專利名稱：豬睪丸克隆細(xì)胞系及其生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法及產(chǎn)品，特別是指一種使用豬睪丸克隆細(xì)胞系生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法及產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
豬痕是由豬痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，不同年齡、性別和品種的豬均能感染，死亡率高達(dá)80-90 %。豬瘟被世界世界動(dòng)物衛(wèi)生組織劃分為A類疾病，我國(guó)將其劃分為一類疾病。中國(guó)學(xué)者培育成功的豬瘟兔化弱毒苗是目前世界上公認(rèn)的安全和有效的疫苗，借助于C株疫苗密集接種和綜合防制措施，有關(guān)國(guó)家已經(jīng)有效地控制了豬瘟，甚至消滅了豬瘟。在我國(guó)，豬瘟流行出現(xiàn)典型豬瘟與非典型豬瘟共存、持續(xù)感染與隱性感染共存、免疫耐受和帶毒綜合征共存等，因此，豬瘟新的流行 形式給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)防治本病提出了新的挑戰(zhàn)。疫苗接種仍是我國(guó)目前防治豬瘟的主要措施，我國(guó)目前生產(chǎn)豬瘟兔化弱毒苗用的細(xì)胞有牛睪丸細(xì)胞、豬腎細(xì)胞(IBRS-2或PK15細(xì)胞系)、豬睪丸細(xì)胞(ST細(xì)胞)。但在該疫苗生產(chǎn)實(shí)踐中證實(shí)用上述細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗，其病毒滴度不高，生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定，特別是病毒滴度隨細(xì)胞傳代數(shù)的增加迅速降低，導(dǎo)致疫苗批次之間的差異很大。此外，由于牛病毒性腹瀉病毒與豬瘟病毒同屬于黃病毒科瘟病毒屬，兩種病毒的同源性很高，因此污染了 BVDV的牛睪丸細(xì)胞或犢牛血清都會(huì)造成疫苗污染，而我國(guó)牛群中病毒性腹瀉病毒(BVDV)的感染率很高，用這樣的動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的豬瘟活疫苗免疫豬，往往造成免疫失敗，引起嚴(yán)重的后果。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種豬睪丸克隆細(xì)胞，及其生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法及產(chǎn)品。本發(fā)明提供的一種高感染豬瘟病毒的豬睪丸克隆細(xì)胞，命名為豬睪丸細(xì)胞系(swine testicular cell lines)克隆株ST-B2,保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC NO :C2011101，保藏日期為2011年11月07日。本發(fā)明中豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細(xì)胞，是指對(duì)豬瘟病毒感染高的豬睪丸克隆細(xì)胞，特別指可以生產(chǎn)高滴度的豬瘟病毒的豬睪丸克隆細(xì)胞，也即指可以生產(chǎn)高效價(jià)的豬瘟活疫苗的豬睪丸克隆細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種如上所述的豬睪丸克隆細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟I)將豬睪丸細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋進(jìn)行細(xì)胞克隆和亞細(xì)胞克隆，獲得亞細(xì)胞克隆株；2)選擇對(duì)豬瘟病毒感染率最高的豬睪丸細(xì)胞的亞克隆株即為豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明如上所述的使用豬睪丸克隆細(xì)胞的制備方法中，所述的步驟I)為使用未被病毒感染的豬睪丸細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化為單細(xì)胞后進(jìn)行梯度稀釋，分別在37°c5% CO2的條件下培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至肉眼可見細(xì)胞克隆后，進(jìn)行亞細(xì)胞培養(yǎng)，獲得亞克隆細(xì)胞株；優(yōu)選地，本發(fā)明如上所述的 使用豬睪丸克隆細(xì)胞的制備方法中，所述的步驟2)為將豬睪丸細(xì)胞亞克隆株接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種豬瘟病毒于37°C 