專利名稱：一種防止拜氏梭菌菌株退化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種防止拜氏梭菌菌株退化的方法，尤其是一種拜氏梭菌人工退化菌株模型及一種防止菌株退化的方法。
背景技術(shù)：
在分解糖產(chǎn)酸的梭狀芽孢桿菌屬種，有一些種類的細(xì)菌可以在一定條件下在生長后期產(chǎn)中性溶劑(丙酮acetone、丁醇butanol、乙醇ethanol，常被稱為ABE)。 1861年巴斯德首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可以產(chǎn)生丁醇，1912年^ieizmann發(fā)現(xiàn)梭菌Clostridium acetobutylicum可以轉(zhuǎn)化淀粉產(chǎn)生丙酮、丁醇、乙醇，1990年以前這些細(xì)菌被統(tǒng)稱為產(chǎn)丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，后來通過16s rRNA等進(jìn)一步分類，分出其他3種生長條件相同、產(chǎn)溶劑種類產(chǎn)量類似的C. beijerinckii，C. saccharobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum.這也就是主要產(chǎn)溶劑的四種梭菌，屬于梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)。目前主要的丙酮丁醇發(fā)酵菌株為丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum ATCC824和拜氏梭菌C. beijerinckii NCIMB8052,并且這兩株菌的全基因組序列分別于 2001年和2007年測(cè)定完成。近年來，利用厭氧梭菌發(fā)酵法生產(chǎn)生物丁醇作為很有潛力的液體燃料成為研究熱點(diǎn)。拜氏梭菌，革蘭氏陽性細(xì)菌，嚴(yán)格厭氧，可利用普通淀粉(玉米、小麥、谷類等)、 糖類作為發(fā)酵底物進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)溶劑，一般來講，定量發(fā)酵中，ABE產(chǎn)量(12-20g/L)為 20-30%丙酮，60-70%丙醇和10%的乙醇。其代謝過程過程分為2個(gè)階段產(chǎn)酸階段，此階段產(chǎn)酸途徑被激活，乙酸、丁酸、ATP、H2, CO2為主要代謝產(chǎn)物，培養(yǎng)基的pH從6. 3迅速下降至4. 5。產(chǎn)酸階段細(xì)胞將游離有機(jī)酸分泌至胞外，當(dāng)培養(yǎng)基中的游離有機(jī)酸濃度與電離的酸根離子達(dá)到平衡，培養(yǎng)基的緩沖能力降低，細(xì)胞生長受到一定抑制；細(xì)胞進(jìn)入芽孢生長期的同時(shí)也進(jìn)入產(chǎn)溶劑階段，培養(yǎng)基中的游離有機(jī)酸被重新吸收進(jìn)細(xì)胞內(nèi)合成為丙酮和丁醇。 溶齊Ll產(chǎn)生過禾呈主要由 acetoacetyI-CoA :acetate/butyrate_coenzymeA transferase (CoA transferase)禾口胃 ftk JL 禾中 butyraldhyde/butanol dehydrogenase, acetoacetate decarboxylase所催化。細(xì)胞從產(chǎn)酸代謝向產(chǎn)溶劑代謝的轉(zhuǎn)變，芽孢形成與溶劑產(chǎn)生的關(guān)聯(lián)和調(diào)控是目前產(chǎn)溶劑代謝途徑研究的熱點(diǎn)問題，對(duì)產(chǎn)溶劑期相關(guān)酶的增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)酸期相關(guān)酶的抑制的機(jī)制和途徑被認(rèn)為是這個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)的關(guān)鍵。在產(chǎn)溶劑梭菌的厭氧發(fā)酵過程中的菌株退化(degeneration)是目前研究的一個(gè)重要方面，也是限制其規(guī)模發(fā)酵的一個(gè)重要因素，其表現(xiàn)為在連續(xù)傳代中菌株完全或者部分喪失了產(chǎn)溶劑的能力，并且是不可逆的。細(xì)胞一直處于產(chǎn)酸生長期，胞外積累大量的有機(jī)酸，細(xì)胞不能進(jìn)入產(chǎn)溶劑期，這些有機(jī)酸沒有被重新吸收轉(zhuǎn)化，過量的有機(jī)酸使得細(xì)胞中毒死亡。