專利名稱：利用rna聚合酶突變提高環(huán)脂肽類抗生素產量的突變體及制法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物農藥技術領域，具體涉及產抗真菌環(huán)脂肽類抗生素的芽孢桿菌 CC09菌株的RNA聚合酶突變體的篩選及其應用。
背景技術：
隨著人們對生活質量要求的提高以及環(huán)境生態(tài)面臨的種種危機，農業(yè)生產面臨的最大挑戰(zhàn)就是如何在未來能夠找到環(huán)境友好型的化學農藥的替代品來抵抗農業(yè)病害，隨著各國科學家的研究發(fā)現(xiàn)，源于有益微生物的生物農藥是最有希望成為這類產品的替代品 (Marc Ongena等，Cell，2007，16 (3) :115-125)?，F(xiàn)有有關微生物農藥的研究多集中于芽孢桿菌，且已有相關產品出現(xiàn)，如美國Agraquest公司的產品krenadeTM和Sonata AS，就是來源于菌株 Bacillus subtilis QST713 和 QSI^808 (Cao CX 等，Agric. Nat. Resour，2010， SAG-18-10.)。芽孢桿菌的抗菌物質多為環(huán)脂肽類抗生素，如Iturins和Surfactin等。該類抗菌物質往往產生于微生物的穩(wěn)定生長期，產量低是制約其開發(fā)為生物農藥的主要原因。目前用于提高芽孢桿菌代謝產物中抗菌物質的方法主要有0優(yōu)化培養(yǎng)基組成， 如在玫瑰孢鏈霉菌培養(yǎng)液中添加纈氨酸可以提高達托霉素的前體物環(huán)肽A21978C2的產量，添加異亮氨酸可以提高同為前體物的環(huán)肽A21978C1和A21978C3含量，進而增加達托霉素的產量，添加亮氨酸則可以生成新的衍生物(Snijewski M J等，J Antibiot, 1986, 39(10) 1483) ；Θ前體控制發(fā)酵工藝，改變環(huán)脂肽類抗生素肽尾上的脂肪酸和特定位置的氨基酸，以提高其目的組分產率或生成新的衍生物(Boeck L D等，J Antibiot, 1990, 43(6) 607) ；Θ利用誘變處理，篩選高產環(huán)脂肽菌株(李晶等，安徽農業(yè)科學，2008，36(1) 106-111,132)。尋找更為有效的方法及高產量菌株仍是目前研究的重點。本發(fā)明核心突變體來源于芽孢桿菌CC09制成的生防菌劑(專利申請?zhí)?CN201110073773. 9)，該生防菌劑對禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、鏈格孢菌(Alternaria alternata)、/K 稻立才古絲核菌(Rhizoctonia solani)禾口辣椒疫霄 (Phytophthora capsici)等的生長有顯著的抑制活性，特別對小麥白粉病和赤霉病有顯著的防治效果。本發(fā)明以此生防菌為基礎，通過定向篩選RNA聚合酶自然突變體，獲得了環(huán)脂肽類抗生素產量提高100% 300%的突變體，為環(huán)脂肽類抗生素的產業(yè)化生產提供了一條新的途徑和生產菌株。

發(fā)明內容
本發(fā)明主要目的是提供一種利用RNA聚合酶突變提高環(huán)脂肽類抗生素產量的技術，獲得環(huán)脂肽類抗生素產量提高的芽孢桿菌CC09(專利申請?zhí)朇N201110073773. 9，該菌株已于2011年3月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 4669)的RNA聚合酶突變體，并應用于植物病害的防治。
本發(fā)明的技術方案1. CC09菌株RNA聚合酶突變體的獲得O菌種的活化將菌株CC09于LB液體培養(yǎng)基中活化，然后接種于8支含LB液體培養(yǎng)基的試管中