5% CO2的條件下培養(yǎng)2h，使用免疫過氧化酶單層細(xì)胞試驗(yàn)法檢測(cè)感染病毒最多的細(xì)胞，選擇對(duì)豬瘟病毒感染率最高的豬睪丸細(xì)胞的亞克隆株即為豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種如上所述的豬睪丸克隆細(xì)胞用于高滴度的豬瘟病毒液的制備方法，將上述的豬睪丸克隆細(xì)胞用胰酶消化后，同步接種含新鮮脾毒的細(xì)胞維持液，37°C含5% CO2溫箱中培養(yǎng)2-3d，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，按照I : 3的比例傳代，同時(shí)收獲傳代細(xì)胞的上清病毒液即可獲得高滴度的豬瘟病毒液。優(yōu)選地，本發(fā)明如上所述的高滴度的豬瘟病毒液的制備方法中，所述傳代次數(shù)為可以大于15代。優(yōu)選地，本發(fā)明如上所述的高滴度的豬瘟病毒液的制備方法中，所述的病毒滴度為大于 106 0TCID50/mlo本發(fā)明還提供了一種使用如上I所述的豬睪丸克隆細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，包括以下步驟I)生產(chǎn)用種子批病毒液的制備將權(quán)利要求I所述的豬睪丸克隆細(xì)胞用胰酶消化后，同步接種含新鮮脾毒的細(xì)胞維持液，37°C含5% CO2溫箱中培養(yǎng)2-3d，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，按照I : 3的比例傳代2次，同時(shí)收獲第二代、第三代的傳代細(xì)胞的上清病毒液即可獲得高滴度的豬瘟病毒液；2)制苗用病毒液的制備權(quán)利要求I所述的豬睪丸克隆細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，用含0. 5% EDTA的胰酶進(jìn)行消化，采用同步接種的方法接種含5%生產(chǎn)種子批毒的細(xì)胞維持液，置37°C含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，按照I : 3的比例用胰酶消化進(jìn)行傳代，同時(shí)收獲病毒上清，用同樣的方法傳代至少15代，每代都收取病毒上清液作為制苗用毒液；3)病毒液的制苗將上述收獲的病毒液加入凍干保護(hù)劑，凍干，即可獲得豬睪丸克隆細(xì)胞生產(chǎn)的豬瘟活疫苗。優(yōu)選地，本發(fā)明如上所述的豬睪丸克隆細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法中，所述的活疫苗的效價(jià)為每頭份病毒含量> 9000個(gè)家兔感染量，每頭份含細(xì)胞毒液> 0. 01ml。因此，本發(fā)明提供了使用如上所述的豬睪丸克隆細(xì)胞，生產(chǎn)制備獲得了一種高滴度的豬瘟病毒液，以及高效價(jià)的豬瘟活疫苗。由上可以看出，本發(fā)明通過大量細(xì)致試驗(yàn)獲得了一株對(duì)豬瘟病毒感染率高的豬睪丸細(xì)胞，使用該豬睪丸細(xì)胞系ST克隆細(xì)胞株ST-B2，以帶毒傳毒的方法生產(chǎn)的豬瘟疫苗，病毒滴度高，不易受到BVDV的污染，疫苗純凈性好；帶毒傳毒的方法使得每次復(fù)蘇的細(xì)胞可以持續(xù)傳代達(dá)至少15代，減少了復(fù)蘇細(xì)胞與接毒的次數(shù)，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，并提高了生產(chǎn)效率。牛物材料保藏信息豬睪丸細(xì)胞系克隆株ST-B2，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC NO :C2011101，保藏日期為2011年11月07日。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用生長(zhǎng)液配方為91% v/vDMEM液、9% v/v犢牛血清PH調(diào)整為7. I ;所述維持液的配方為98% v/vDMEM液、2% v/v犢牛血清PH調(diào)整為7. 3 ;豬瘟病毒為豬瘟兔化弱毒株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，菌株保藏編號(hào)CVCC AV1412。本發(fā)明的實(shí)施例可以分為以下方面I.敏感均一生長(zhǎng)性能良好的ST細(xì)胞的克隆(I)母ST細(xì)胞的篩選；⑵CSFV感染ST細(xì)胞檢測(cè)方法的建立與穩(wěn)定；(3)單個(gè)ST細(xì)胞亞群的培養(yǎng)；⑷陽性ST細(xì)胞克隆的篩選；(5)陽性ST細(xì)胞的亞克隆；(6) CSFV在ST陽性克隆細(xì)胞上產(chǎn)生毒價(jià)的測(cè)定；(7) ST陽性克隆細(xì)胞的穩(wěn)定性鑒定。2.