專利名稱：一種具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物及其生產(chǎn)方法與它的用途的制作方法
一種具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物及其生產(chǎn)方法與它的用途技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)。更具體地，本發(fā)明涉及一種利用解淀粉類芽孢桿菌 (Paenibacillus amylolyticus)發(fā)酵生產(chǎn)含有7，8_ 二氫-β -紫羅蘭醇發(fā)酵物的方法，還涉及根據(jù)所述方法制備得到的含有7，8-二氫-β -紫羅蘭醇的發(fā)酵物及其作為煙用香料的用途。背景技術(shù)：
植物花朵、茶葉、葡萄、玫瑰及煙草物質(zhì)中，普遍存在紫羅蘭醇及紫羅蘭酮(C13降戊二烯類)等香味衍生物。該類衍生物通常由類胡蘿卜素如胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃素、蝦青素等前體物質(zhì)經(jīng)過氧化裂變反應(yīng)生成。在香料工業(yè)生產(chǎn)過程中，紫羅蘭醇和紫羅蘭酮是重要的人工合成香料之一，紫羅蘭酮進(jìn)一步還原可得到紫羅蘭醇。根據(jù)紫羅蘭酮雙鍵位置的變化，主要分α和β兩種異構(gòu)體，兩者均具有柏木香味，稀釋后具有紫羅蘭的香味。 紫羅蘭酮的香氣甚為優(yōu)雅、柔和，在化妝品和食品香精中應(yīng)用很廣。此外，紫羅蘭酮還廣泛應(yīng)用于煙草、食品及飼料添加劑，是很重要的工業(yè)原料。
紫羅蘭醇及紫羅蘭酮被廣泛應(yīng)用于卷煙行業(yè)中。據(jù)報(bào)道，紫羅蘭醇酯類物質(zhì)在煙燃吸狀態(tài)下可發(fā)生裂解反應(yīng)，因此在煙氣中有一種致香物質(zhì)——巨豆三烯酮。巨豆三烯酮對(duì)卷煙的香氣起著重要的作用，已成為評(píng)判卷煙優(yōu)劣的一項(xiàng)重要指標(biāo)。由此可見，紫羅蘭醇等物質(zhì)的裂解是煙草香味物質(zhì)形成的重要途徑，將該類香氣前體物質(zhì)作為料液直接加到煙草中，可顯著改善煙草香氣品質(zhì)。
目前，紫羅蘭醇及紫羅蘭酮制備方法主要是工業(yè)合成法，該方法工業(yè)合成收率僅為25 %，且合成原料價(jià)格昂貴不易采購(gòu)。此外，植物提取法設(shè)備成本高昂，提取率極低，考慮到紫羅蘭醇的工業(yè)生成條件、生產(chǎn)成本、原料采購(gòu)價(jià)格等因素，本申請(qǐng)人首次嘗試采用微生物發(fā)酵法制備一種具有紫羅蘭香氣的物質(zhì)，為香精行業(yè)提供一種新型煙用香料。
發(fā)明內(nèi)容
[發(fā)明要解決的問題]
本發(fā)明的目的是提供一種具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物的制備方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供采用所述生產(chǎn)方法得到的具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物作為煙用香料的用途
[技術(shù)方案]
本發(fā)明涉及一種具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物的生產(chǎn)方法。
所述生產(chǎn)方法包括以下步驟
Α、種子培養(yǎng)
使用酵母浸膏、NaCl、葡萄糖、蛋白胨、微量元素液與去離子水制備含有酵母浸膏 4-6g/L、NaCl 25_32g/L、葡萄糖 0. 1-0. 4g/L、蛋白胨 8_15g/L、微量元素液 1. OmL/L 的種子培養(yǎng)基；所述的微量元素液是含有H3BO3 3. Og/L, MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2Η200· 03g/L、ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L 的水溶液；
把所述種子培養(yǎng)基加到培養(yǎng)瓶中，用無(wú)機(jī)堿將該種子培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至弱堿性，然后滅菌，再接入以所述種子培養(yǎng)基體積計(jì)0. 1-5%解淀粉類芽孢桿菌(Paenibacillus amylolyticus)BM-B-;MO，然后在室溫下培養(yǎng)80-120小時(shí)，得到種子液；
B、搖瓶發(fā)酵
使用酵母浸膏、NaCl、蛋白胨、葉黃素、上述微量元素液與去離子水制備含有酵母浸膏 5. 0-5. 5g/L、NaCl 25_32g/L、蛋白胨 8. 5-12. Og/L、葉黃素 180_200mg/L、微量元素液 1. OmL/L的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基；
