的生物柴油質(zhì)量也得到了提高。
本發(fā)明優(yōu)選斜生柵藻kenedesmus obliquus 和小球藻 Chlorella sorokiniana, 實驗證明，乙醇胺也可以提高其它微藻脂含量。
實驗證明，在培養(yǎng)微藻的其它培養(yǎng)基中加入乙醇胺，使乙醇胺在培養(yǎng)微藻的培養(yǎng)基中的濃度為0. 5mM 5mM時，也可以提高脂含量。
權(quán)利要求
1.乙醇胺提高微藻脂含量的用途，其特征在于，將乙醇胺加入到培養(yǎng)微藻的培養(yǎng)基中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述微藻為斜生柵藻^^！^如細(xì)卯obliquus 或小球藻 Chlorella sorokiniana。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述乙醇胺在培養(yǎng)微藻的培養(yǎng)基中的濃度為 0. 5mM 5mM。
全文摘要
本發(fā)明公開了乙醇胺提高微藻脂含量的用途，將乙醇胺加入到培養(yǎng)微藻的培養(yǎng)基中。實驗證明，向培養(yǎng)微藻的培養(yǎng)基中加入乙醇胺時，總脂含量提高10.2％-15.2％，從脂肪酸的角度分析，加入乙醇胺后提高了油酸(18∶1)的含量，因此還提高了生物柴油的質(zhì)量。充分說明了乙醇胺在利用微藻生產(chǎn)生物柴油領(lǐng)域有很大的用途。
文檔編號C12R1/89GK102492744SQ20111038478
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者元英進(jìn), 牛艷紅, 程景勝, 陸姝歡 申請人:天津大學(xué)