進一步培養(yǎng)。Θ突變菌篩選平板的制取將LB固體培養(yǎng)基加熱融化后，加入一定濃度的利福平溶液于已融化的培養(yǎng)基中， 搖勻后在無菌條件下以20-30ml的量倒于直徑為90mm的平板中。將O中8支原始菌種種子液，分別以每平板200 μ L的接種量均勻涂布于8個 法制得的平板上。37°C暗處培養(yǎng)2天后取出，所見菌落即有可能為RNA聚合酶突變體，進而通過對該突變體中rpoB基因的PCR和PCR產物的序列分析，進一步確定突變體的突變基因是否發(fā)生在編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因上。2.高產突變體及其環(huán)脂肽類抗生素含量的確定通過抑制植物病原真菌活性實驗和HPLC檢驗，確定高產突變體的抗真菌活性及所產生的環(huán)脂肽類抗生素的含量。3.高產突變體突變基因位點的確定利用細菌DNA提取試劑盒，提取個突變體的DNA，并用一系列引物進行PCR擴增，獲得完整的rpoB基因序列，經序列分析以及與野生型菌株rpoB序列的同源性比對，找出突變堿基及相應的氨基酸。4.突變體及其產生的環(huán)脂肽類抗生素對植物病原真菌的防治實驗突變體的發(fā)酵液及其無菌濾液分別進行抗植物病原真菌實驗。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比的有益效果[1]所獲得的突變體產生的環(huán)脂肽類抗生素較野生菌株顯著提高(100% 300% )，而且抗生素的產生時間提前，抗真菌活性較野生型CC09菌株提高20% 60%。[2]未經過人為誘導，所得突變體來自于野生型菌株的自然突變，突變體的生理生化特性以及遺傳性狀相對穩(wěn)定。[3]所獲得的突變體及其所產生的環(huán)脂肽類抗生素可應用于防治小麥白粉病(Erysipe graminis)、大豆炭疽病(Glomerella glycines)> 赤霉病(Fusarium graminearum), /K 禾S 紋枯病(Rizoctonia solani),交鏈孢葉斑病(Alternaria alternata) ,MM'M (Botrytis cinerea) ^^! (Phytophthora capsici)禾口￠113
(Alternaria alternata)。


圖1.野生型芽孢桿菌CC09 (WT)與其RNA聚合酶突變體對植物病原真菌交鏈孢 (Alternaria alternata)的抑制差異。圖2.野生型芽孢桿菌CC09 (WT)與其RNA聚合酶突變體生產Iturin的比較。圖3.野生型芽孢桿菌CC09 (WT)與其RNA聚合酶突變體生產surf act in的比較。
具體實施方式
1. RNA聚合酶突變體的篩選O菌種的活化將野生型芽孢桿菌CC09以的接種量接種于4mL/管的LB液體培養(yǎng)基，37°C， 120rpm活化培養(yǎng)48h，然后以相同的接種量和培養(yǎng)條件進行二次活化于8支LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h。 含利福平平板的制備將利福平溶液添加到50 60°C的LB固體培養(yǎng)基中，終濃度為50 μ g/mL,即為含利福平平板。將O中制備的二次活化種子液(8支試管)，按200 μ L/皿的量分別均勻涂布于含利福平平板上，37°C暗處培養(yǎng)2天后觀察菌落，即為可能的RNA聚合酶突變體，共篩得78株突變體。2.高產突變體及其環(huán)脂肽類抗生素含量的確定O抑制植物病原真菌活性實驗以交鏈孢為測試植物病原真菌。發(fā)酵液在12000rpm、10min離心去除細胞后，所得無菌上清液Iml與IOmL PSA培養(yǎng)基混合倒入培養(yǎng)皿(直徑9厘米)，冷卻后接種新鮮的測試真菌菌餅(直徑7mm)，菌餅倒扣于每個培養(yǎng)皿中，28 °C培養(yǎng)48小時后測量菌落直徑，計算生長抑制率。生長抑制率(％)=[(陰性對照菌斑直徑-處理板的菌斑直徑)/(陰性對照菌斑直徑-菌餅直徑)]X 100 %。結果(見圖1)顯示，突變體R03、R28、R05的抗真菌活性較野生型菌株提高20% 60%。 環(huán)脂肽類抗生素產量的HPLC檢測樣品處理定量取R03、R28、R05發(fā)酵液，離心獲得上清液后，對于Iturin A的檢測，直接用甲醇稀釋一倍即可上樣；對于surfactin的檢測，定量的上清液取于200微升離心管中，50°C烘干后加入等量的甲醇溶解，上樣檢測。Iturin A檢測條件流動相A泵5mM醋酸銨(色譜純)，B泵乙腈，A B為 55 45 ；流速1毫升/分鐘；檢測器220nm。Surfactin檢測條件流動相A泵0. 1%TFA(色譜純)，B泵乙腈，A B為1 9; 流速:1毫升/分鐘；檢測器:210nmo結果(圖2圖幻顯示，突變體R03、R28、R05生產的環(huán)脂肽類抗生素較野生型菌株提高100% 300%。3.突變體突變基因位點的確定各突變體(R03，R05, R28)發(fā)酵液離心獲得菌體，采用細菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA，根據(jù)NCBI中同源rpoB序列設計引物，所得DNA經PCR擴增。