電激轉(zhuǎn)化法選育高溫型阿魏菇的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及食用菌品種培育【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種電激轉(zhuǎn)化法選育高溫型阿魏菇的方法，其包括第一步阿魏菇原生質(zhì)體制備及再生體系的建立、第二步外源基因的獲得、第三步電激法將外源基因?qū)氚⑽汗皆|(zhì)體、第四步篩選優(yōu)良再生菌株、第五步轉(zhuǎn)化子的鑒定。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明獲得了生長速度快、不需低溫刺激仍能正常出菇的高溫型阿魏菇新種質(zhì)，其出菇溫度為溫度白天25℃，夜間17℃，并且出菇時間提前了30天。在經(jīng)濟(jì)效益上，該發(fā)明有效地改良了阿魏菇的品質(zhì)，不僅縮短了生長周期、節(jié)約了栽培成本，而且可以開展反季節(jié)生產(chǎn)，真正為種植農(nóng)戶增收添磚加瓦。
【專利說明】電激轉(zhuǎn)化法選育高溫型阿魏菇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食用菌品種培育【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種電激轉(zhuǎn)化法選育高溫型阿魏菇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]阿魏菇(Wmr0ferulae)中文學(xué)名為準(zhǔn)噶爾阿魏側(cè)耳，是一種低溫型菇類，要求空氣新鮮，適宜冬暖夏涼地域的潮濕環(huán)境栽培。菌絲生長的最適溫度為25°C至28°C，在35°C至36°C時菌絲停止生長。阿魏菇子實體分化溫度在0°C至15°C，子實體在5°C至18°C均可生長，以在13°C至15°C時生長較快且菇質(zhì)好。阿魏菇必須經(jīng)過低溫刺激才能通過生理成熟，否則難以出菇。阿魏菇菌絲生3段養(yǎng)料含水量應(yīng)在60%至70%。子實體生長發(fā)育時要求空氣相對濕度保持在85%至95%。目前，除新疆、北京外，國內(nèi)其它地方也有栽培。但由于阿魏菇是一種中低溫型食用菌。胡清秀提出充分發(fā)菌后的菌袋于4°C低溫處理數(shù)天再進(jìn)行出菇管理，否則必須經(jīng)過2個月以上的菌絲后熟才能出菇。菌絲滿袋后仍需要30天至40天后熟培養(yǎng)才能進(jìn)行催蕾出菇。由此可見，阿魏菇原基的形成需要低溫刺激的作用，如果阿魏菇不通過低溫(春化階段)處理，會造成出菇率低，很少能同時出菇。烏魯木齊周邊阿魏菇種植戶每年因要對阿魏菇進(jìn)行低溫刺激，把阿魏菇菌袋運(yùn)至天山冰川生產(chǎn)。這都給人工栽培帶來了更多的資金投入和生產(chǎn)難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供了一種電激 轉(zhuǎn)化法選育高溫型阿魏菇的方法，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，其不但可開展反季節(jié)生產(chǎn)，而且能夠有效的縮短常規(guī)阿魏菇栽培的生成周期，降低生產(chǎn)成本。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下措施來實現(xiàn)的:一種電激轉(zhuǎn)化法選育高溫型阿魏菇的方法，其特征在于按下述步驟進(jìn)行:
第一步，阿魏菇原生質(zhì)體制備及再生體系的建立:對選取的阿魏菇進(jìn)行接種，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)菇種；采用酶解法制備原生質(zhì)體，獲得較純的原生質(zhì)體后，鏡檢，用血球計數(shù)板計數(shù)；其最佳制備原生質(zhì)體的條件為:在0.6 mol/L KCl穩(wěn)滲劑條件下，菌齡為8天的阿魏菇菌絲體0.1 g在0.8 ml混合酶解液中制備原生質(zhì)體,該混合酶解液為含1.5%離析酶、0.5%纖維素酶、2%溶菌酶的水溶液，35 °C酶解3 h獲得原生質(zhì)體達(dá)5X IO6個/ml，涂布于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，其最佳條件為:在0.8 mol/L蔗糖穩(wěn)滲劑下，原生質(zhì)體再生時間為16天，其再生率可達(dá)0.6% ；