克隆細(xì)胞的培養(yǎng)及帶毒細(xì)胞傳毒 (I)克隆細(xì)胞用胰酶消化后，接種含毒的細(xì)胞維持液；(2)待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，按I 3傳代，同時(shí)收獲細(xì)胞上清，收獲的第二、第三代上清作為生產(chǎn)種子批毒；(3)用同樣的方法收獲細(xì)胞上清，作為疫苗用毒液，帶毒傳毒可以傳代至少15代以上為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。如未特別聲明，本發(fā)明的一般實(shí)驗(yàn)方法可使用本領(lǐng)域常用的試驗(yàn)方法進(jìn)行。本發(fā)明實(shí)施例中的細(xì)朐牛長(zhǎng)液為91% v/vDMEM液、9% v/v犢牛血清PH調(diào)糖為本發(fā)明實(shí)施例中的細(xì)胞維持液為98% v/vDMEM液、2% v/v犢牛血清PH調(diào)整為
7.3。實(shí)施例I :ST克隆細(xì)胞的篩選和利用該細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法一、母ST細(xì)胞的篩選I.細(xì)胞純凈性檢驗(yàn)無支原體污染2.外源病毒檢測(cè)以牛病毒性腹灣病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)為例進(jìn)行說明外源病毒檢測(cè)方法。利用PCR技術(shù)，對(duì)ST細(xì)胞進(jìn)行牛病毒性腹灣病毒(Bovine Viral DiarrheaVirus,BVDV)檢測(cè)。結(jié)果ST細(xì)胞應(yīng)不攜帶BVDV。檢測(cè)方法用胰酶消化在T25細(xì)胞瓶生長(zhǎng)的單層ST細(xì)胞，收獲細(xì)胞，IOOOrpm離心lOmin，棄去上清液，用PBS洗一遍，離心收集細(xì)胞沉淀。參考Invitrogen的TRIzoI說明書，提取細(xì)胞總RNA。提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA作為PCR模板，采用BVDV特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增出目的條帶者攜帶BVDV，未擴(kuò)增出目的條帶者則不攜帶BVDV。用同樣的方法進(jìn)行RNA病毒豬痕病毒(Classical Swine fever Virus, CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)的檢測(cè)。對(duì)于DNA病毒豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus, PCV)及豬偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus)的檢測(cè)也采用PCR的方法進(jìn)行，提取細(xì)胞DNA后，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)+
>曰o檢測(cè)結(jié)果表明BVDV、CSFV、PRRSV、PCV, PRV全部為陰性。二、單個(gè)ST細(xì)胞及其亞群的培養(yǎng)
對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層ST細(xì)胞用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，盡可能分散，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后采用有限稀釋法，按照8個(gè)細(xì)胞/ml的密度，每孔IOOiU的細(xì)胞生長(zhǎng)液的量加A 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，對(duì)含有單個(gè)細(xì)胞的孔進(jìn)行標(biāo)記后，將96孔板置于含5%⑶2，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至產(chǎn)生肉眼可見 細(xì)胞克隆為止。在此過程中可依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，對(duì)克隆細(xì)胞進(jìn)行換液。當(dāng)孔內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到單層時(shí)，將其消化下來，置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于含5% C02，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿24孔后，將其消化后，置于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，如有可能，對(duì)克隆的細(xì)胞進(jìn)行凍存保種，以備用。條件培養(yǎng)基收集后lOOOOrpm，離心IOmin后,0. 45 u m濾膜過濾去除細(xì)胞碎片。三、高感染性的ST細(xì)胞克隆的篩選將6孔板上擴(kuò)大培養(yǎng)的ST細(xì)胞亞群，用胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照2 X IO4個(gè)cell/每96孔，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，重復(fù)I孔，接種24h后接毒CSFV病毒液，以MOI =