把所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基加到培養(yǎng)瓶中，用無(wú)機(jī)堿將該搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至弱堿性，然后滅菌，再在室溫下接入在步驟A得到的種子培養(yǎng)基，接種量是以所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)5-10%，在50-80rpm搖床中在溫度下培養(yǎng)80_120h，得到發(fā)酵液；
C、分離
將步驟B得到的發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，往其上清液中加入以所述上清液體積計(jì) 1 1有機(jī)溶劑，在室溫下進(jìn)行振蕩萃取，分離得到的有機(jī)相進(jìn)行揮干，得到具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物。
根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的無(wú)機(jī)堿是NaOH、KOH或Ca (OH)20
根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟A與B中，所述弱堿性pH值是 7. 2-7. 4。
根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟C中，所述有機(jī)溶劑選自正己烷、氯仿、丙酮、乙醚、四氯化碳和/或石油醚。
根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟C中，有機(jī)相揮干是吹氮法、真空減壓法或蒸餾法。
本發(fā)明還涉及采用所述方法得到的具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物，其特征在于它含有 60. 0-70. Omg/L 7，8-二氫-β -紫羅蘭醇。
根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物中的7，8_ 二氫- β -紫羅蘭醇是采用下述分析方法測(cè)定的
準(zhǔn)確吸取0. 1 μ L含有7，8_ 二氫- β -紫羅蘭醇的二氯甲烷溶液進(jìn)行氣-質(zhì)聯(lián)用分析；
HP 5890ΙΙ型氣相色譜分析條件為石英毛細(xì)管柱20-Μ、柱長(zhǎng)30m、膜厚1 μ m ；升溫程序50°C保持5min，以升溫速度4°C /min升溫至200°C，在這個(gè)溫度下保持25min ；進(jìn)樣口溫度 200°C ；
HP 5945A型質(zhì)譜分析條件為EI源、電離電壓70eV、離子源溫度200°C、接口溫度 200°C，檢測(cè)器電壓1KV，全范圍掃描；
然后，準(zhǔn)確稱取所述發(fā)酵物l.Omg，用二氯甲烷定容至100 μ L，得到待分析樣品； 準(zhǔn)確吸取0. 1 μ L樣品按照與上述相同條件進(jìn)行氣-質(zhì)聯(lián)用分析；
這些測(cè)定結(jié)果通過下式計(jì)算得到步驟Α)中樣品溶液中7，8_ 二氫-β-紫羅蘭醇的含量
7，8_二氫-β-紫羅蘭醇含量(mg/L) = 7，8_ 二氫-β -紫羅蘭醇質(zhì)量 (mg) /0. 1 μ L
本發(fā)明還涉及所述具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物作為煙用香料的用途。
下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
本發(fā)明涉及一種具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物的生產(chǎn)方法。
所述生產(chǎn)方法包括以下步驟
Α、種子培養(yǎng)
使用酵母浸膏、NaCl、葡萄糖、蛋白胨、微量元素液與去離子水制備含有酵母浸膏 4-6g/L、NaCl 25_32g/L、葡萄糖 0. 1-0. 4g/L、蛋白胨 8_15g/L、微量元素液 1. OmL/L 的種子培養(yǎng)基。
把所述種子培養(yǎng)基加到培養(yǎng)瓶中，用無(wú)機(jī)堿將該種子培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至弱堿性，然后滅菌，再接入以所述種子培養(yǎng)基體積計(jì)0. 1-5%解淀粉類芽孢桿菌(Paenibacillus amylolyticus)BM-B-340，然后在室溫下培養(yǎng)80-120小時(shí)，得到種子液。
本發(fā)明使用的解淀粉類芽孢桿菌(PaenikiciIlus amylolyticus)BM-B-340是從市場(chǎng)上購(gòu)買得到的，是墨西哥hvestigaciones Biomedicas研究所菌物工業(yè)保藏中心 (IIBM-UNAM)保藏的。
解淀粉類芽孢桿菌BM-B-340的形態(tài)學(xué)特征是
