專利名稱：一種快速提取禽類血液基因組dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物基因組DNA的提取方法，尤其涉及ー種快速提取禽類血液基因組DNA的方法。
背景技術(shù)：
基因組DNA提取是分子生物學研究最基本的技術(shù)，DNA可以從各種樣品材料中犾得，包括抗凝血，凝固血，裂解血，軟層細胞，毛囊等。目前常用的提取方法是酚-氯仿抽提法，該方法利用SDS破解細胞膜，釋放細胞所含的蛋白質(zhì)；再利用蛋白酶K分解釋放的蛋白質(zhì)，多余的沒有被蛋白酶K分解的蛋白質(zhì)被酚-氯仿抽提除去；剩余的基因組DNA用こ醇沉淀。該方法可以得到高純度的基因組DNA，但需要的化學試劑也多，尤其用到了對皮膚有腐蝕作用的化學試劑——酹，對試驗操作人員存在相當大的危險；此外，用到的酚、氯仿、異戊醇等試劑容易揮發(fā)，對實驗室及其周邊環(huán)境也會造成一定污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種安全的快速提取禽類血液基因組DNA的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了 ー種快速提取禽類血液基因組DNA的方法，包括以下步驟(I)取抗凝血，將其與細胞裂解液按I : 50混合(體積比)，向混合液中加入蛋白酶K;(2)在55-65°C的溫度下，水浴消化3_5小時；(3)加預冷的こ醇，充分混勻，こ醇使溶液中的DNA和部分蛋白一起沉淀；IOOOOrpm離心5min,棄上清液；(4)加雙蒸水ddH20溶解沉淀，こ醇使蛋白發(fā)生不可逆變性,沉淀中的蛋白不能溶解，而DNA可以再次溶解；IOOOOrpm離心5min,吸上清液到干凈的離心管中；(5)加入4mol/L的NaAc和預冷的こ醇,充分混勻；IOOOOrpm離心5min,棄上清液，加75%的預冷こ醇，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，即基因組DNA。所述的細胞裂解液的組成是0.5M EDTA 35_45ml，IM Tris *HC1 6_12ml，5M NaCl2-6ml, 10% SDS 8_12ml。所述的抗凝血與細胞裂解液的體積比為I : 50，蛋白酶K的加入量與混合液的比為 I 125。步驟(3)中こ醇的加入量占總體積的70%以上。步驟(5)中使NaAc的含量為O. 1-0. 2mol/L,預冷的こ醇的濃度達到70% -90%。本發(fā)明的方法針對酚-氯仿抽提法提取基因組DNA的缺點，結(jié)合禽血紅細胞中含有細胞核，基因組DNA含量豐富的特點，提出了用こ醇進行兩次沉淀，代替酚-氯仿抽提進行禽血基因組DNA提取的方法。本方法僅需IOul抗凝血，加入細胞裂解液裂解細胞后，用蛋白酶K消化溶液里的蛋白質(zhì)，然后用こ醇沉淀基因組DNA和剩余的未被消化的蛋白質(zhì)，棄上清液，將沉淀用ddH20溶解，由于こ醇使蛋白發(fā)生不可逆變性，所以沉淀中的蛋白不能溶解，而DNA可以再次溶解；轉(zhuǎn)移上清液(含有基因組DNA)到新的I. 5ml離心管中，第二次向溶液中加入高濃度こ醇，基因組DNA就可以再次沉淀，從而得到高純度的基因組DNA。本方法快速、高效、無毒、經(jīng)濟，所得到的基因組DNA可以進行下一歩的PCR、酶切等分子生物學分析。本發(fā)明的方法具有操作安全，沒有環(huán)境污染；本方法進行禽血基因組DNA提取主要試劑是こ醇，沒有用到酚、氯仿、異戊醇等有毒有害試劑，對操作者和環(huán)境都沒有污染。另外，提取方法簡單，結(jié)果可靠，基因組DNA提取過程中沒有用到氯仿等溶剤，不出現(xiàn)液面分層和移上清液等難度較大的操作，因此，也不存在有機溶劑殘留在提取的基因組DNA里，影響下面的操作(如PCR擴增、酶切)等問題。采用本發(fā)明的方法的提取過程所需要時間在Ih以內(nèi)。


圖I為本發(fā)明的方法提取的鵪鶉基因組DNA經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。 電泳條件取4ul基因組DNA加Iul 6XLoading buffer點樣，8v/cm電泳30min后拍照。圖2為用本方法提取的北京鴨基因組DNA用多對引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)O. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測的照片。電泳條件取4ul PCR產(chǎn)物加Iul 6 X Loading buffer點樣，8v/cm電泳30min后拍照。
