專利名稱：一種特異性降低人IQGAP1基因表達(dá)的shRNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種特異性降低人IQGAPl 基因表達(dá)的shRNA及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNA干擾技術(shù)(RNAi )是指雙鏈RNA特異性地誘發(fā)與其同源序列mRNA分子被降解， 導(dǎo)致相應(yīng)基因表達(dá)抑制的現(xiàn)象。人工化學(xué)合成或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成的小的雙鏈RNA (small interfering RNA, siRNA)進(jìn)入細(xì)胞后，能和與之互補(bǔ)的靶基因mRNA結(jié)合，從而介導(dǎo)特異性的切割酶將mRNA降解，達(dá)到降低目的基因表達(dá)的目的。目前，體外化學(xué)合成的siRNA雖然可以引起靶基因表達(dá)降低，但其作用相對(duì)短暫。 為了對(duì)基因進(jìn)行長(zhǎng)效抑制，許多哺乳動(dòng)物質(zhì)粒表達(dá)載體已被作為研究工具，在細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)合成siRNA。這些載體包含依賴RNA polymerase- III TO或Hl啟動(dòng)子，有一個(gè)明確的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和一個(gè)由連續(xù)5個(gè)胸腺嘧啶組成的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(T5)。其中，一對(duì)特定的寡核苷酸來源于目標(biāo)基因mRNA的一段長(zhǎng)度為19 21個(gè)堿基的獨(dú)特序列。當(dāng)將正向和反向的DNA 寡核苷酸退火，并克隆至載體的兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間時(shí)，正向DNA寡核苷酸將正確定位于U6啟動(dòng)子的下游。重組載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即發(fā)夾型RNA(small hairpin RNA, shRNA) 可以自身折疊配對(duì)形成莖長(zhǎng)為19 21個(gè)堿基的莖環(huán)(Stem-loop)結(jié)構(gòu)，這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體在細(xì)胞內(nèi)很快被切割形成有功能的siRNA。這種載體表達(dá)的shRNA經(jīng)剪切形成的siRNA 具有表達(dá)量穩(wěn)定、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，從而可引起目標(biāo)基因表達(dá)的長(zhǎng)效抑制。IQGAPs (IQ motif containing GTPase activating proteins) ^iS^jftif^ 現(xiàn)的一個(gè)蛋白家族，在哺乳動(dòng)物中有3個(gè)同源物，即IQGAP1、IQGAP2和IQGAP3。IQGAPl于 1994年最早被發(fā)現(xiàn)[ffeissbach L, Settleman J, Kalady MF, Snijders AJ, Murthy AE, Yan YX, Bernards A. Identification of a human rasGAP-related protein containing calmodulin-binding motifs. J Biol Chem. 1994; 12; 269 (32) : 20517-21.]，它是 Rho 家族GTP酶成員Racl和cdc42的一個(gè)重要效應(yīng)因子，能與細(xì)胞骨架和黏附成分廣泛作用，通過調(diào)節(jié)分裂原激活蛋白激酶途徑，影響細(xì)胞增殖和分化，在細(xì)胞黏附和遷移的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[Brown MD, Sacks DB. IQGAPl in cellular signaling: bridging the GAP. Trends Cell Biol. 2006; 16 (5) : 242-9.]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IQGAPl 在許多月中瘤中如肺癌[Nakamura H, Fujita K, Nakagawa H, Kishi F, Takeuchi A, Aute I, Kato H. Expression pattern of the scaffold protein IQGAPl in lung cancer. Oncol Rep. 2005; 13 (3) :427-31. ][Nabeshima K, Shimao Y, Inoue T, Koono M. Immunohistochemical analysis of IQGAPl expression in human colorectal carcinomas: its overexpression in carcinomas and association with invasion fronts. Cancer Lett. 2002; 176 (1) : 101-9.]