該菌株屬于芽孢桿菌，從土壤中分離得到，細(xì)胞呈直桿狀，0. 5 2. 5 μ mX 1. 2 10 μ m，以成對(duì)或鏈狀排列，具圓端或方端。細(xì)胞染色呈現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性。好氧或兼性厭氧，具有對(duì)熱、PH和鹽各種多樣性的生理特性，具發(fā)酵或呼吸代謝類型。
所述的微量元素液是含有H3BO3 3. Og/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、 C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H20 0. 03g/L、ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L 的水溶液。
在本發(fā)明中，C4H4KNaO6 · 4H20都應(yīng)該理解是四水合酒石酸鉀鈉。
需要指出的是，當(dāng)微量元素液中的某一種成分的含量超過或低于上述含量時(shí)并不會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，只是有可能影響培養(yǎng)效果或效率。微量元素液的配制對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是不存在的任何困難的，在此不作贅述。
B、搖瓶發(fā)酵
使用酵母浸膏、NaCl、蛋白胨、葉黃素、上述微量元素液與去離子水制備含有酵母浸膏 5. 0-5. 5g/L、NaCl 25_32g/L、蛋白胨 8. 5-12. Og/L、葉黃素 180_200mg/L、微量元素液 1. 0mL/L的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基；
把所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基加到培養(yǎng)瓶中，用無(wú)機(jī)堿將該搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至弱堿性，然后滅菌，再在室溫下接入在步驟A)得到的種子培養(yǎng)基，接種量是以所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)5-10%，在50-80rpm搖床中在溫度下培養(yǎng)80_120h，得到發(fā)酵液。
步驟A)與B)中，所述的滅菌是將自然環(huán)境中各種細(xì)菌(包括芽孢桿菌)及真菌滅活。
該步驟使用的搖床是在本技術(shù)領(lǐng)域里通常使用的搖床，例如上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司銷售的以商品名HYG-II恒溫調(diào)速搖床。
由于發(fā)酵培養(yǎng)物中含有光敏性物質(zhì)，因此為避免這些物質(zhì)見光分解，使用的培養(yǎng)瓶應(yīng)用鋁箔進(jìn)行避光。
C、分離
將步驟B)得到的發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，往其上清液中加入以所述上清液體積計(jì) 1 1有機(jī)溶劑，在室溫下進(jìn)行振蕩萃取，分離得到的有機(jī)相進(jìn)行揮干，得到具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物。
在上述生產(chǎn)方法中，用于調(diào)節(jié)pH值的無(wú)機(jī)堿是NaOH、KOH或Ca (OH)20
優(yōu)選地，在步驟A)與B)中所述弱堿性pH值是7. 2-7. 4。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，步驟(3)中的有機(jī)溶劑選自正己烷、氯仿、丙酮、乙醚、四氯化碳和/或石油醚。
更優(yōu)選地，有機(jī)溶劑選自正己烷、丙酮、四氯化碳和/或石油醚。
優(yōu)選地，在步驟(3)中有機(jī)溶劑的揮干是選自吹氮法、真空減壓法或蒸餾法。
所述的吹氮法是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法，即采用諸如Turbo Vap自動(dòng)濃縮儀方法。
所述的真空減壓法是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法，即在真空度 0. 06-0. OSMPa下進(jìn)行減壓蒸去有機(jī)溶劑。
所述的蒸餾法也是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法，即水浴加熱蒸餾方法。
經(jīng)過多種分析技術(shù)確認(rèn)，采用本發(fā)明生產(chǎn)方法得到的具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物含有7，8- 二氫-β -紫羅蘭醇，其含量是60. 0-70. Omg/L。