PCR反應的流程為 94°C預變性5分鐘；30個循環(huán)，其中包括94°C變性30秒，55°C退火lmin，72°C延伸Imin ； 反應結束后，于72°C下延伸7分鐘。所得PCR產物送交華大基因公司測序。與野生型菌株 rpoB基因序列比較，突變體R03，R05和R28的突變位點分別發(fā)生于編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因的145;3bp，1454bp和1469bp，其中突變體R03的485位氨基酸由野生型的組氨酸變?yōu)榘腚装彼?，R05的490位氨基酸由絲氨酸變?yōu)榱涟彼幔琑28的485位氨基酸由組氨酸變?yōu)榫彼帷?br> 4.突變體及其產生的環(huán)脂肽類抗生素對植物病原真菌的防治實驗將突變體的發(fā)酵液及其離心所得的無菌濾液(即環(huán)脂肽類抗生素溶液)分別進行抗植物病原真菌生長實驗，結果如表1所示，突變體及其所產生的環(huán)脂肽類抗生素對小麥白粉病(Erysipe graminis)、大豆炭疽病(Glomerella glycines)、赤霉病(Fusarium graminearum), /K 禾S 紋枯病(Rizoctonia solani),交鏈孢葉斑病(Alternariaal ternata)、灰霄病(Botrytis cinerea)、辣椒疫霄病(Phytophthora capsici)禾口交鏈抱果腐病(Alternaria alternata)均有良好的防治作用。表1.突變體R03對植物病原真菌的防治效果(％ )
權利要求
1.一種利用RNA聚合酶突變提高環(huán)脂肽類抗生素產量的突變體，其特征是以產環(huán)脂肽類抗生素的植物內生菌株CC09為基礎，用濃度為5(^g/ml的利福平LB平板篩選該菌的RNA 聚合酶突變體。
2.根據(jù)權利要求1所述的利用RNA聚合酶突變提高環(huán)脂肽類抗生素產量的突變體，其特征是突變體的突變位點位于編碼RNA聚合酶b亞基的rpoB基因序列中1453bp、1454bp、 1469bp的任一堿基位點，所導致的RNA聚合酶b亞基氨基酸序列中485、490的任一位置發(fā)生取代。
3.根據(jù)權利要求1所述的利用RNA聚合酶突變提高環(huán)脂肽類抗生素產量的突變體的制備方法，其特征是將野生型菌株CC09接種于pH7. 0的滅菌液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h后均勻涂布于含利福平5(^g/ml的LB固體平板，培養(yǎng)一定時間后長出的菌落，即為野生型菌株 CC09的RNA聚合酶突變體。
4.根據(jù)權利要求1所述的利用RNA聚合酶突變提高環(huán)脂肽類抗生素產量的突變體，，其特征是突變體所產生的抗生素的制備方法是將該突變體以1%的接種量接種于液體LB培養(yǎng)基，37°C, 120rpm培養(yǎng)48h，發(fā)酵生產抗真菌環(huán)脂肽類抗生素。
5.根據(jù)權利要求1中所述的利用RNA聚合酶突變提高環(huán)脂肽類抗生素產量的突變體在防治小麥白粉病、大豆炭疽病、赤霉病，水稻紋枯病、交鏈孢葉斑病、灰霉病、辣椒疫霉病和交鏈孢果腐病中的應用。
6.根據(jù)權利要求4中所述的利用RNA聚合酶突變提高環(huán)脂肽類抗生素產量的突變體所產生的抗生素在防治小麥白粉病、大豆炭疽病、赤霉病，水稻紋枯病、交鏈孢葉斑病、灰霉病、辣椒疫霉病和交鏈孢果腐病中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物農藥技術領域，具體涉及利用含利福平(50μg/ml)的LB平板篩選高產抗真菌環(huán)脂肽類物質的芽孢桿菌CC09菌株的RNA聚合酶突變體，該突變體的突變位點發(fā)生在RNA聚合酶b亞基氨基酸序列中的485和490的任一位置，突變體生產抗真菌環(huán)脂肽類抗生素Iturin和Surfactin的產量較野生型CC09菌株提高100%～300%，抗真菌活性較野生型CC09菌株提高20%～60%，可用于多種作物病害的防治。
文檔編號C12N15/01GK102492639SQ20111038641
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月29日 優(yōu)先權日2011年11月29日
發(fā)明者劉常宏, 李慧, 薛雅蓉 申請人:南京大學