、乳腺癌[Jadeski L, Mataraza JM, Jeong HW, Li Z, Sacks DB. IQGAPl stimulates proliferation and enhances tumorigenesis of human breast epithelial cells. J Biol Chem. 2008; 283 U) : 1008-17·]、卵巢癌[Dong P， Nabeshima K， Nishimura N， Kawakami T， Hachisuga Τ， Kawarabayashi Τ， Iwasaki H. Overexpression and diffuse expression pattern of IQGAPl at invasion fronts are independent prognostic parameters in ovarian carcinomas. Cancer Lett. 2006; ^3(1):120-7.]呈現(xiàn)過表達(dá)，其過表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移之間存在著密切的相關(guān)性。發(fā)明人前期研究表明，IQGAPl在食管癌中也存在過表達(dá)。眾所周知，我國(guó)食管癌的發(fā)病率目前居世界第一位，尤其以太行山周邊的河北、河南及山西的部分地區(qū)為高發(fā)區(qū)。雖然手術(shù)切除以及術(shù)后放化療使病人生存率得到了較大提高，但總體預(yù)后仍不樂觀，導(dǎo)致病人死亡的主要原因是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，研制治療食管癌的新型藥物具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益，而采用RNA干擾技術(shù)將成為治療食管癌的有效途徑。但到目前為止，還沒有關(guān)于將IQGAPl基因作為治療食管癌靶基因的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種特異性降低人IQGAPl基因表達(dá)的shRNA及其應(yīng)用。本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種特異性降低人IQGAPl基因表達(dá)的 shRNA，其堿基序列如SEQ ID NO. 1所示，即
5’ -⑶UAUG⑶UGGAUGAAAUUCACUCGA⑶GAAUUUCAUCCAACCAUAAC-3’。該shRNA可應(yīng)用于治療食管癌的藥物中。本發(fā)明提供了一種可以特異性降低人IQGAPl基因表達(dá)的發(fā)夾型干擾RNA (IQGAPl-shRNA),如 SEQ ID NO. 1 所示，針對(duì)的靶序列為人 IQGAPl mRNA 的第 1901 1921 位，如SEQ ID N0. 2所示，該shRNA在體內(nèi)或體外可剪切形成含如SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 5所示的siRNA ；本發(fā)明還提供了編碼該shRNA的DNA寡核苷酸鏈，如SEQ ID N0. 3所示，以及包含如SEQ ID N0. 3所示的DNA寡核苷酸鏈的質(zhì)粒，利用該質(zhì)粒可以直接在體內(nèi)或者體外生成IQGAPl-shRNA。而且本發(fā)明還證明了利用含IQGAPl-shRNA干擾載體的藥物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人食管癌EC9706細(xì)胞后，細(xì)胞中IQGAPl基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，蛋白表達(dá)水平明顯降低，使食管癌細(xì)胞的侵襲能力顯著降低。總之，本發(fā)明利用RNA干擾技術(shù)，成功獲得針對(duì)人IQGAPl基因的shRNA ；以此序列為基礎(chǔ)的真核表達(dá)載體在細(xì)胞中能穩(wěn)定持續(xù)的抑制IQGAPl mRNA和蛋白表達(dá)水平，克服了體外化學(xué)合成的siRNA作用時(shí)間短暫的缺點(diǎn)；以此序列為基礎(chǔ)的真核表達(dá)載體在細(xì)胞中能有效抑制食管癌細(xì)胞的侵襲，因此，為新型抗腫瘤藥物的開發(fā)提供了新途徑。


圖1為免疫組化方法檢測(cè)IQGAPl在食管癌旁組織中的表達(dá)； 圖2為免疫組化方法檢測(cè)IQGAPl在食管癌組織中的表達(dá)；
圖3為本發(fā)明RNA干擾載體的特征圖； 圖4為轉(zhuǎn)染后普通顯微鏡下觀察EC9706細(xì)胞圖(X 100)； 圖5為轉(zhuǎn)染后熒光鏡下觀察EC9706細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)圖(X 100)； 圖6為轉(zhuǎn)染后EC9706細(xì)胞中IQGAPl mRNA表達(dá)的RT-PCR結(jié)果圖； 圖7為轉(zhuǎn)染后EC9706細(xì)胞中IQGAPl蛋白表達(dá)的^festern blot結(jié)果圖； 圖8為轉(zhuǎn)染后對(duì)照組Transwel 1侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(X 100)；
4圖9為轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組Transwel 1侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(X 100)； 圖10為轉(zhuǎn)染后Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或者按照生產(chǎn)廠商所建議的條件。實(shí)施例1
IQGAPl在食管癌及癌旁組織中的表達(dá)
組織芯片購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司。整個(gè)組織芯片共包括75例患者的食管鱗癌及配對(duì)的癌旁正常組織，共150點(diǎn)。免疫組織化學(xué)染色步驟