在本發(fā)明中，具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物都應(yīng)該理解是一種含有60. 0-70. Omg/L 7， 8- 二氫-β -紫羅蘭醇的發(fā)酵物。當(dāng)然，7，8- 二氫-β -紫羅蘭醇含量或高些或低些也都應(yīng)該認(rèn)為是本發(fā)明的具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物。
所述的具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物還含有少量的其它紫羅蘭衍生物，例如 2. 5-2. 7mg/L 7，8- 二氫-β -紫羅蘭酮，0. 7-0. 8mg/L β -紫羅蘭酮。
具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物中的7，8- 二氫-β -紫羅蘭醇是采用下述分析方法測(cè)定的。所述分析方法包括以下步驟
準(zhǔn)確吸取0. 1 μ L含有7，8_ 二氫- β -紫羅蘭醇的二氯甲烷溶液進(jìn)行氣-質(zhì)聯(lián)用分析；
HP 5890ΙΙ型氣相色譜分析條件為石英毛細(xì)管柱20-Μ、柱長(zhǎng)30m、膜厚1 μ m ；升溫程序50°C保持5min，以升溫速度4°C /min升溫至200°C，在這個(gè)溫度下保持25min ；進(jìn)樣口溫度 200°C ；
HP 5945A型質(zhì)譜分析條件為EI源、電離電壓70eV、離子源溫度200°C、接口溫度 200°C，檢測(cè)器電壓1KV，全范圍掃描；
然后，準(zhǔn)確稱取所述發(fā)酵物l.Omg，用二氯甲烷定容至100 μ L，得到待分析樣品； 準(zhǔn)確吸取0. 1 μ L樣品按照與上述相同條件進(jìn)行氣-質(zhì)聯(lián)用分析；
這些測(cè)定結(jié)果通過下式計(jì)算得到步驟Α)中樣品溶液中7，8_ 二氫-β-紫羅蘭醇的含量
7，8_ 二氫-β -紫羅蘭醇含量(mg/L) = 7，8_ 二氫-β -紫羅蘭醇質(zhì)量 (mg) /0. 1 μ L
本發(fā)明還提供根據(jù)上述生產(chǎn)方法制備得到具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物作為煙用香料的用途。
具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物作為煙用香料的用途應(yīng)該理解是，在煙草制品可以含有以該煙草制品總重量計(jì)0. 01-0. 10%本發(fā)明的具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物。
在本發(fā)明中，所述的煙草制品是卷煙、雪茄煙、煙絲或復(fù)烤煙葉。
可以依照常規(guī)加香工藝程序?qū)⒈景l(fā)明的具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物噴灑在煙絲或涂布在煙草薄片上，然后在恒溫恒濕箱中平衡45-50小時(shí)，再打煙或切絲打煙制成煙支，最后進(jìn)行感官評(píng)吸鑒定。
所述的感官評(píng)吸鑒定方法是由本公司即華寶香精香料公司的五位煙用調(diào)香師組成評(píng)定小組，采用暗評(píng)方法，按照本公司建立的香氣質(zhì)、量、諧調(diào)、雜氣、刺激、勁頭和余味六項(xiàng)指標(biāo)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)定，以便比較現(xiàn)有香精與本發(fā)明的具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物對(duì)煙草制品品質(zhì)的影響。
本發(fā)明的具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物能夠非常顯著地提升煙草制品的品質(zhì)。
[有益效果]
本發(fā)明方法采用微生物生物轉(zhuǎn)化葉黃素生產(chǎn)新型煙用香料，含有7，8_ 二氫-β-紫羅蘭醇的具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物，該發(fā)酵物產(chǎn)品具有天然煙草植物的香氣。與目前煙用香料紫羅蘭酮相比，該產(chǎn)品香氣更清雅、獨(dú)特、柔和。本發(fā)明方法將改變紫羅蘭醇酮系列產(chǎn)品依靠低效的化學(xué)合成局面，填補(bǔ)生物轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)的空白，市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值良好。
具體實(shí)施方式
下面將通過實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1 制備具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物
制備步驟如下
