專利名稱：一種木瓜蛋白酶的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種木瓜蛋白酶的純化方法。
背景技術(shù)：
木瓜蛋白酶是存在于木瓜果實(shí)中的一種半胱氨酸蛋白酶，由212個(gè)氨基酸殘基組成，并含有3對二硫鍵。它的三維結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域所組成，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間形成一個(gè)縫隙；縫隙內(nèi)含有酶的活性位點(diǎn)，包括一個(gè)與胰凝乳蛋白酶中所含的相似的催化三聯(lián)體。木瓜蛋白酶中的催化三聯(lián)體由25位的半胱氨酸(Cys-2Q、159位的組氨酸(His_159) 和158位的天冬酰胺(Asn-158)這三個(gè)氨基酸所組成。木瓜蛋白酶的剪切肽鍵的機(jī)制包括 在His-159作用下Cys-25去質(zhì)子化，而Asn-158能夠幫助His_159的咪唑環(huán)的擺放，使得去質(zhì)子化可以發(fā)生；然后Cys-25親核攻擊肽主鏈上的羰基碳，并與之共價(jià)連接形成酰基-酶中間體；接著酶與一個(gè)水分子作用，發(fā)生去?；?，并釋放肽鏈的羰基末端。值得注意的是酶解劑應(yīng)控制其微生物限度和內(nèi)毒素，以控制生物指標(biāo)，目前國內(nèi)的木瓜蛋白酶基本為食品級，在醫(yī)藥行業(yè)使用往往需要控制其內(nèi)毒素和微生物，直接出售的木瓜蛋白酶很難符合藥用標(biāo)準(zhǔn)，所以在使用時(shí)必要的純化工藝是必須的，以往的公開的文獻(xiàn)中，木瓜蛋白酶的制備方法一般是烘干，噴霧干燥與凍干，只有簡單的純化工序，這種缺點(diǎn)是1.生產(chǎn)環(huán)境與作業(yè)方式?jīng)Q定了細(xì)菌不能被有效控制。2.菌落數(shù)超標(biāo)后采用鈷60輻照的方式進(jìn)行滅菌，但會帶來內(nèi)毒素的升高，同時(shí)酶解力會下降。3.生產(chǎn)工藝中對內(nèi)毒素不做控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提高一種木瓜蛋白酶的純化方法，以克服木瓜蛋白酶原生產(chǎn)工藝方法中的不足，本方法純化所得的木瓜蛋白酶雜質(zhì)含量少，尤其是木瓜蛋白酶中的內(nèi)毒素和細(xì)菌含量明顯減少。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種木瓜蛋白酶的純化方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將木瓜蛋白酶溶解于水中，攪拌至溶解完全后，加入活性炭和硅藻土，充分?jǐn)嚢韬?，進(jìn)行脫碳循環(huán)至木瓜蛋白酶溶液澄清；(2)使用濾芯進(jìn)行除菌過濾。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中步驟(1)中，所述水是注射用水，其用量是木瓜蛋白酶重量的25-35倍。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中步驟(1)中，所述活性炭是針用活性炭，其用量是木瓜蛋白酶重量的30-40倍。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中步驟(1)中，硅藻土的用量是木瓜蛋白酶重量的30-40 倍。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中步驟(1)中，用鈦棒進(jìn)行脫碳循環(huán)。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中步驟O)中，所述濾芯為0. 45+0. 22 μ m。本發(fā)明的純化方法將木瓜蛋白酶預(yù)溶于注射用水中，進(jìn)行活性炭吸附，硅藻土助濾后再經(jīng)濾芯進(jìn)行過濾所得的木瓜蛋白酶雜質(zhì)含量少，尤其是木瓜蛋白酶中的內(nèi)毒素和細(xì)菌含量明顯減少，酶活力高。
具體實(shí)施例方式通過下面給出的本發(fā)明的具體實(shí)施例可以進(jìn)一步清楚地了解本發(fā)明，但它們不是對本發(fā)明的限定。實(shí)施例1將3kg木瓜蛋白酶溶解于90kg注射用水中，攪拌30分鐘至溶解完全后，加入135g 針用活性炭，135g硅藻土，充分?jǐn)嚢?小時(shí)后，用單芯10 μ m鈦棒進(jìn)行脫碳循環(huán)至藥液澄清， 使用0. 45 μ m+0. 22 μ m濾芯進(jìn)行除菌過濾，過濾結(jié)束后，將木瓜蛋白酶過濾液進(jìn)行真空低溫干燥后送檢，檢驗(yàn)項(xiàng)目為細(xì)菌內(nèi)毒素，無菌，酶活力。 將實(shí)施例1重復(fù)做3次，得到三批樣品，對其進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素，無菌，酶活力的檢測結(jié)果見表1
表 1
權(quán)利要求
1.一種木瓜蛋白酶的純化方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將木瓜蛋白酶溶解于水中，攪拌至溶解完全后，加入活性炭和硅藻土，充分?jǐn)嚢韬螅?進(jìn)行脫碳循環(huán)至木瓜蛋白酶溶液澄清；(2)使用濾芯進(jìn)行除菌過濾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木瓜蛋白酶的純化方法，其特征在于，步驟(1)中，所述水是注射用水，其用量是木瓜蛋白酶重量的25-35倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木瓜蛋白酶的純化方法，其特征在于，步驟(1)中，所述活性炭是針用活性炭，其用量是木瓜蛋白酶重量的30-40倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木瓜蛋白酶的純化方法，其特征在于，步驟(1)中，硅藻土的用量是木瓜蛋白酶重量的30-40倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木瓜蛋白酶的純化方法，其特征在于，步驟(1)中，用鈦棒進(jìn)行脫碳循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木瓜蛋白酶的純化方法，其特征在于，步驟O)中，所述濾芯為 0. 45+0. 22 μ m。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種木瓜蛋白酶的純化方法，首先，將木瓜蛋白酶溶解于水中，攪拌至溶解完全后，加入活性炭和硅藻土，充分?jǐn)嚢韬?，進(jìn)行脫碳循環(huán)至藥液澄清，然后用濾芯進(jìn)行除菌過濾。本方法純化所得的木瓜酶的純度和活力較高，內(nèi)毒素和細(xì)菌含量都得到了有效的控制。
文檔編號C12N9/50GK102392009SQ20111038557
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者汪洋, 錢正祥, 馬賢鵬 申請人:上海景峰制藥有限公司