1)組織標(biāo)本石臘包埋切片，常規(guī)脫臘70°c烤片池，二甲苯處理2次，每次lOmin。2) 水化100%, 85%，70%乙醇各3min。3) PBS緩沖液洗2次，每次3min。4) 3% H2O2溶液室溫處理IOmin以去除內(nèi)源性過氧化物酶。5)雙蒸水洗3次，每次^iin。6)浸在0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液(PH6. 0)中92、8°C水浴中處理25min修復(fù)抗原，自然冷卻到室溫。7) PBS緩沖液洗2次，每次;3min。8)封閉液37°C 30min。9)稀釋的一抗，37°C作用1 濁或4° C過夜。10) PBS洗3次，每次;3min。11)加生物素標(biāo)記的二抗IgG，37°C孵育30min。12) PBS 沖洗3次，每次;3min。13)加HRP(辣根酶過氧化物酶)標(biāo)記的鏈霉卵白素37°C作用30min。 14) PBS沖洗，3次，每次!3min。15)配DAB :1ml水中依次滴加A、B、C液各一滴。滴加DAB (二甲基聯(lián)苯胺)溶液顯色，自來水沖洗。16)蘇木素復(fù)染，立刻水沖。17)梯度乙醇脫水。 18)樹脂封片將一滴樹脂滴在石蠟片上，蓋上蓋玻片。免疫組織化學(xué)評(píng)分
IQGAPl各種組織中的胞漿染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如文獻(xiàn)所述。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分 (a) 0，組織中的上皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性染色數(shù)< 5%;(b) 1，組織中的上皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性染色數(shù)為沈-50%; (c) 3，組織中上皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)為51-75% ； (d) 4，組織中的上皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)>75%。染色強(qiáng)度的分級(jí)按以下標(biāo)準(zhǔn) (a) 0，染色陰性；(b) 1+，弱陽(yáng)性；(c) 2+，中等程度陽(yáng)性；(d)彡3+，強(qiáng)陽(yáng)性。對(duì)每一個(gè)組織點(diǎn)來說，以不同拷貝的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分與染色程度的乘積之平均值為最終評(píng)分，最終評(píng)分范圍為(Γ12分。我們將最終評(píng)分彡8 彡12定義為強(qiáng)表達(dá)，彡4 <8為中等表達(dá)，彡O <4為弱表達(dá)。結(jié)果顯示，在正常食管鱗狀上皮細(xì)胞中，IQGAPl蛋白低水平表達(dá)于膜或不表達(dá)(圖 1)，而在食管鱗癌細(xì)胞中，IQGAPl蛋白主要表達(dá)于胞漿，且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及染色強(qiáng)度均明顯增高(圖2)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異具有顯著性。實(shí)施例2:
可降低人IQGAPl基因表達(dá)的shRNA的設(shè)計(jì)
根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中人IQGAPl基因(GeneBank編號(hào)NM003870)的mRNA堿基序列， 借助siDirect公司在hternet上提供的siRNA工具軟件(siDirect version 2. 0)選擇靶點(diǎn)序列，靶點(diǎn)序列為人IQGAPl mRNA的第1901 1921位，如SEQ ID NO. 2所示，即 5’ -⑶UAUG⑶UGGAUGAAAUUCA-3’，根據(jù)靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)的相應(yīng)shRNA序列為
SEQ ID NO. 1 :5’ -⑶UAUG⑶UGGAUGAAAUUCACUCGA⑶GAAUUUCAUCCAACCAUAAC-3， 編碼shRNA的DNA序列為
SEQ ID NO. 3 :5’ -GTTATGGTTGGATGAAATTCACTCGAGTGAATTTCATCCAACCATAAC-3’ 該shRNA序列在體內(nèi)或體外可剪切形成含如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示的siRNA 正義鏈和反義鏈
SEQ ID NO. 4 正義鏈為 5，-⑶UAUG⑶UGGAUGAAAUUCA-3，， SEQ ID NO. 5 反義鏈為 5，-UGAAUUUCAUCCAACCAUAAC-3，。實(shí)施例3:
可降低人IQGAPl基因表達(dá)的shRNA干擾載體的構(gòu)建