0.I的接毒量接種病毒，每孔加入200 ii L病毒原液，37°C孵育Ih后，棄掉病毒液，加入細(xì)胞維持液，于5% C02，37°C溫箱中培養(yǎng)2d后，用免疫過氧化酶單層細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞感染病毒情況，陽性細(xì)胞數(shù)多的孔為CSFV感染率高的ST細(xì)胞亞群，為所需的高感染性的ST克隆細(xì)胞。然后將其在6孔板上擴(kuò)大培養(yǎng)，用胰酶消化，并進(jìn)行第2次或者3次克隆，每次克隆都需要做CSFV感染性檢測(cè)，以達(dá)到純化的具備高感染性的ST克隆細(xì)胞的目的。實(shí)施例2ST克隆細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)豬瘟病毒的方法獲得的高感染性的ST克隆細(xì)胞株ST_B2(保藏號(hào)CCTCC C2011101)用胰酶消化后，同步接種生產(chǎn)種子批毒，37°C溫箱中培養(yǎng)3-4d，按照I : 3(體積比)的比例傳代，同時(shí)收獲上清作為制苗用毒液進(jìn)行冷凍保存，依同樣的方法傳代至少15代，收獲每代的病毒上清作為制苗用毒液。I、CSFV在陽性ST克隆細(xì)胞株ST-B2上病毒滴度的測(cè)定將帶毒傳毒方法傳代獲得的CSFV病毒在高感染性克隆細(xì)胞ST-B2上連續(xù)增殖培養(yǎng)，采用間接免疫熒光方法測(cè)定收獲的每個(gè)代次的CSFV病毒液的滴度，具體如下將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ST-B2細(xì)胞用胰酶消化，每孔200 u L鋪到96孔板內(nèi)，待長(zhǎng)滿單層后，按照KT1-IO-8稀釋CSFV病毒液，并加入96孔板中，每個(gè)稀釋度6個(gè)孔，3-4天后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗兩次，用冰甲醇固定細(xì)胞10分鐘，然后加1% BSA進(jìn)行封閉30分鐘，PBS洗兩次后，加入稀釋好的一抗，37°C孵育2h后，PBS洗5次，加入稀釋好的二抗，37°C孵育lh，PBS洗5次，然后在倒置顯微鏡下觀察每個(gè)孔里的熒光，利用Reed-Muench兩氏法計(jì)算出病毒的滴度。連續(xù)生產(chǎn)3批的病毒滴度分別為20101101批病毒滴度為107_°TCID5(l/ml、20101102批病毒滴度為 106_92TCID5Q/ml、20101103 批病毒滴度為 107_27TCID5(l/ml。2、陽性ST克隆細(xì)胞株ST-B2的穩(wěn)定性鑒定對(duì)陽性ST克隆細(xì)胞株ST-B2進(jìn)行連續(xù)傳代30代，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，并且每隔5代將細(xì)胞接種CSFV病毒，測(cè)定CSFV滴度，病毒滴度穩(wěn)定在106_5TCID5cZml左右，選取10代以內(nèi)的克隆細(xì)胞作為生產(chǎn)用種子批細(xì)胞。3、生產(chǎn)用種子批毒的制備ST-B2細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，用含0. 5% EDTA的胰酶進(jìn)行消化后，采取同步接種的方法以MOI = 0. I接種量含新鮮脾毒的細(xì)胞維持液，置37°C含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，按照用胰酶消化后按照I : 3的比例進(jìn)行傳代，同時(shí)收獲病毒上清，收獲的第二、第三代病毒上清作為生產(chǎn)種子批毒。4、制苗用細(xì)胞毒液的制備ST-B2細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，用含0. 5% EDTA的胰酶進(jìn)行消化，采用同步接種的方法接種含5% v/v生產(chǎn)種子批毒的細(xì)胞維持液，置37°C含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，按照I : 3的比例用胰酶消化進(jìn)行傳代，同時(shí)收獲病毒上清，用同樣的方法傳代至少15代，每代都收取病毒上清作為制苗用毒液，保存于_70°C冰箱。