Α、種子培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基組成是酵母浸膏5. Og/L、NaCl 30. Og/L、葡萄糖0. 2g/L、蛋白胨 10. Og/L、微量元素液1. OmL/L ；其中微量元素液組成是H3BO3 3. Og/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H20 0. 03g/L、ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L、其余為去離子水。
把80mL所述種子培養(yǎng)基加到培養(yǎng)瓶中，攪拌成均一的培養(yǎng)基溶液。用NaOH水溶液將該種子培養(yǎng)基的PH值調(diào)節(jié)至pH = 7. 2，用去離子水補(bǔ)加至IOOmL,棉花塞口，在15psig 與溫度121°C的條件下進(jìn)行滅菌15min，再接入以所述種子培養(yǎng)基體積計(jì)解淀粉類芽孢桿菌I^aenibacillus amylolyticus ΒΜ-Β- ΜΟ，然后在室溫下培養(yǎng)90小時(shí)，得到種子液；
B、搖瓶發(fā)酵
以葉黃素取代葡萄糖作為碳源，其發(fā)酵培養(yǎng)基組成是酵母浸膏5. 5g/L、NaCl 30. 0g/L、蛋白胨10. 0g/L、葉黃素190. 0mg/L、微量元素液1. 0mL/L ；微量元素液組成是H3BO3 3. 0g/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H20 0. 03g/L、 ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H200. 04g/L ；
把所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基300mL加到培養(yǎng)瓶中，用NaOH水溶液將該發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至PH = 7. 2，然后在15psig與溫度121°C的條件下進(jìn)行滅菌15min，再在室溫下接入在步驟A得到的種子培養(yǎng)基，接種量是以所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)10%，在60rpm搖床中在溫度^TC下培養(yǎng)96h，得到發(fā)酵液；
為了避免葉黃素(類胡蘿卜素)見光分解，培養(yǎng)瓶應(yīng)用鋁箔遮光。
C、分離
將步驟B)得到的發(fā)酵液進(jìn)行離心(離心力MOOg)分離20min，再往其上清液中加入以所述上清液體積計(jì)1 1有機(jī)溶劑(有機(jī)溶劑是丙酮、乙醚與石油醚混合物，其比例是以體積計(jì)1 1 1)，在溫度20°c下萃取lOmin，然后分離含有7，8_ 二氫-β-紫羅蘭醇的有機(jī)相，它再進(jìn)行揮干，得到具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物，其發(fā)酵物進(jìn)行下述分析。
D、產(chǎn)物分析
準(zhǔn)確吸取0. 1 μ L含有7，8_ 二氫- β -紫羅蘭醇的二氯甲烷溶液進(jìn)行氣-質(zhì)聯(lián)用分析；
HP 5890ΙΙ型氣相色譜分析條件為石英毛細(xì)管柱20-Μ、柱長(zhǎng)30m、膜厚1 μ m ；升溫程序50°C保持5min，以升溫速度4°C /min升溫至200°C，在這個(gè)溫度下保持25min ；進(jìn)樣口溫度 200°C ；
HP 5945A型質(zhì)譜分析條件為EI源、電離電壓70eV、離子源溫度200°C、接口溫度 200°C，檢測(cè)器電壓1KV，全范圍掃描；
然后，準(zhǔn)確稱取該實(shí)施例制備的發(fā)酵物1. Omg，用二氯甲烷定容至ΙΟΟμ L，得到待分析樣品；再準(zhǔn)確吸取0. 1 μ L其樣品按照與上述相同條件進(jìn)行氣-質(zhì)聯(lián)用分析；
這些測(cè)定結(jié)果通過下式計(jì)算得到步驟Α)中樣品溶液中7，8_ 二氫-β-紫羅蘭醇的含量
7，8_二氫-β-紫羅蘭醇含量(mg/L) = 7，8_ 二氫-β -紫羅蘭醇質(zhì)量 (mg) /0. 1 μ L
檢測(cè)得出該實(shí)施例發(fā)酵物含有65. 2mg/L7,8- 二氫- β -紫羅蘭醇。
采用常規(guī)加香工藝程序?qū)⒈緦?shí)施例制備的發(fā)酵物噴灑在煙絲上，然后在恒溫恒濕箱中平衡48小時(shí)，再制成煙支，進(jìn)行感官評(píng)吸鑒定。
所述的感官評(píng)吸鑒定方法是由本公司即華寶香精香料公司的五位煙用調(diào)香師組成評(píng)定小組，采用暗評(píng)方法，按照本公司建立的香氣質(zhì)、量、諧調(diào)、雜氣、刺激、勁頭和余味六項(xiàng)指標(biāo)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)定。