根據(jù)以上序列，由上海吉?jiǎng)P有限公司通過化學(xué)合成法合成SEQ ID N0:3所示的DNA， 并在兩端加上BamH I和Hind III的酶切位點(diǎn)。將DNA寡核苷酸溶解在滅菌、無(wú)核酸酶的水中，終濃度為:3mg/mL。退火反應(yīng)是將各ImL的正向和反向DNA寡核苷酸與48ml的退火緩沖液(IOmM Tris, pH 7. 5-8. 0，5OmM NaCl, ImM EDTA)混合，在 90°C溫育 4min，70°C溫育 lOmin，慢慢冷卻退火的寡核苷酸至10°C。將退火產(chǎn)物與空的GV102質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P有限公司提供)進(jìn)行雙酶切，采用DNA純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物，各取2PL用T4 DNA連接酶連接。 將重組的GV102載體轉(zhuǎn)化含有氨芐青霉素的瓊脂糖平板，挑取陽(yáng)性克隆，通過測(cè)序來確定重組質(zhì)粒中是否插入正確的序列。質(zhì)粒特征如圖3所示，其中shDNA代表編碼本發(fā)明序列shRNA (SEQ ID NO. 1)的 DNA序列(SEQ ID N0. 3)。測(cè)序證實(shí)插入序列完全正確。實(shí)施例4
含人IQGAPl-shRNA干擾載體藥物的制備
將質(zhì)粒稀釋于500μ 無(wú)培養(yǎng)基中，輕輕混勻。取Lipofectamine 2 000 (脂質(zhì)體介導(dǎo)法)8μ 稀釋于500μ 無(wú)血清培養(yǎng)基，混勻，室溫孵育5min。將稀釋的脂質(zhì)體與稀釋的質(zhì)粒DNA混合，室溫孵育20min。實(shí)施例5:
利用含人IQGAPl-shRNA干擾載體的藥物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人食管癌EC9706細(xì)胞取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到 70%左右。將實(shí)施例3所制備的藥物加入培養(yǎng)皿內(nèi)，加無(wú)血清培養(yǎng)基至2mL，輕輕混勻。6h 后補(bǔ)加含20%的RPMI 1640培養(yǎng)基2mL，24h后，棄去原培養(yǎng)基，換含10%的RPMI 1640培養(yǎng)基。4 后收集細(xì)胞進(jìn)行鑒定。實(shí)施例6
轉(zhuǎn)染后顯微鏡下觀察EC9706細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)
載體上帶有GFP基因，表達(dá)綠色熒光蛋白，利于觀察含重組載體的藥物的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，綠色熒光逐漸增多增強(qiáng)。同一視野白光(圖4)和熒光鏡下(圖 5)對(duì)比觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)，經(jīng)計(jì)算得出在4 時(shí)，含人IQGAPl-shRNA干擾載體的藥物的轉(zhuǎn)染效率約為65-70%。實(shí)施例7
轉(zhuǎn)染后半定量RT-PCR法檢測(cè)對(duì)IQGAPl mRNA表達(dá)的干擾作用轉(zhuǎn)染 48h 后，用 Trizol 試劑抽提細(xì)胞總 RNA，取 RNA 7. 5μδ, random hexamers (500μδ/πι 2μ , IOmM dNTP mix 1 μ 1，力口 DEPC 水至 ΙΟμ ，混勻后 65 °C 作用 5min ； 置于冰上 3-5min，加入 IOXRT buffer 2μ 1,25 mmol/L MgCl2 4μ 1,0. lmol/L DTT 2μ 1，混勻后25°C作用2min ；在每管中加Superscriptll 逆轉(zhuǎn)錄酶1μ 1，混勻，依次25°C作用10min，42°C作用90min，70 °C作用15min，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增IQGAPl基因，上游引物為5，-ACCGTGGACCCAAAGAAC-3’ ；下游引物為5，-CTTCCCGTAGAACTTTTTGTTG-3，。以看家基因GAPDH為內(nèi)參照，上游引物為 5，-GCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3，；下游5，-GCCAGGGGTGCTAAGCAGTT-3，。引物由大連寶生物公司合成。PCR反應(yīng)體系如下__
組分I體積(IiL) _
IOXPCRBuffer_Z5_
MgCl21
dNTP(5mmol/L)_2_
TaqDNA 聚合酶0. 25
cDNA模板1
目的基因上/下游引物(lOmnol/L) ~2
GAPDH 引物_1_
@子水15. 25
總體積|25
反應(yīng)條件為94°C 30 s，58°C 30 s，72°C 30 s，共30個(gè)循環(huán)。結(jié)果顯示，與陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，含人IQGAPl-shRNA干擾載體的藥物處理細(xì)胞中IQGAPl基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯降低(見圖6)。實(shí)施例8
轉(zhuǎn)染后Wfestern blot法檢測(cè)對(duì)IQGAPl蛋白表達(dá)的干擾作用
轉(zhuǎn)染4 后收集細(xì)胞，取50 μ g細(xì)胞總蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，以鼠抗IQGAPl單抗(1:5000稀釋)為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，經(jīng)孵育洗膜后ECL顯影，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IQGAPl蛋白的表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參照。結(jié)果顯示，與陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，含人IQGAPl-shRNA干擾載體的藥物處理細(xì)胞中IQGAPl蛋白的表達(dá)水平明顯降低(見圖7)。實(shí)施例9