在C. acetobutylicum ATCC824中，大質(zhì)粒pSOLl上含有產(chǎn)溶劑期相關(guān)酶基因(aad、ctfA, ctfB)，連續(xù)培養(yǎng)中該質(zhì)粒的丟失被認(rèn)為是造成菌株退化的直接原因，退化菌株C. acetobutylicum中外源表達(dá)這些基因則可恢復(fù)丁醇的產(chǎn)量達(dá)野生型的50%左右；在C. beijerinckii NCIMB8052中也出現(xiàn)不可逆的菌株退化、不產(chǎn)溶劑現(xiàn)象的出現(xiàn)，但是C. beijerinckii NCIMB8052細(xì)胞中并沒有大質(zhì)粒，所有的與產(chǎn)溶劑相關(guān)的基因都位于基因組上；同時(shí)退化的C.beijerinckii NCIMB8052菌株中可以檢測(cè)到產(chǎn)溶劑期相關(guān)酶基因序列的存在。因此，不同的產(chǎn)溶劑梭菌具有不同的控制產(chǎn)溶劑退化的機(jī)制，而在 C.beijerinckii NCIMB8052中這個(gè)調(diào)控機(jī)制是未知的，因此迫切需要研究其菌株退化發(fā)生機(jī)制，并找出有效控制菌株退化的方法。目前的研究并沒有關(guān)于C. beijerinckii菌株退化機(jī)制的相關(guān)報(bào)道，并且對(duì)于已發(fā)生退化的菌株并沒有有效的技術(shù)手段使其恢復(fù)產(chǎn)溶劑代謝的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種防止拜氏梭菌菌株退化的方法，以C. beijerinckii NCIMB8052位研究對(duì)象，人工獲得退化菌株模型，研究退化菌株的代謝，并通過碳酸鹽來調(diào)節(jié)細(xì)胞外游離的有機(jī)酸的濃度來恢復(fù)退化菌株產(chǎn)溶劑的能力?！N防止拜氏梭菌菌株退化的方法，按照如下步驟(1)構(gòu)建退化菌株模型；(2)恢復(fù)退化菌株產(chǎn)丁醇代謝。所述步驟(1)構(gòu)建退化菌株模型的是指C. beijerinckii NCIMB8052 野生菌株芽孢懸浮液 150 μ 1 于 75°C 熱激 lOmin，然后接種至IOml TGY液體培養(yǎng)基，其中TGY液體培養(yǎng)基包括3%胰蛋白胨，2%葡萄糖，1 %酵母粉，0. 半胱氨酸，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)30°C培養(yǎng)過夜；10%的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接量進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)接， 每他一次，轉(zhuǎn)接至IOml的新鮮TGY液體培養(yǎng)基中，共計(jì)轉(zhuǎn)接50次，獲得退化菌株，命名為 DG150 ；保存DG150的培養(yǎng)物，采用25%甘油保存法，_80°C 的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接DG150培養(yǎng)物至P2發(fā)酵培養(yǎng)基，其中P2發(fā)酵培養(yǎng)基60g/L葡萄糖，lg/L酵母粉，1 % buffer, 1 % Vitamin, 1 % Mineral，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)30°C進(jìn)行發(fā)酵，每隔1 取樣、共計(jì)發(fā)酵72h，使用分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌的0D·，同時(shí)樣品離心取上清進(jìn)行丁醇、丙酮、乙醇、乙酸、丁酸的GC分析。所述步驟( 恢復(fù)退化菌株產(chǎn)丁醇代謝是指2g/L CaCO3, (NH4) 2C03，NH4HCO3, K2CO3, NaHCO3, Na2CO3 加入至 P2 發(fā)酵培養(yǎng)基，6%轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接DG150培養(yǎng)物至P2培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)72h，每隔12小時(shí)取樣，細(xì)菌OD6tltl的測(cè)定、樣品前處理和分析方法同步驟(1)；恢復(fù)退化菌株產(chǎn)丁醇代謝的添加物CaCO3的使用濃度確定對(duì)CaCO3 的使用濃度進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，分別有 Og/L CaCO3、2g/LCaC03、4g/L CaC03、6g/L CaC03、8g/L CaCO3, lOg/L CaCO3,發(fā)酵P2培養(yǎng)基、細(xì)菌OD6tltl的測(cè)定、取樣方法、丁醇、丙酮、乙醇、乙酸、丁酸的分析方法同步驟(1)。