專利名稱：一種dha產(chǎn)生菌雙鞭甲藻的誘變篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DHA產(chǎn)生菌雙鞭甲藻的誘變篩選方法。
背景技術(shù)：
DHA (二十二碳六烯酸)是一種具有特殊結(jié)構(gòu)(非共軛體系的6個順式構(gòu)型雙鍵) 的多烯脂肪酸，根據(jù)其甲基端最后一個雙鍵的位置它屬于ω-3系列的典型長鏈高度不飽和脂肪酸。人體內(nèi)的DHA主要分布于大腦灰質(zhì)、視網(wǎng)膜細(xì)胞外節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)、母乳、心肌、嗜酸性白細(xì)胞、精子等處，其生理作用有抑制血小板凝集；降低血液中中性脂質(zhì)；降低極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白的膽固醇及升高高密度脂蛋白膽固醇；降低血液粘度；補腦健腦，預(yù)防老年性癡呆癥；提高視力，防治近視；通過對DNA聚合酶和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的抑制效應(yīng)達(dá)到預(yù)防癌癥效果等。傳統(tǒng)從魚油提取的DHA，數(shù)量有限，難以滿足不斷增長的市場需求。因此，DHA生產(chǎn)研究逐漸向利用生物技術(shù)合成方向發(fā)展。利用生物技術(shù)合成DHA具有周期短，脂肪酸構(gòu)成簡單及有較大的生產(chǎn)潛力等優(yōu)點，而且不受原料的限制，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的DHA沒有從魚油中提取的DHA的魚腥味，更有利于DHA的應(yīng)用。常用的微生物包括破囊壺菌、裂殖壺菌和海洋微藻等。與其它微生物相比，海洋微藻是最為理想的DHA來源，培養(yǎng)藻類生產(chǎn)DHA的產(chǎn)率比利用真菌和細(xì)菌培養(yǎng)高出廣2個數(shù)量級。海洋微藻所含有的獨特的生理活性物質(zhì)使得它們具有多種藥用價值和保健功能， 利用海洋微藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸尤其是DHA的研究，已成為各國科研人員研究開發(fā)的熱點。Wi^iQCrypthecodiniuin. cohnii ATCC30556)的 DHA含量達(dá) 30% 以上，它高生物量、高生長速率、高DHA含量、異養(yǎng)培養(yǎng)生長良好，且不含有EPA (二十碳五烯酸)，是DHA的較好產(chǎn)生菌之一。目前公開的利用海洋微藻生產(chǎn)DHA的專利中，DHA油脂的產(chǎn)量均不高，原因與所用菌種及采用的發(fā)酵培養(yǎng)工藝有關(guān)。因此，如何選育出更優(yōu)良的雙鞭甲藻品系和優(yōu)化該菌的培養(yǎng)工藝，以提高市場競爭力成為科研工作者研究的課題之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是要提供一種DHA產(chǎn)生菌雙鞭甲藻的誘變篩選方法，它摒棄現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，采用原生質(zhì)體誘變技術(shù)，并結(jié)合代謝調(diào)控發(fā)酵育種的基本思路，定向選育出 DHA含量較高的雙鞭甲藻菌株，并對該菌株的培養(yǎng)工藝進(jìn)一步優(yōu)化，獲得高產(chǎn)量的正變株。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，所述一種DHA產(chǎn)生菌雙鞭甲藻的誘變篩選方法，其步驟如下
(1)種子的培養(yǎng)
將雙鞭甲藻皿coA/ iiATCC30556)接種于種子培養(yǎng)基中，接種量體積百分比為5 10%，培養(yǎng)溫度為洸 30°C，搖床轉(zhuǎn)速16(T200r/min，培養(yǎng)24 48h至對數(shù)期；
(2)種子液的預(yù)處理
取步驟1培養(yǎng)至對數(shù)期的細(xì)胞，4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 10min，0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌2 3次，稀釋4(Γ80倍后，經(jīng)無菌玻璃珠打散，6層無菌紗布過濾得單細(xì)胞懸浮液；