轉(zhuǎn)染后Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響
稀釋Matrigel至25(^g/mL，將8Mm孔聚碳酯膜雙面經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)Matrigel包被各 30min，取出風(fēng)干備用。將30μ RPMI 1640培養(yǎng)基加在Boyden小室下室，Matrigel包被好的SMffl孔聚碳酯膜鋪于下室上面，再加一層橡膠墊，并安裝好Boyden小室上槽。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞消化，將50μ 2 X IO4個(gè)細(xì)胞種植于每個(gè)Boyden小室下室，于37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后小心取下膜，刮去上層未發(fā)生遷移的細(xì)胞。以75%的甲醇固定膜上的細(xì)胞15min。以0.5%結(jié)晶紫(甲醇配制)染色20min后，蒸餾水清洗。在顯微鏡下計(jì)數(shù)聚碳酯膜下表面的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，同時(shí)拍照。結(jié)果顯示，含人IQGAPl-shRNA干擾載體的藥物處理細(xì)胞穿過膜的細(xì)胞數(shù)為346士66. 53(圖9)，對(duì)照組穿過膜的細(xì)胞數(shù)為890士90. 05 (圖8)。結(jié)果表明，與對(duì)照細(xì)胞相比，含人IQGAPl-shRNA干擾載體的藥物處理細(xì)胞的體外侵襲能力明顯減弱，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異具有顯著性(見圖10)。
權(quán)利要求
1.一種特異性降低人IQGAPl基因表達(dá)的shRNA，其特征在于，其堿基序列如SEQ ID NO. 1所示，即5’ -⑶UAUG⑶UGGAUGAAAUUCACUCGA⑶GAAUUUCAUCCAACCAUAAC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性降低人IQGAPl基因表達(dá)的shRNA，其特征在于其針對(duì)的靶序列為人IQGAPl mRNA的第1901 1921位，如SEQ ID NO. 2所示，艮P5’ -⑶UAUG⑶UGGAUGAAAUUCA-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性降低人IQGAPl基因表達(dá)的shRNA，其特征在于該 shRNA通過如SEQ ID NO. 3所示的DNA寡核苷酸鏈轉(zhuǎn)錄生成，即5’ -GTTATGGTTGGATGAAATTCACTCGAGTGAATTTCATCCAACCATAAC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性降低人IQGAPl基因表達(dá)的shRNA，其特征在于該 shRNA通過包含如SEQ ID NO. 3所示的DNA寡核苷酸鏈的質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄生成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性降低人IQGAPl基因表達(dá)的shRNA，其特征在于該 shRNA可剪切形成含如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示的siRNA正義鏈和反義鏈，即SEQ ID NO. 4 正義鏈為 5，-⑶UAUG⑶UGGAUGAAAUUCA-3，，SEQ ID NO. 5 反義鏈為 5，-UGAAUUUCAUCCAACCAUAAC-3，。
6.一種如權(quán)利要求1所述的特異性降低人IQGAPl基因表達(dá)的shRNA在治療食管癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體為一種特異性降低人IQGAP1基因表達(dá)的shRNA及其應(yīng)用，本發(fā)明提供了一種特異性降低人IQGAP1基因表達(dá)的發(fā)夾型干擾RNA，如SEQIDNO.1所示，針對(duì)的靶序列為人IQGAP1mRNA的第1901～1921位，如SEQIDNO.2所示，該shRNA在體內(nèi)或體外可剪切形成含如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的siRNA；本發(fā)明還提供了編碼該shRNA的DNA寡核苷酸鏈，如SEQIDNO.3所示，以及包含如SEQIDNO.3所示的DNA寡核苷酸鏈的質(zhì)粒。而且本發(fā)明還證明了利用含IQGAP1-shRNA干擾載體的藥物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人食管癌EC9706細(xì)胞后，細(xì)胞中IQGAP1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，蛋白表達(dá)水平明顯降低，使食管癌細(xì)胞的侵襲能力顯著降低，克服了體外化學(xué)合成的siRNA作用時(shí)間短暫的缺點(diǎn)，為新型抗腫瘤藥物的開發(fā)提供了新途徑。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102517283SQ20111038888
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者牛勃, 王曉霞, 程牛亮, 解軍, 路娜, 陳顯久 申請(qǐng)人:山西醫(yī)科大學(xué)