確定7，8_ 二氫-β-紫羅蘭醇具有增加煙草獨(dú)特的本草香作用，顯著增強(qiáng)卷煙的香氣質(zhì)，同時(shí)降低雜氣，余味舒適干凈。
實(shí)施例2 制備具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物
制備步驟如下
Α、種子培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基組成是酵母浸膏5. Og/L, NaCl 30. 0g/L,葡萄糖0. 2g/L，蛋白胨 10. 0g/L,微量元素液 1. 0mL/L ；微量元素液配制=H3BO3 3. 0g/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H20 0. 03g/L、ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L、其余為去離子水，
把IOOmL所述種子培養(yǎng)基置于培養(yǎng)瓶中，攪拌成均一的培養(yǎng)基液。用NaOH水溶液將該種子培養(yǎng)基的PH值調(diào)節(jié)至7. 3，用去離子水補(bǔ)加至150mL，棉花塞口，在15psig與溫度121°C的條件下滅菌15min，再接入以所述種子培養(yǎng)基體積計(jì)2%解淀粉類芽孢桿菌 (Paenibacillus amylolyticus)ΒΜ-Β- ΜΟ，然后在室溫下培養(yǎng)110小時(shí)，得到種子液；
B、搖瓶發(fā)酵
以葉黃素取代葡萄糖作為碳源，其培養(yǎng)基組成酵母浸膏5. 2g/L，NaC130. Og/L, 蛋白胨8. 5g/L，葉黃素195. Omg/L，微量元素液1. OmL/L ；微量元素液配制=H3BO3 3. 0g/L、 MgSO4 1. 8g/L,FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 ·4Η201· 77g/L、CuCl2 ·2Η20 0· 03g/L、ZnCl2 0. 02g/ L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L ；
把所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基400mL加到培養(yǎng)瓶中，用NaOH水溶液將該發(fā)酵培養(yǎng)基的pH 值調(diào)節(jié)至7. 2，然后在15psig與溫度121°C的條件下進(jìn)行滅菌15min，再在室溫下接入在步驟A)得到的種子培養(yǎng)基，接種量是以所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)10%，在60rpm搖床中在溫度^TC下培養(yǎng)105h，得到發(fā)酵液；
為了避免葉黃素(類胡蘿卜素)見光分解，培養(yǎng)瓶應(yīng)用鋁箔遮光。
C、分離
將步驟B)得到的發(fā)酵液進(jìn)行離心(離心力MOOg)分離20min，再往其上清液中加入以所述上清液體積計(jì)1 1有機(jī)溶劑(有機(jī)溶劑是丙酮、乙醚與石油醚混合物，其比例是以體積計(jì)1 1 1)，在溫度20°c下進(jìn)行液-液萃取20min，然后分離含有7，8_ 二氫-β-紫羅蘭醇的有機(jī)相，它再進(jìn)行揮干，得到具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物，其發(fā)酵物進(jìn)行下述分析。
D、產(chǎn)物分析
準(zhǔn)確吸取0. 1 μ L含有7，8_ 二氫- β -紫羅蘭醇的二氯甲烷溶液進(jìn)行氣-質(zhì)聯(lián)用分析；
HP 5890ΙΙ型氣相色譜分析條件為石英毛細(xì)管柱20-Μ、柱長(zhǎng)30m、膜厚Ιμπι;升溫程序50°C保持5min，以升溫速度4°C /min升溫至200°C，在這個(gè)溫度下保持25min ；進(jìn)樣口溫度 200°C ；
HP 5945A型質(zhì)譜分析條件為EI源、電離電壓70eV、離子源溫度200°C、接口溫度 200°C，檢測(cè)器電壓1KV，全范圍掃描；
然后，準(zhǔn)確本實(shí)施例制備的發(fā)酵物l.Omg，用二氯甲烷定容至IOOyL,得到待分析樣品；再準(zhǔn)確吸取0. 1 μ L其樣品按照與上述相同條件進(jìn)行氣-質(zhì)聯(lián)用分析；
檢測(cè)得出該實(shí)施例發(fā)酵物含有66. 3mg/L7,8- 二氫- β -紫羅蘭醇。
采用實(shí)施例1所述的質(zhì)量評(píng)定方法，確定7，8_ 二氫- β -紫羅蘭醇具有增加煙草獨(dú)特的本草香作用，顯著增強(qiáng)卷煙的香氣質(zhì)，同時(shí)降低雜氣，余味舒適干凈。
實(shí)施例3 制備具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物
制備步驟如下