(3)原生質(zhì)體的制備及紫外誘變處理
將適量的原生質(zhì)體化反應(yīng)液，即步驟2單細(xì)胞懸浮液、酶液及滲透壓調(diào)節(jié)劑按1 廣4 20^35比例組成的混合液，在25 30°C條件下處理2(T30 min ；酶解液過濾，離心分離，洗滌并稀釋至IO6個/mL，得原生質(zhì)體純化液；
該原生質(zhì)體純化液先以0. 8% LiCl進(jìn)行預(yù)處理，然后置于有磁力攪拌棒的無菌培養(yǎng)皿中，菌液厚度不超過2mm，加蓋，開紫外燈預(yù)熱20min，在15W 30W紫外燈下，距離30cm處的磁力攪拌器上，放置培養(yǎng)皿，緩慢攪拌，打開皿蓋進(jìn)行紫外照射5 30 min，取出培養(yǎng)皿，梯度稀釋，整個過程在紅光下操作；26 30°C培養(yǎng)壙7d ；
(4)硫酸二乙酯誘變處理
取步驟3得到的原生質(zhì)體純化液加體積百分?jǐn)?shù)為10%的硫酸二乙酯，于16(T200r/min 振蕩混合處理5 lOmin，加入ImL 25%的硫代硫酸鈉終止反應(yīng)；將反應(yīng)液稀釋500 1000倍并于添加了氧化還原劑紅四氮唑(TTC)的固體培養(yǎng)基上，26 30°C培養(yǎng)壙7d ；
(5)耐丙二酸和高糖菌株的篩選
挑選TTC活性最強，即生長速度較快，染色較深、較大的菌落作為初篩獲得的菌株，這些菌株DHA的積累量相對較多，將這些正變株重新活化后，制備單細(xì)胞懸液，并分別涂布于含0. 05%丙二酸平板和/或高糖平板培養(yǎng)基上^ 30°C培養(yǎng)4 7d ；
(6)搖瓶復(fù)篩
將上述抗性平板上生長較快、較大的菌落接種于種子培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，26 30°C培養(yǎng);T5d;測定發(fā)酵液中菌體的脂肪酸含量和 DHA含量，并以此作為篩選指標(biāo)，獲得較高產(chǎn)量的正變株。本發(fā)明步驟1中所述種子培養(yǎng)基組成葡萄糖40 80 g/L, NaCl 15 25g/L， MgSO4. 7H20 4 8 g/L，KH2PO4 0. 5 1. O g/L，KNO3 1 5 g/L，酵母粉 2 8 g/L, (NH4)2SO4 0. 2 0. 5 g/L, NaHCO3 0. 08 0. 12 g/L, MnSO4 0. 5 1. O μ g/L,維生素 B1 0. θΓθ. 04mg/L,維生素 0. ΟΟΓΟ. 006mg/L，初始 pH6. 0 7. 0。本發(fā)明步驟4所述固體培養(yǎng)基組成葡萄糖40 100 g/L, NaCl 15 25g/L， MgSO4. 7H20 4 8 g/L，KH2PO4 0. 5 1. 0 g/L，KNO3 1 5 g/L，酵母粉 2 8 g/L, (NH4)2SO4 0. 2 0. 5 g/L, NaHCO3 0. 08 0. 12 g/L, MnSO4 0. 5 1. O μ g/L,維生素 B1 0. θΓθ. 04mg/L,維生素 B6 0. ΟΟΓΟ. 01mg/L，瓊脂粉 20 g/L，初始 ρΗ6· 0 7· 0。本發(fā)明步驟5所述高糖平板培養(yǎng)基組成NaCl l(T30g/L，MgSO4. 7Η20 5 10 g/L, KH2PO4 0. 2 0· 8 g/L, (NH4)2SO4 0. 2 1· O g/L, NaHCO3 0. Γθ. 5 g/L，維生素 B1 0. θΓθ. lmg/ L，維生素B6 0. ΟΟΓΟ. 01mg/L,KN03 0· 5 1· 5 g/L，葡萄糖 200 350 g/L，酵母粉 Γ5 g/L，瓊脂粉20 g/L。本發(fā)明步驟6所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖4(T100 g/L, NaCl 15 25g/L， MgSO4. 7H20 4 8 g/L，酵母粉 2 8 g/L，KNO3 1 5 g/L，KH2PO4 0. 5 1. O g/L, (NH4)2SO4 0. 2 0. 5 g/L, CaCO3 8 10 g/L, NaHCO3 0. 08 0. 12 g/L, MnSO4 0. 5 1. O μ g/L，維生素 B1 0. θΓθ. 04mg/L，維生素 0. ΟΟΓΟ. Olmg/L，初始 pH6. 0 7. O。