具體實施例方式具體實施的方法如下所用到的緩沖液和試劑如下細胞裂解液分別取O. 5M EDTA 40ml, IM Tris .HCl IOml，5M NaCl 4ml, 10% SDS10ml，定容至 100ml。實際濃度為 200mM EDTA，pH值 8· O ;100mM Tris .HCl，pH值 8· O ;200mMNaCl,2% SDS。蛋白酶K :取IOOmg蛋自酶K溶于5ml滅菌ddH20，_20°C保存4mol/L的NaAc :稱量54. 4g NaAc · 3H20置于IOOml燒杯中，加入40ml的ddH20攪拌溶解，加入冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5. 2,定容至100ml,高壓滅菌。TE 緩沖液取 IM Tris-HCl (PH = 8. O) 5ml、O. 5M EDTA (PH = 8. O) 1ml，定容到500ml,高壓滅菌。 75 %こ醇75mlこ醇(分析純)加入25ml的ddH20，混勻。100%こ醇分析純具體步驟如下(I)取IOul抗凝的鵪鶉血，加500ul細胞裂解液，再加4ul蛋白酶K，充分混勻；(2)在60°C的溫度下，水浴消化3_4h ；(3)加IOOOuI預冷的こ醇(分析純)，充分混勻，溶液中出現(xiàn)沉淀；(4) IOOOOrpm 離心 5min,棄上清液；(5)加300ul ddH20，上下劇烈顛倒，溶解沉淀，沉淀不會完全溶解，因為沉淀中的蛋白質(zhì)已經(jīng)發(fā)生不可逆變性，不能再次溶解；而沉淀中的基因組DNA可以再次溶解；(6) IOOOOrpm離心5min,吸上清液(約300ul)到干凈的離心管中；加50ul 4mol/L的NaAc，900ul預冷的こ醇(分析純)，上下緩慢顛倒，充分混勻，出現(xiàn)白色絮狀沉淀(基因組DNA)；(7) IOOOOrpm離心5min,棄上清液,加75%的預冷的こ醇700ul,上下緩慢顛倒混勻；(8) IOOOOrpm離心5min，棄上清液，用200ul移液器吸干離心管底部的液體，室溫干燥5 IOmin ； (9)加50 200ul TE溶解，用移液器反復吹打數(shù)次，室溫放置lOmin，以溶解基因組 DNA。
權(quán)利要求
1.ー種快速提取禽類血液基因組DNA的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)取抗凝血，將其與細胞裂解液混合形成混合液，向混合液中加入蛋白酶K; (2)在55-65°C的溫度下，水浴消化3-5小時； (3)加預冷的こ醇，充分混勻，こ醇使溶液中的DNA和部分蛋白一起沉淀；10000rpm離心5min,棄上清液； (4)加雙蒸水ddH20溶解沉淀；IOOOOrpm離心5min，吸上清液到干凈的離心管中； (5)加入4mol/L的NaAc和預冷的こ醇,充分混勻；IOOOOrpm離心5min,棄上清液,カロ75%的預冷こ醇，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，即基因組DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速提取禽類血液基因組DNA的方法，其特征在于所述的細胞裂解液的組成是0. 5M EDTA 35-45ml，lM Tris .HCl 6_12ml，5M NaCl 2-6ml, 10% SDS8_12ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速提取禽類血液基因組DNA的方法，其特征在于步驟(I)中抗凝血與細胞裂解液的體積比為I : 50。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速提取禽類血液基因組DNA的方法，其特征在于步驟(I)中蛋白酶K的加入量與抗凝血與細胞裂解液所形成混合液的比值為I : 125。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速提取禽類血液基因組DNA的方法，其特征在于步驟(3)中こ醇的加入量占總體積的70% -90%。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速提取禽類血液基因組DNA的方法，其特征在于步驟(5)中使NaAc的含量為O. 1-0. 2mol/L，預冷的こ醇的濃度達到70%以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速提取禽類血液基因組DNA的方法，包括以下步驟(1)取抗凝血，將其與細胞裂解液混合形成混合液，向混合液中加入蛋白酶K；(2)在55-65℃的溫度下，水浴消化3-5小時；(3)加預冷的乙醇，充分混勻；(4)加雙蒸水ddH2O溶解沉淀；10000rpm離心5min，吸上清液到干凈的離心管中；(5)加入4mol/L的NaAc和預冷的乙醇，充分混勻；10000rpm離心5min，棄上清液，加75％的預冷乙醇，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，即基因組DNA。本方法進行禽血基因組DNA提取主要試劑是乙醇，沒有用到酚、氯仿、異戊醇等有毒有害試劑，對操作者和環(huán)境都沒有污染。另外，提取方法簡單，結(jié)果可靠，采用本發(fā)明的方法的提取過程所需要時間在1h以內(nèi)。
文檔編號C12N15/10GK102690805SQ20111039460
公開日2012年9月26日 申請日期2011年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月1日
發(fā)明者龐有志, 張小輝, 王銳, 祁艷霞, 趙淑娟 申請人:河南科技大學