所述步驟(1)中1 % buffer 包括 50g/L KH2PO4,50g/L K2HPO4,220g/L 乙酸銨， Vitamin包括0. lg/L對(duì)氨基苯甲酸、0. lg/L硫胺素、0. 001g/L生物素；Mineral包括 20g/L MgSO4· 7H20、lg/LMnS04 · H20、lg/L FeSO4 · 7H20、lg/L NaCl。退化菌株模型C. beijerinckii DG150的生長緩慢，最高OD6tltl為2. 21 士 0. 08，定量發(fā)酵3 后細(xì)胞進(jìn)入衰亡期。跟野生菌株相比較，DG150喪失了 96 %以上的產(chǎn)丁醇能力，可以說其已經(jīng)退化，完全不能用于產(chǎn)溶劑發(fā)發(fā)酵了。當(dāng)P2培養(yǎng)基中加入4g/L CaCO3,退化菌株C. beijerinckii DG150生長速度明顯加快，細(xì)菌濃度也有顯著提高，其最終代謝產(chǎn)物總?cè)軇┊a(chǎn)量恢復(fù)到了野生菌株的50%，總?cè)軇┊a(chǎn)率也有了顯著性的提高。


圖1C. beijerinckii NCIMB8052及退化菌株DG150在整個(gè)定量發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物曲線。A，C. beijerinckii NCIMB8052 在 P2 培養(yǎng)基中；B，C. beijerinckii DG150 在 P2 培養(yǎng)基中；C，C. beijerinckii DG150 在 P2+4g/LCaC03 培養(yǎng)基中。圖2C. beijerinckii NCIMB8052及退化菌株DG150在整個(gè)定量發(fā)酵過程中的生長曲線。虛線三角形，C. beijerinckii NCIMB8052 (WT)在P2培養(yǎng)基中；實(shí)線圓形， C. beijerinckii DG150 在 P2 培養(yǎng)基中；點(diǎn)線方形，C. beijerinckii DG150 在 P2+4g/LCaC03
培養(yǎng)基中。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述參見圖1-2，一種防止拜氏梭菌菌株退化的方法，按照如下步驟退化菌株模型的構(gòu)建C. beijerinckii NCIMB8052 S 生菌株芽孢懸浮液 150 μ 1 于 75°C 熱激 IOmin,然后接種至IOml TGY液體培養(yǎng)基(3%胰蛋白胨，2%葡萄糖，酵母粉，0. 半胱氨酸)，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)30°C培養(yǎng)過夜。10%的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接量進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)接，每他一次，轉(zhuǎn)接至IOml 的新鮮TGY液體培養(yǎng)基中，共計(jì)轉(zhuǎn)接50次，獲得退化菌株，命名為DG150。保存DG150的培養(yǎng)物(25%甘油保存法，-80°C)o 6%的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接DG150培養(yǎng)物至P2發(fā)酵培養(yǎng)基(60g/ L 葡萄糖，lg/L 酵母粉，1 % buffer (50g/L KH2PO4 ；50g/L K2HPO4 ；220g/L 乙酸銨)，1 % Vitamin (0. lg/L 對(duì)氨基苯甲酸；0. lg/L 硫胺素；0. 001 g/L 生物素)，1 % Mineral (20g/L MgSO4 · 7H20 ；lg/L MnSO4 · H2O ；lg/L FeSO4 · 7H20 ；lg/LNaCl))，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi) 30°C進(jìn)行發(fā)酵，每隔12h (共計(jì)發(fā)酵72h)取樣，使用分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌的0D_，同時(shí)樣品離心取上清進(jìn)行丁醇、丙酮、乙醇、乙酸、丁酸的GC分析。