本發(fā)明的有益效果是，通過制備DHA產(chǎn)生菌雙鞭甲KCrypthecodinium. coA/7iiATCC30556)的原生質(zhì)體，并對其進(jìn)行紫外+LiCl、硫酸二乙酯的單一或復(fù)合誘變，同時結(jié)合代謝調(diào)控發(fā)酵育種的基本思路，采用含丙二酸和/或高糖的抗性平板進(jìn)行定向篩選，并以紅四氮唑(TTC)的固體培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，有效提高篩選效率，減少篩選環(huán)節(jié)和工作量。初篩獲得的菌株經(jīng)搖瓶復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性驗證，發(fā)現(xiàn)誘變后菌株生長活性提高，與出發(fā)菌株相比，YVD-4誘變株的DHA生物合成量提高了 4. 7倍，達(dá)到45. 3 g/L，具備優(yōu)異的工業(yè)化生產(chǎn)前景。
具體實施例方式本發(fā)明所述一種DHA產(chǎn)生菌雙鞭甲藻的誘變篩選方法，其步驟如下 1、種子的培養(yǎng)和種子液的預(yù)處理
將雙鞭甲藻皿coA/ iiATCC30556)接種于種子培養(yǎng)基中，接種量體積百分比為10%，培養(yǎng)溫度為^°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)3 至對數(shù)期。取2. 5 mL上述培養(yǎng)至對數(shù)期的細(xì)胞，4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌3次，并稀釋50倍后，經(jīng)無菌玻璃珠打散，6層無菌紗布過濾得單細(xì)胞懸浮液。2、原生質(zhì)體的制備及紫外誘變處理
原生質(zhì)體化反應(yīng)液為5 mL，其中包括0.2 mL的單細(xì)胞懸浮液、0. 2 mL蝸牛酶酶液及 4.6 mL的滲透壓調(diào)節(jié)劑。在25°C條件下處理30 min。酶解液過濾，離心分離，洗滌并稀釋至IO6個/mL，得原生質(zhì)體純化液。該純化液先以0. 8% LiCl進(jìn)行預(yù)處理，然后置于有磁力攪拌棒的無菌培養(yǎng)皿中，菌液厚度不超過2mm，加蓋，開紫外燈預(yù)熱20min，在15W紫外燈下，距離30cm處的磁力攪拌器上，放置培養(yǎng)皿，緩慢攪拌，打開皿蓋進(jìn)行紫外照射5、10、15、20、25 min，取出培養(yǎng)皿，梯度稀釋，整個過程在紅光下操作。^TC培養(yǎng)6d。得到15株待篩選菌株。3、硫酸二乙酯誘變處理
取5mL得到的原生質(zhì)體純化液加體積百分?jǐn)?shù)為10%的硫酸二乙酯，于180r/min振蕩混合處理8min，加入ImL 25%的硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。將反應(yīng)液稀釋1000倍，以確保誘變反應(yīng)完全終止，然后再依次梯度稀釋，并于添加了氧化還原劑紅四氮唑(TTC)的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d。得到15株待篩選菌株。4、原生質(zhì)體的紫外、硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理
在紅光下取5mL紫外處理過的原生質(zhì)體純化液加體積分?jǐn)?shù)為10%的硫酸二乙酯，于 160r/min振蕩混合處理5min，加入ImL 25%的硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。將反應(yīng)液稀釋1000 倍，以確保誘變反應(yīng)完全終止，然后再依次梯度稀釋并涂布于添加了紅四氮唑(TTC)的固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)4d。得到63株待篩選菌株。5、平板初篩及搖瓶復(fù)篩