5、豬瘟活疫苗的制備及效力檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》對(duì)制苗用毒液進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果無細(xì)菌、霉菌、支原體生長(zhǎng)。細(xì)胞毒液對(duì)豬安全無副作用，20101101、20101102、20101103批病毒滴度分別為IO7.0TCID50Ail、IO6.92TCID50/ml、IO7.27TCID50M。各收次的病毒液加入凍干保護(hù)劑，凍干制成豬瘟活疫苗，疫苗批次為20101101、20101102、20101103，分別用家兔測(cè)定，每頭份病毒含量 ^ 9000個(gè)家兔感染量，每頭份含細(xì)胞毒液> 0. 01ml。用家兔效檢疫苗效力的方法如下(I)每收次的病毒液用滅菌生理鹽水稀釋3X IO5倍、4X IO5倍、5X IO5倍、6X IO5倍、7 X IO5倍、8 X IO5倍、9 X IO5倍、IO6倍，耳靜脈注射體重I. 5 3. Okg家兔2只，每只兔耳靜脈注射1ml。家兔接種后，上下午各測(cè)體溫I次，48小時(shí)后，每隔6小時(shí)測(cè)體溫I次，根據(jù)體溫反應(yīng)和攻毒結(jié)果進(jìn)行綜合判定。①家兔接種疫苗后，體溫反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)如下定型熱反應(yīng)(++)潛伏期48 96小時(shí)，體溫上升呈明顯曲線，至少有3個(gè)溫次超過常溫1°C以上，并稽留18 36小時(shí)。如稽留42小時(shí)以上，必須攻毒，攻毒后無反應(yīng)可判為定型熱。輕熱反應(yīng)(+)潛伏期48 96小時(shí)，體溫上升呈明顯曲線，至少有2個(gè)溫次超過常溫0. 50C以上，并稽留12 36小時(shí)。可疑反應(yīng)(±)潛伏期48 96小時(shí)，體溫曲線起伏不定，稽留不到12小時(shí)；或潛伏期在24小時(shí)以上，不足48小時(shí)及超過96小時(shí)至120小時(shí)出現(xiàn)熱反應(yīng)。體溫反應(yīng)呈二次高峰,有一次高峰符合定型熱反應(yīng)(++)或輕熱反應(yīng)(+)標(biāo)準(zhǔn)者，均須攻毒。攻毒后無反應(yīng)時(shí)，該兔熱反應(yīng)可判為定型熱或輕熱反應(yīng)。無反應(yīng)㈠體溫正常。②結(jié)果判定注苗后，當(dāng)2只家兔均呈定型熱反應(yīng)(++)，或I只兔呈定型熱反應(yīng)(++)、另I只兔呈輕熱反應(yīng)(+)時(shí)，疫苗判為合格。注苗后，當(dāng)I只家兔呈定型熱反應(yīng)(++)或輕熱反應(yīng)(+)，另I只兔呈可疑反應(yīng)(±);或2只兔均呈輕熱反應(yīng)(+)時(shí)，可在注苗后7 10日攻毒(接種新鮮脾淋毒或凍干毒)。攻毒時(shí)，加對(duì)照兔2只，攻毒劑量為50 100倍乳劑。每兔耳靜脈注射lml。攻毒后的體溫反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)如下熱反應(yīng)⑴潛伏期24 72小時(shí)，體溫上升呈明顯曲線，超過常溫1°C以上，稽留12 36小時(shí)?？梢煞磻?yīng)(±)潛伏期不到24小時(shí)或72小時(shí)以上，體溫曲線起伏不定，稽留不到12小時(shí)或超過36小時(shí)而不下降。
無反應(yīng)(_)體溫正常。攻毒后，當(dāng)2只對(duì)照兔均呈定型熱反應(yīng)(++)，或I只兔呈定型熱反應(yīng)(++)，另I只兔呈輕熱反應(yīng)(+)，而2只注苗兔均無反應(yīng)(_)，疫苗判合格。注苗后，如有I只兔呈定型熱(++)或輕熱反應(yīng)(+)，另I只兔呈可疑反應(yīng)(±)或無熱反應(yīng)(_)，可對(duì)可疑反應(yīng)兔或無反應(yīng)兔采用剖殺或采心血分離病毒的方法，判明是否隱性感染；或注苗后，2只兔均呈輕熱反應(yīng)，亦可對(duì)其中I只兔分離病毒。方法是接種疫苗后96 120小時(shí)之間，將兔剖殺，采取脾臟，用生理鹽水制成50倍稀釋乳劑(脾乳劑應(yīng)無菌)，或采取心血(全血)，接種2只家兔，每只兔耳靜脈注射lml。凡有I只兔潛伏期24 72小時(shí)出現(xiàn)定型熱反應(yīng)(++)，疫苗可判為合格。