退化菌株產(chǎn)丁醇代謝的恢復(fù)2g/L CaCO3, (NH4) 2C03，NH4HCO3, K2CO3, NaHCO3, Na2CO3 加入至 P2 發(fā)酵培養(yǎng)基，6%轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接DG150培養(yǎng)物至P2培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)72h，每隔12小時(shí)取樣，細(xì)菌OD6tltl的測(cè)定、樣品前處理和分析方法同上，以不加碳酸鹽的P2培養(yǎng)基培養(yǎng)的DG150為陰性對(duì)照，以不加碳酸鹽的P2培養(yǎng)基培養(yǎng)的C. beijerinckii NCIMB8052為陽性對(duì)照。對(duì)不同的碳酸鹽處理結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)2g/L CaCO3處理對(duì)DG150產(chǎn)溶劑能力的恢復(fù)是最顯著的?；謴?fù)退化菌株產(chǎn)丁醇代謝的添加物CaCO3的使用濃度確定對(duì)CaCO3 的使用濃度進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，分別有 Og/L CaCO3、2g/LCaC03、4g/L CaC03、6g/L CaC03、8g/L CaCO3, lOg/L CaCO3,發(fā)酵P2培養(yǎng)基、細(xì)菌OD6tltl的測(cè)定、取樣方法、丁醇、丙酮、乙醇、乙酸、丁酸的分析方法同上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4g/L、6g/L、8g/L、10g/L CaCO3對(duì)DG150恢復(fù)產(chǎn)溶劑代謝的程度沒有顯著性差異，并且其貢獻(xiàn)高于2g/L CaCO3W添加。因此4g/L CaCO3 為使用量最少，恢復(fù)退化菌株產(chǎn)丁醇代謝能力效果最好的使用濃度。本專利中使用的“％”都采用本領(lǐng)域人員通常所用的單位，例如3%胰蛋白胨是指!3g/100ml。
本發(fā)明的效果如下退化菌株模型C. beijerinckii DG150的生長緩慢，最高OD6tltl為2. 21 士 0. 08，定量發(fā)酵3 后細(xì)胞進(jìn)入衰亡期。跟野生菌株相比較，DG150喪失了 96 %以上的產(chǎn)丁醇能力，可以說其已經(jīng)退化，完全不能用于產(chǎn)溶劑發(fā)發(fā)酵了。當(dāng)P2培養(yǎng)基中加入4g/L CaCO3，退化菌株C. beijerinckii DG150生長速度明顯加快，細(xì)菌濃度也有顯著提高，其最終代謝產(chǎn)物總?cè)軇┊a(chǎn)量恢復(fù)到了野生菌株的50%，總?cè)軇┊a(chǎn)率也有了顯著性的提高(表1)。表1C. beijerinckii NCIMB8052 及退化菌株 DG150 (4g/L CaCO3 添加前后)的代謝參數(shù)比較，P2發(fā)酵培養(yǎng)基中添加4g/LCaC03，滅菌，無需調(diào)節(jié)pH。
參數(shù)(最大值)C.beijerinckii NCIMB8052 P2培養(yǎng)基C.beijerinckii DG150 P2培養(yǎng)基C.beijerinckii DGl 50 P2 培養(yǎng)基 +4g/LCaC03丙酮(g/L)3.09 ±0.730.12 士 0.011.94±0.69乙醇(g/L)0.94 ±0.240.26 士 0.020.27 士 0.07丁醇(g/L)11.37 ±0.770.55 士 0.035.44 士 1.22總?cè)軇?g/L)15.40 ± 1.750.86 士 0.027.65 士 0.66乙酸(g/L)2.70 士 0.024.68±0.464.92 士 0.76丁酸(g/L)0.44 士 0.132.8 士 0.244.14±0.37細(xì)胞濃度(6OOnm)6.12 ± 0.442.21 士 0.083.40 士 0.23定量發(fā)酵時(shí)間(h)723648總?cè)軇┊a(chǎn)率(g/L/h)0.21 ±0.0240.02±0.00050.16±0.014 以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的方法及技術(shù)內(nèi)容作出些許的更動(dòng)或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種防止拜氏梭菌菌株退化的方法，其特征在于，按照如下步驟(1)構(gòu)建退化菌株模型；(2)恢復(fù)退化菌株產(chǎn)丁醇代謝。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)構(gòu)建退化菌株模型的是指 C. beijerinckii NCIMB8052野生菌株芽孢懸浮液150 μ 1于75°C熱激lOmin，然后接種至IOml TGY液體培養(yǎng)基，其中TGY液體培養(yǎng)基包括3%胰蛋白胨，2%葡萄糖，酵母粉， 0. 