(1)將步驟2得到的菌株，紅光條件下梯度稀釋，涂布在添加了 1.5% TTC的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3d后，挑取35株長勢較好、TTC染色較深、較大的菌株以待復(fù)篩。(2)將通過初篩的35株菌株轉(zhuǎn)至添加了 0. 05%丙二酸和/或20% 35%葡萄糖的高糖平板上^TC培養(yǎng)4d。觀察平板，挑選20株生長速度較快、菌落較大的菌株，分別接種至種子培養(yǎng)液中，備用。(3)將抗性平板篩選獲得的菌株分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，26°C發(fā)酵培養(yǎng)3d至糖耗為0，分別測定細(xì)胞干重、脂肪酸含量及DHA含量，通過各指標(biāo)的比較分析，獲得4株DHA 產(chǎn)量較高的菌株，分別命名為YV-1、YV-2、YV-3、YV-4。按照(1) (3)的處理步驟處理步驟3、步驟4得到的菌株，分別各獲得5株DHA 產(chǎn)量較高的菌株，各自分別命名為YD-I、YD-2、YD-3、YD_4、YD-5和YVD-I、YVD-2、YVD-3、 YVD-4、YVD-5。6、搖瓶發(fā)酵
對篩選獲得的14株DHA產(chǎn)量較高的菌株分別進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性考察，經(jīng)10代連續(xù)培養(yǎng)， 菌株的生物量、油脂含量和DHA含量三個指標(biāo)沒有發(fā)生明顯的變化，均顯示較穩(wěn)定的發(fā)酵性能。從中選取兩株產(chǎn)量較高的YD-I和YVD-4接種到種子培養(yǎng)液中，26°C，200r/min培養(yǎng) 36h。培養(yǎng)到期的種子液以10%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，26°C，200r/min繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng) 72h。同時做原始菌株的對照試驗。發(fā)酵結(jié)果如表1 : 表1 DHA高產(chǎn)突變株與出發(fā)菌株的對比
權(quán)利要求
1.一種DHA產(chǎn)生菌雙鞭甲藻的誘變篩選方法，其步驟如下(1)種子的培養(yǎng)將雙鞭甲藻皿coA/ iiATCC30556)接種于種子培養(yǎng)基中，接種量體積百分比為5 10%，培養(yǎng)溫度為洸 30°C，搖床轉(zhuǎn)速16(T200r/min，培養(yǎng)24 48h至對數(shù)期；(2)種子液的預(yù)處理取步驟1培養(yǎng)至對數(shù)期的細(xì)胞，4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 10min，0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌2 3次，稀釋4(Γ80倍后，經(jīng)無菌玻璃珠打散，6層無菌紗布過濾得單細(xì)胞懸浮液；(3)原生質(zhì)體的制備及紫外誘變處理將適量的原生質(zhì)體化反應(yīng)液，即步驟2單細(xì)胞懸浮液、酶液及滲透壓調(diào)節(jié)劑按1 廣4 20^35比例組成的混合液，在25 30°C條件下處理2(T30 min ；酶解液過濾，離心分離，洗滌并稀釋至IO6個/mL，得原生質(zhì)體純化液；該原生質(zhì)體純化液先以0. 8% LiCl進(jìn)行預(yù)處理，然后置于有磁力攪拌棒的無菌培養(yǎng)皿中，菌液厚度不超過2mm，加蓋，開紫外燈預(yù)熱20min，在15W 30W紫外燈下，距離30cm處的磁力攪拌器上，放置培養(yǎng)皿，緩慢攪拌，打開皿蓋進(jìn)行紫外照射5 30 min，取出培養(yǎng)皿，梯度稀釋，整個過程在紅光下操作；26 30°C培養(yǎng)壙7d ；(4)硫酸二乙酯誘變處理取步驟3得到的原生質(zhì)體純化液加體積百分?jǐn)?shù)為10%的硫酸二乙酯，于16(T200r/min 振蕩混合處理5 lOmin，加入ImL 25%的硫代硫酸鈉終止反應(yīng)；將反應(yīng)液稀釋500 1000倍并于添加了氧化還原劑紅四氮唑(TTC)的固體培養(yǎng)基上，26 30°C培養(yǎng)壙7d ；(5)耐丙二酸和高糖菌株的篩選挑選TTC活性最強，即生長速度較快，染色較深、較大的菌落作為初篩獲得的菌株，這些菌株DHA的積累量相對較多，將這些正變株重新活化后，制備單細(xì)胞懸液，并分別涂布于含0. 05%丙二酸平板和/或高糖平板培養(yǎng)基上^ 30°C培養(yǎng)4 7d ；(6)搖瓶復(fù)篩將上述抗性平板上生長較快、較大的菌落接種于種子培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，26 30°C培養(yǎng)3 5d ；測定發(fā)酵液中菌體的脂肪酸含量和 DHA含量，并以此作為篩選指標(biāo)，獲得較高產(chǎn)量的正變株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種DHA產(chǎn)生菌雙鞭甲藻的誘變篩選方法，其特征是步驟1 中所述種子培養(yǎng)基組成葡萄糖40 80 g/L，NaCl 15 25g/L，MgSO4. 