注苗后，出現(xiàn)其它反應(yīng)情況無法判定時(shí)，可重檢。用家兔做效檢，不應(yīng)超過3次。經(jīng)檢驗(yàn)，三個(gè)收次所制備的活疫苗均合格，具體結(jié)果為20101101批次疫苗I/(3 X IO5)、I/(4 X IO5)、I/ (5 X IO5)、I/ (6 X IO5)、I/ (7 X IO5)、I/ (8 X IO5) 6 個(gè)稀釋度耳靜脈注射家兔各 2只，每只1ml，根據(jù)體溫反應(yīng)知呈現(xiàn)2只家兔均呈定型熱反應(yīng)(++)，或I只兔呈定型熱反應(yīng)(++)、另I只兔呈輕熱反應(yīng)⑴時(shí)，疫苗判為合格。而I/(9 XlO5)、1/106兩個(gè)稀釋度耳靜脈注射家兔各2只，每只1ml，根據(jù)體溫反應(yīng)知I只家兔呈定型熱反應(yīng)(++)，另I只兔呈可疑反應(yīng)(±)，在注苗后7 10日攻毒(接種新鮮脾淋毒，即豬瘟兔化弱毒株通過兔體繼代，采集定性熱反應(yīng)兔的脾臟作為種毒)。攻毒時(shí)，加對(duì)照兔2只，攻毒劑量為100倍乳劑。每兔耳靜脈注射lml。攻毒后，2只對(duì)照兔均呈定型熱反應(yīng)(++)，或I只兔呈定型熱反應(yīng)(++)，另I只兔呈輕熱反應(yīng)(+)，而2只注苗兔均無反應(yīng)(_)，疫苗判合格。20101102批次疫苗I/(3 X IO5)、I/ (4 X IO5) ,1/(5 X IO5) ,1/(6 X IO5) ,1/(7 X IO5) ,1/(8 X IO5) ,1/(9 X IO5) 7 個(gè)稀釋度耳靜脈注射家兔各2只，每只1ml，根據(jù)體溫反應(yīng)知呈現(xiàn)2只家兔均呈定型熱反應(yīng)(++)，或I只兔呈定型熱反應(yīng)(++)、另I只兔呈輕熱反應(yīng)(+)時(shí)，疫苗判為合格。而1/106稀釋度耳靜脈注射家兔2只，每只1ml，根據(jù)體溫反應(yīng)知I只家兔呈定型熱反應(yīng)(++)，另I只兔呈可疑反應(yīng)(±)，在注苗后7 10日攻毒(接種新鮮脾淋毒，即豬瘟兔化弱毒株通過兔體繼代，采集定性熱反應(yīng)兔的脾臟作為種毒)。攻毒時(shí)，加對(duì)照兔2只，攻毒劑量為100倍乳齊U。每兔耳靜脈注射lml。攻毒后，2只對(duì)照兔均呈定型熱反應(yīng)(++)，而2只注苗兔均無反應(yīng)(-)，疫苗判合格。20101103 批次疫苗 I/(3 X IO5)、I/ (4X IO5)、I/ (5 X IO5)、I/ (7 X IO5)、I/ (8 X IO5) 5個(gè)稀釋度耳靜脈注射家兔各2只，每只Iml，根據(jù)體溫反應(yīng)知呈現(xiàn)2只家兔均呈定型熱反應(yīng)(++)，或I只兔呈定型熱反應(yīng)(++)、另I只兔呈輕熱反應(yīng)(+)時(shí)，疫苗判為合格。而I/ (6 X IO5)、I/ (9 X IO5)、1/1063個(gè)稀釋度耳靜脈注射家兔各2只，每只Iml，根據(jù)體溫反應(yīng)知I只家兔呈定型熱反應(yīng)(++)，另I只兔呈可疑反應(yīng)(±)，在注苗后7 10日攻毒(接種新鮮脾淋毒，即豬瘟兔化弱毒株通過兔體繼代，采集定性熱反應(yīng)兔的脾臟作為種毒)。攻毒時(shí)，加對(duì)照兔2只，攻毒劑量為100倍乳劑。每兔耳靜脈注射lml。攻毒后，2只對(duì)照兔均呈定型熱反應(yīng)(++)，或I只兔呈定型熱反應(yīng)(++)，另I只兔呈輕熱反應(yīng)(+)，而2只注苗兔均無反應(yīng)(_)，疫苗判合格。詳細(xì)見表I。表I家兔效檢疫苗效力的結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細(xì)胞，其特征在于，保藏號(hào)為CCTCC NOC2011101。
2.一種如權(quán)利要求I所述的豬睪丸克隆細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將豬睪丸細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋進(jìn)行細(xì)胞克隆和亞細(xì)胞克隆，獲得亞細(xì)胞克隆株； 2)選擇對(duì)豬瘟病毒感染率最高的豬睪丸細(xì)胞的亞克隆株即為豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的使用豬睪丸克隆細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述的步驟1)為使用未被病毒感染的豬睪丸細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化為單細(xì)胞后進(jìn)行梯度稀釋，分別在370C 5% CO2的條件下培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至肉眼可見細(xì)胞克隆后，進(jìn)行亞細(xì)胞培養(yǎng)，獲得亞克隆細(xì)胞株；
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的使用豬睪丸克隆細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述的步驟2)為將豬睪丸細(xì)胞亞克隆株接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種豬瘟病毒于37°C5%0)2的條件下培養(yǎng)2h，使用免疫過氧化酶單層細(xì)胞試驗(yàn)法檢測(cè)感染病毒最多的細(xì)胞，選擇對(duì)豬瘟病毒感染率最高的豬睪丸細(xì)胞的亞克隆株即為豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細(xì)胞。