第二步，外源基因的獲得，提取平菇總DNA:稱取平菇子實體放入已冷凍的研缽中，加入2%的PVP，倒入適量液氮，研磨材料，然后加入ImlCTAB混合，該CTAB為含DTT50 μ L /ml的水溶液；倒入已加入100 μ L氯仿/辛醇的EP管中；晃動EP管，放入65°C水浴鍋中30min，接著室溫放置15min ；EP管中加氯仿/辛醇到1.5mL，輕輕混勻，13000rpm離心7min ;取上清液放入干凈EP管中，加入冰的無水乙醇；樣品放在冰上或-20°C，不要晃動，最后出現(xiàn)絮狀沉淀；13000rpm離心7min ;棄去上清液，75%酒精/0.2M NaAc ImL洗滌沉淀2次，醇揮發(fā)后放入加無菌水和RNA酶，溶解，_20°C保存?zhèn)溆?；?.8%瓊脂糖電泳檢測DNA的純度；用分光光度計對DNA進(jìn)行紫外掃描，測260nm、280nm的吸收值，計算出DNA的濃度，最后用無菌水把DNA濃度稀釋到I U g/ U L ;
第三歩，電激法將外源基因?qū)氚⑽汗皆|(zhì)體:用lmol/L的山梨醇將純化的原生質(zhì)體稀釋至2X IO5個/ml置于42°C浮浴5min，再向低溫處理過的2mL的電激杯加入300 u L的原生質(zhì)體溶液和20 ii L平菇DNA，采用ECM630電激系統(tǒng)，在1600V條件下電激，取出電激杯冰浴靜止10分鐘至15分鐘，涂布于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，25°C黑暗培養(yǎng)，2周后，將出現(xiàn)的菌落進(jìn)行篩選實驗；
第四歩，篩選優(yōu)良再生菌株:將第三步獲得的菌落、未電激的阿魏菇菌絲和平菇菌絲進(jìn)行生長臨界溫度篩選實驗；未電激的阿魏菇菌絲在32°C時菌絲停止生長甚至死亡，平菇在32°C時菌絲能正常生長，并且第三中的菌落同樣能夠生長，篩選出能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株；將能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株繼續(xù)培養(yǎng)，測定生長速度，將生長速度明顯高于受體菌株的再進(jìn)行復(fù)篩；培養(yǎng)6天至7天，分別對單菌落進(jìn)行鏡檢，有鎖狀聯(lián)合特征的菌株視為ー個轉(zhuǎn)化子；
第五步，轉(zhuǎn)化子的鑒定:1)酯酶同エ酶分析采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法；2)纖維素酶活力測定采用3，5- 二硝基水楊酸法；3) RAPD分析；最終，確定含有外源平菇DNA插入的轉(zhuǎn)化子，得到高溫型阿魏菇菌株。
[0005]對上述本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)ー步進(jìn)行如下的選擇或/和優(yōu)化:
將上述高溫型阿魏菇菌株在白天溫度為25°C、夜間溫度為17°C的現(xiàn)有公知的阿魏菇生長環(huán)境中進(jìn)行出菇試驗，90天能正常出菇。
[0006]本發(fā)明的積極效果 是:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首先建立了高效的阿魏菇原生質(zhì)體制備與再生體系，為植物的分子修飾提供良好的受體；同時，建立了電激法遺傳轉(zhuǎn)化體系，其操作簡單方便，沒有化學(xué)物質(zhì)對原生質(zhì)體的傷害，確保了外源基因的整合，使得轉(zhuǎn)基因株系具有優(yōu)良的生物學(xué)特性；經(jīng)過臨界生長溫度的篩選，并結(jié)合分子生物學(xué)檢測手段，有效驗證了外源基因的整合，獲得了生長速度快，不需低溫刺激仍能正常出菇的高溫型阿魏菇新種質(zhì)，其出菇溫度為溫度白天25°C，夜間17°C，并且出菇時間提前了 30天。在經(jīng)濟(jì)效益上，該發(fā)明有效地改良了阿魏菇的品質(zhì)，不僅縮短了生長周期、節(jié)約了栽培成本，而且可以開展反季節(jié)生產(chǎn)，真正為種植農(nóng)戶增收添磚加瓦。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]附圖1是本發(fā)明的工作原理圖。
[0008]附圖2是制備的阿魏菇原生質(zhì)體。此圖為阿魏菇菌絲酶解后獲得原生質(zhì)體形態(tài)圖，圖中阿魏菇原生質(zhì)體體積較大，數(shù)目多，有利原生質(zhì)體的收集，為電激轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。
[0009]附圖3是再生的阿魏菇菌絲。經(jīng)過酶解的原生質(zhì)體，其細(xì)胞壁都受到不同程度的破壞，將其涂布于含有穩(wěn)定劑的再生培養(yǎng)基中，有效維持了原生質(zhì)體內(nèi)部滲透壓的穩(wěn)定性，使得原生質(zhì)體得以較好的恢復(fù)，為后期轉(zhuǎn)基因株系的篩選提供物質(zhì)保障。