半胱氨酸，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)30°C培養(yǎng)過夜；10%的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接量進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)接，每他一次，轉(zhuǎn)接至IOml的新鮮TGY液體培養(yǎng)基中，共計(jì)轉(zhuǎn)接50次，獲得退化菌株，命名為DG150 ； 保存DG150的培養(yǎng)物，采用25%甘油保存法，-SO0C ；6%的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接DG150培養(yǎng)物至P2 發(fā)酵培養(yǎng)基，其中P2發(fā)酵培養(yǎng)基60g/L葡萄糖，lg/L酵母粉，1 % buffer, 1 % Vitamin, 1 % Mineral，厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)30°C進(jìn)行發(fā)酵，每隔1 取樣、共計(jì)發(fā)酵72h，使用分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌的0D·，同時(shí)樣品離心取上清進(jìn)行丁醇、丙酮、乙醇、乙酸、丁酸的GC分析。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟( 恢復(fù)退化菌株產(chǎn)丁醇代謝是指2g/L CaCO3, (NH4) 2C03，NH4HCO3, K2CO3, NaHCO3, Na2CO3 加入至 P2 發(fā)酵培養(yǎng)基，6%轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接DG150培養(yǎng)物至P2培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)72h，每隔12小時(shí)取樣，細(xì)菌OD6tltl的測(cè)定、樣品前處理和分析方法同步驟(1)；恢復(fù)退化菌株產(chǎn)丁醇代謝的添加物CaCO3的使用濃度確定對(duì) CaCO3 的使用濃度進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，分別有 Og/L CaC03、2g/LCaC03、4g/L CaC03、6g/L CaC03、8g/L CaCO3, lOg/L CaCO3,發(fā)酵P2培養(yǎng)基、細(xì)菌OD6tltl的測(cè)定、取樣方法、丁醇、丙酮、乙醇、乙酸、丁酸的分析方法同步驟(1)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中buffer包括50g/ L KH2PO4,50g/L K2HPO4,220g/L 乙酸銨，Vitamin 包括 0. lg/L 對(duì)氨基苯甲酸、0. Ig/ L 硫胺素、0. 00lg/L 生物素；1% Mineral 包括 20g/L MgSO4 · 7H20、lg/L MnSO4 · H20、lg/L FeSO4· 7H20、lg/L NaCl。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防止拜氏梭菌菌株退化的方法，以C.beijerinckii NCIMB8052為研究對(duì)象，人工獲得退化菌株模型，研究退化菌株的代謝，并通過碳酸鹽來調(diào)節(jié)細(xì)胞外游離的有機(jī)酸的濃度來恢復(fù)退化菌株產(chǎn)溶劑的能力。該方法按照如下步驟(1)構(gòu)建退化菌株模型；(2)恢復(fù)退化菌株產(chǎn)丁醇代謝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4g/L、6g/L、8g/L、10g/L CaCO3對(duì)DG150恢復(fù)產(chǎn)溶劑代謝的程度沒有顯著性差異，并且其貢獻(xiàn)高于2g/L CaCO3的添加。因此4g/L CaCO3為使用量最少，恢復(fù)退化菌株產(chǎn)丁醇代謝能力效果最好的使用濃度。
文檔編號(hào)C12R1/145GK102517229SQ20111038942
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者張瑞娟, 撒迪厄斯伊則吉, 韓蓓 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)