5.一種使用權(quán)利要求I所述的豬睪丸克隆細(xì)胞用于高滴度的豬瘟病毒液的制備方法，其特征在于，將權(quán)利要求I所述的豬睪丸克隆細(xì)胞用胰酶消化后，同步接種含新鮮脾毒的細(xì)胞維持液，37°C含5% CO2溫箱中培養(yǎng)2-3d，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，按照I : 3的比例傳代，同時(shí)收獲傳代細(xì)胞的上清病毒液即可獲得高滴度的豬瘟病毒液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高滴度的豬瘟病毒液的制備方法，其特征在于，所述傳代次數(shù)為可以大于15代。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高滴度的豬瘟病毒液的制備方法，其特征在于，所述的病毒滴度為大于 106_°TCID5(l/ml。
8.一種使用權(quán)利要求I所述的豬睪丸克隆細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟病毒。
9.一種使用權(quán)利要求I所述的豬睪丸克隆細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)生產(chǎn)用種子批病毒液的制備將權(quán)利要求I所述的豬睪丸克隆細(xì)胞用胰酶消化后，同步接種含新鮮脾毒的細(xì)胞維持液，37°C含5% CO2溫箱中培養(yǎng)2-3d，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，按照I : 3的比例傳代2次，同時(shí)收獲第二代、第三代的傳代細(xì)胞的上清病毒液即可獲得高滴度的豬瘟病毒液； 2)制苗用病毒液的制備權(quán)利要求I所述的豬睪丸克隆細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，用含0.5%EDTA的胰酶進(jìn)行消化，采用同步接種的方法接種含5%生產(chǎn)種子批毒的細(xì)胞維持液，置37°C含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，按照I : 3的比例用胰酶消化進(jìn)行傳代，同時(shí)收獲病毒上清，用同樣的方法傳代至少15代，每代都收取病毒上清液作為制苗用毒液； 3)病毒液的制苗將上述收獲的病毒液加入凍干保護(hù)劑，凍干，即可獲得豬睪丸克隆細(xì)胞生產(chǎn)的豬瘟活疫苗。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的豬睪丸克隆細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于，所述的活疫苗的效價(jià)為每頭份病毒含量> 9000個(gè)家兔感染量，每頭份含細(xì)胞毒液> 0. 01ml。
11.一種使用權(quán)利要求I所述的豬睪丸克隆細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種高感染豬瘟病毒的豬睪丸克隆細(xì)胞株ST-B2，保藏號(hào)為CCTCC NO.C2011101。以及該豬睪丸克隆細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟1)將豬睪丸細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋進(jìn)行細(xì)胞克隆和亞細(xì)胞克隆，獲得亞細(xì)胞克隆株；2)選擇對(duì)豬瘟病毒感染率最高的豬睪丸細(xì)胞的亞克隆株即為豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細(xì)胞。本發(fā)明還提供了上述豬睪丸克隆細(xì)胞制備高滴度的豬瘟病毒液和豬瘟活疫苗的方法。本發(fā)明的豬睪丸克隆細(xì)胞，對(duì)豬瘟病毒感染率高，使用該豬睪丸細(xì)胞系ST克隆細(xì)胞株ST-B2以帶毒傳毒的方法生產(chǎn)的豬瘟疫苗，病毒滴度高，不易受到BVDV的污染，疫苗純凈性好；帶毒傳毒的方法使得每次復(fù)蘇的細(xì)胞可以持續(xù)傳代達(dá)至少15代，減少了復(fù)蘇細(xì)胞與接毒的次數(shù)，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，提高了生產(chǎn)效率。
文檔編號(hào)C12R1/91GK102965332SQ201110391978
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠 申請(qǐng)人:普萊柯生物工程股份有限公司