[0010]附圖4是獲得的優(yōu)良轉(zhuǎn)化菌株。轉(zhuǎn)化菌株與野生型菌株生長速度的對比，轉(zhuǎn)化菌株的生長速度是野生型菌株生長速度的3-4倍。[0011]附圖5是優(yōu)良菌株的出菇結(jié)果圖。轉(zhuǎn)化菌株與野生型菌株出菇實驗對比，兩者之間在形態(tài)上無差異。
【具體實施方式】
[0012]本發(fā)明不受下述實施例的限制，可依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案和實際情況來確定具體的實施方式。 [0013]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0014]實施例1，如附圖1至5所示，該電激轉(zhuǎn)化法選育高溫型阿魏菇的方法按下述步驟進(jìn)行:
第一步，阿魏菇原生質(zhì)體制備及再生體系的建立:對選取的阿魏菇進(jìn)行接種，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)菇種；采用酶解法制備原生質(zhì)體，獲得較純的原生質(zhì)體后，鏡檢，用血球計數(shù)板計數(shù)；其最佳制備原生質(zhì)體的條件為:在0.6 mol/L KCl穩(wěn)滲劑條件下，菌齡為8天的阿魏菇菌絲體0.1 g在0.8 ml混合酶解液中制備原生質(zhì)體,該混合酶解液為含1.5%離析酶、0.5%纖維素酶、2%溶菌酶的水溶液，35 °C酶解3 h獲得原生質(zhì)體達(dá)5X IO6個/ml，涂布于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，其最佳條件為:在0.8 mol/L蔗糖穩(wěn)滲劑下，原生質(zhì)體再生時間為16天，其再生率可達(dá)0.6% ；以上阿魏菇原生質(zhì)體制備與再生體系的建立，為后期電激轉(zhuǎn)化提供了堅實基礎(chǔ)；
第二步，外源基因的獲得，提取平菇總DNA:稱取平菇子實體放入已冷凍的研缽中，加入2%的PVP，倒入適量液氮，研磨材料，然后加入ImlCTAB (含DTT50 μ L /ml現(xiàn)用現(xiàn)配已配好DTT1M)混合，該CTAB為含DTT50 μ L /ml的水溶液；倒入已加入100 μ L氯仿/辛醇的EP管中；晃動EP管，放入65°C水浴鍋中30min，接著室溫放置15min ;EP管中加氯仿/辛醇到1.5mL,輕輕混勻，13000rpm離心7min ;取上清液放入干凈EP管中，加入冰的無水乙醇；樣品放在冰上或_20°C，不要晃動，最后出現(xiàn)絮狀沉淀；13000rpm離心7min，棄去上清液，75%酒精/0.2M NaAc ImL洗滌沉淀2次，醇揮發(fā)后放入加無菌水和RNA酶，溶解，_20°C保存?zhèn)溆?；?.8%瓊脂糖電泳檢測DNA的純度；用分光光度計對DNA進(jìn)行紫外掃描，測260nm、280nm的吸收值，計算出DNA的濃度，最后用無菌水把DNA濃度稀釋到I μ g/M I;
第三步，電激法將外源基因?qū)氚⑽汗皆|(zhì)體:用lmol/L的山梨醇將純化的原生質(zhì)體稀釋至2X IO5個/ml置于42°C浮浴5min，再向低溫處理過的2mL的電激杯加入300 μ L的原生質(zhì)體溶液和20 μ L平菇DNA，采用ECM630電激系統(tǒng)，在1600V條件下電激，取出電激杯冰浴靜止10分鐘至15分鐘，涂布于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，25°C黑暗培養(yǎng)，2周后，將出現(xiàn)的菌落進(jìn)行篩選實驗；
第四步，篩選優(yōu)良再生菌株:將第三步獲得的菌落、未電激的阿魏菇菌絲和平菇菌絲進(jìn)行生長臨界溫度篩選實驗；未電激的阿魏菇菌絲在32°C時菌絲停止生長甚至死亡，平菇在32°C時菌絲能正常生長，并且第三中的菌落同樣能夠生長，篩選出能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株；將能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株繼續(xù)培養(yǎng)，測定生長速度，將生長速度明顯高于受體菌株的再進(jìn)行復(fù)篩；培養(yǎng)6天至7天，分別對單菌落進(jìn)行鏡檢，有鎖狀聯(lián)合特征的菌株視為一個轉(zhuǎn)化子；
第五步，轉(zhuǎn)化子的鑒定:1)酯酶同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法；2)纖維素酶活力測定采用3，5- 二硝基水楊酸法；3) RAPD分析；最終，確定含有外源平菇DNA插入的轉(zhuǎn)化子，得到高溫型阿魏菇菌株。
[0015]實施例2，與實施例1的不同之處在于:將上述實施例1所得的高溫型阿魏菇菌株在白天溫度為25°C、夜間溫度為17°C的現(xiàn)有公知的阿魏菇生長環(huán)境中進(jìn)行出菇試驗(與現(xiàn)有公知的阿魏菇生產(chǎn)方法相同)，使出菇時間提前30天，由120天提前到90天。其中進(jìn)棚到原基出現(xiàn)15天左右,幼燕到成燕5-7天。