7H20 4 8 g/L, KH2PO4 0· 5 1· O g/L，KNO3 Γ5 g/L，酵母粉 2 8 g/L, (NH4)2SO4 0. 2 0. 5 g/L, NaHCO3 0. 08^0. 12 g/L, MnSO4 0. 5 1· O μ g/L,維生素 B1 0. θΓθ. 04mg/L,維生素 B6 0. ΟΟΓΟ. 006mg/L，初始 ρΗ6· 0 7· 0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種DHA產(chǎn)生菌雙鞭甲藻的誘變篩選方法，其特征是步驟4 所述固體培養(yǎng)基組成葡萄糖40 100 g/L, NaCl 15 25g/L，MgSO4. 7H20 4 8 g/L，KH2PO4 0.5 1.0 g/L，KNO3 Γ5 g/L，酵母粉 2 8 g/L, (NH4)2SO4 0. 2 0. 5 g/L, NaHCO3 0. 08^0. 12 g/L,MnSO4 0. 5 1· 0 μ g/L，維生素B1 0. θΓθ. (Mmg/L，維生素B6 0. 00Γ0. 01mg/L，瓊脂粉 20 g/L，初始 ρΗ6. 0 7.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種DHA產(chǎn)生菌雙鞭甲藻的誘變篩選方法，其特征是步驟5所述高糖平板培養(yǎng)基組成=NaCl l(T30g/L，MgSO4. 7H20 5 10 g/L, KH2PO4.0. 2 0. 8 g/L, (NH4)2SO4 0. 2 1. 0 g/L, NaHCO3 0. Γθ. 5 g/L，維生素 B1 0. θΓθ. lmg/L，維生素 B6 0. ΟΟΓΟ. Olmg/L, KNO3 0· 5 1· 5 g/L，葡萄糖 200 350 g/L，酵母粉廣5 g/L，瓊脂粉 20 g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種DHA產(chǎn)生菌雙鞭甲藻的誘變篩選方法，其特征是步驟6所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖40 100 g/L, NaCl 15 25g/L，MgSO4. 7H20 4 8 g/L，酵母粉2 8 g/L, KNO3 Γ5 g/L, KH2PO4 0. 5 1· O g/L, (NH4)2SO4 0. 2 0· 5 g/L, CaCO3 8 10 g/L, NaHCO3 0. 08 0· 12 g/L,MnSO4 0. 5 1· O μ g/L，維生素B1 0. θΓθ. (Mmg/L，維生素B6 0. ΟΟΓΟ. Olmg/ L，初始 ρΗ6. (Γ7. O。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種DHA產(chǎn)生菌雙鞭甲藻的誘變篩選方法，通過制備DHA產(chǎn)生菌雙鞭甲藻(Crypthecodinium.cohniiATCC30556)的原生質(zhì)體，并對其進(jìn)行紫外+LiCl、硫酸二乙酯的單一或復(fù)合誘變，同時結(jié)合代謝調(diào)控發(fā)酵育種的基本思路，采用含丙二酸和/或高糖的抗性平板進(jìn)行定向篩選，并以紅四氮唑(TTC)的固體培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，有效提高篩選效率，減少篩選環(huán)節(jié)和工作量。初篩獲得的菌株經(jīng)搖瓶復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性驗證，發(fā)現(xiàn)誘變后菌株生長活性提高，與出發(fā)菌株相比，YVD-4誘變株的DHA生物合成量提高了4.7倍，達(dá)到45.3g/L，具備優(yōu)異的工業(yè)化生產(chǎn)前景。
文檔編號C12N15/01GK102391955SQ20111038938
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者吳美瓊, 林超, 陳俊煌, 陳金卿 申請人:廈門金達(dá)威集團(tuán)股份有限公司