[0016]本 發(fā)明中:除另有規(guī)定外，百分比％的單位都為質(zhì)量百分比。
【權(quán)利要求】
1.ー種電激轉(zhuǎn)化法選育高溫型阿魏菇的方法，其特征在于按下述步驟進(jìn)行: 第一歩，阿魏菇原生質(zhì)體制備及再生體系的建立:對選取的阿魏菇進(jìn)行接種，進(jìn)ー步擴(kuò)大培養(yǎng)菇種；采用酶解法制備原生質(zhì)體，獲得較純的原生質(zhì)體后，鏡檢，用血球計數(shù)板計數(shù)；其最佳制備原生質(zhì)體的條件為:在0.6 mol/L KCl穩(wěn)滲劑條件下，菌齡為8天的阿魏菇菌絲體0.1 g在0.8 ml混合酶解液中制備原生質(zhì)體,該混合酶解液為含1.5%離析酶、0.5%纖維素酶、2%溶菌酶的水溶液，35で酶解3 h獲得原生質(zhì)體達(dá)5X IO6個/ml，涂布于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，其最佳條件為:在0.8 mol/L蔗糖穩(wěn)滲劑下，原生質(zhì)體再生時間為16天，其再生率可達(dá)0.6% ； 第二步，外源基因的獲得，提取平菇總DNA:稱取平菇子實體放入已冷凍的研缽中，カロ入2%的PVP，倒入適量液氮，研磨材料，然后加入ImlCTAB混合，該CTAB為含DTT50 u L /ml的水溶液；倒入已加入100 ii L氯仿/辛醇的EP管中；晃動EP管，放入65 °C水浴鍋中30min，接著室溫放置15min ；EP管中加氯仿/辛醇到1.5mL,輕輕混勻，13000rpm離心7min ;取上清液放入干凈EP管中，加入冰的無水こ醇；樣品放在冰上或-20°C，不要晃動，最后出現(xiàn)絮狀沉淀；13000rpm離心7min ;棄去上清液，75%酒精/0.2M NaAc ImL洗滌沉淀2次，醇揮發(fā)后放入加無菌水和RNA酶，溶解，_20°C保存?zhèn)溆茫挥?.8%瓊脂糖電泳檢測DNA的純度；用分光光度計對DNA進(jìn)行紫外掃描，測260nm、280nm的吸收值，計算出DNA的濃度，最后用無菌水把DNA濃度稀釋到I U g/ U L ; 第三歩，電激法將外源基因?qū)氚⑽汗皆|(zhì)體:用lmol/L的山梨醇將純化的原生質(zhì)體稀釋至2X IO5個/ml置于42°C浮浴5min，再向低溫處理過的2mL的電激杯加入300 u L的原生質(zhì)體溶液和20 ii L 平菇DNA，采用ECM630電激系統(tǒng)，在1600V條件下電激，取出電激杯冰浴靜止10分鐘至15分鐘，涂布于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，25°C黑暗培養(yǎng)，2周后，將出現(xiàn)的菌落進(jìn)行篩選實驗； 第四歩，篩選優(yōu)良再生菌株:將第三步獲得的菌落、未電激的阿魏菇菌絲和平菇菌絲進(jìn)行生長臨界溫度篩選實驗；未電激的阿魏菇菌絲在32°C時菌絲停止生長甚至死亡，平菇在32°C時菌絲能正常生長，并且第三中的菌落同樣能夠生長，篩選出能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株；將能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株繼續(xù)培養(yǎng)，測定生長速度，將生長速度明顯高于受體菌株的再進(jìn)行復(fù)篩；培養(yǎng)6天至7天，分別對單菌落進(jìn)行鏡檢，有鎖狀聯(lián)合特征的菌株視為ー個轉(zhuǎn)化子； 第五步，轉(zhuǎn)化子的鑒定:1)酯酶同エ酶分析采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法；2)纖維素酶活力測定采用3，5- 二硝基水楊酸法；3) RAPD分析；最終，確定含有外源平菇DNA插入的轉(zhuǎn)化子，得到高溫型阿魏菇菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電激轉(zhuǎn)化法選育高溫型阿魏菇的方法，其特征在于將高溫型阿魏菇菌株在白天溫度為25°C、夜間溫度為17°C的現(xiàn)有公知的阿魏菇生長環(huán)境中進(jìn)行出菇試驗，90天能正常出菇。
【文檔編號】C12N1/15GK103602599SQ201110398232
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2011年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月5日
【發(fā)明者】曾衛(wèi)軍, 孫藝鐸, 祝長青, 曹興芹, 李學(xué)斌, 王勇, 遲慶杰, 劉鳳衛(wèi) 申請人:新疆師范大學(xué), 烏魯木齊高鑫博淵生物科技有限公司