Α、種子培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基組成是酵母浸膏5. 0g/L, NaCl 30. 0g/L,葡萄糖0. 2g/L，蛋白胨 10. 0g/L,微量元素液 1. 0mL/L ；微量元素液配制=H3BO3 3. 0g/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H20 0. 03g/L、ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L、其余為去離子水，
把IOOmL所述種子培養(yǎng)基置于培養(yǎng)瓶中，攪拌成均一的培養(yǎng)基液。用NaOH水溶液將該種子培養(yǎng)基的PH值調(diào)節(jié)至7. 3，用去離子水補(bǔ)加至150mL，棉花塞口，在15psig與溫度121°C的條件下滅菌15min，再接入以所述種子培養(yǎng)基體積計(jì)3%解淀粉類芽孢桿菌 (Paenibacillus amylolyticus)ΒΜ-Β- ΜΟ，然后在室溫下培養(yǎng)85小時(shí)，得到種子液；
B、搖瓶發(fā)酵
以葉黃素取代葡萄糖作為碳源，其培養(yǎng)基組成酵母浸膏5. 2g/L，NaC130. Og/L, 蛋白胨8. 5g/L，葉黃素195. Omg/L，微量元素液1. OmL/L ；微量元素液配制=H3BO3 3. Og/L、 MgSO4 1. 8g/L,FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 ·4Η201· 77g/L、CuCl2 ·2Η20 0· 03g/L、ZnCl2 0. 02g/ L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L ；
把所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基500mL加到培養(yǎng)瓶中，用NaOH水溶液將該發(fā)酵培養(yǎng)基的pH 值調(diào)節(jié)至7. 2，然后在15psig與溫度121°C的條件下進(jìn)行滅菌15min，再在室溫下接入在步驟A)得到的種子培養(yǎng)基，接種量是以所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)10%，在50rpm搖床中在溫度32°C下培養(yǎng)120h，得到發(fā)酵液；
為了避免葉黃素(類胡蘿卜素)見光分解，培養(yǎng)瓶應(yīng)用鋁箔遮光。
C、分離
將步驟B)得到的發(fā)酵液進(jìn)行離心(離心力MOOg)分離20min，再往其上清液中加入以所述上清液體積計(jì)1 1有機(jī)溶劑(有機(jī)溶劑是丙酮、乙醚與石油醚混合物，其比例是以體積計(jì)1 1 1)，在溫度20°c下萃取8min，然后分離含有7，8_ 二氫-β-紫羅蘭醇的有機(jī)相，它再進(jìn)行揮干，得到具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物，其發(fā)酵物進(jìn)行下述分析。
D、產(chǎn)物分析
準(zhǔn)確吸取0. 1 μ L含有7，8_ 二氫- β -紫羅蘭醇的二氯甲烷溶液進(jìn)行氣-質(zhì)聯(lián)用分析；
HP 5890ΙΙ型氣相色譜分析條件為石英毛細(xì)管柱20-Μ、柱長(zhǎng)30m、膜厚1 μ m ；升溫程序50°C保持5min，以升溫速度4°C /min升溫至200°C，在這個(gè)溫度下保持25min ；進(jìn)樣口溫度 200°C ；
HP 5945A型質(zhì)譜分析條件為EI源、電離電壓70eV、離子源溫度200°C、接口溫度 200°C，檢測(cè)器電壓1KV，全范圍掃描；
然后，準(zhǔn)確稱取該實(shí)施例制備的發(fā)酵物l.Omg，用二氯甲烷定容至IOOyL,得到待分析樣品；再準(zhǔn)確吸取0. 1 μ L其樣品按照與上述相同條件進(jìn)行氣-質(zhì)聯(lián)用分析；
檢測(cè)得出該實(shí)施例發(fā)酵物含有66. 3mg/L7,8- 二氫-β -紫羅蘭醇。
采用實(shí)施例1所述的質(zhì)量評(píng)定方法，確定7，8_ 二氫-β -紫羅蘭醇具有增加煙草獨(dú)特的本草香作用，顯著增強(qiáng)卷煙的香氣質(zhì)，同時(shí)降低雜氣，余味舒適干凈。
實(shí)施例4 制備具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物
制備步驟如下
Α、種子培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基組成是酵母浸膏5. 0g/L, NaCl 30. 0g/L,葡萄糖0. 2g/L，蛋白胨 10. 0g/L,微量元素液 1. 0mL/L ；微量元素液配制=H3BO3 3. 0g/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H20 0. 03g/L、ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L、其余為去離子水，
把80mL所述種子培養(yǎng)基置于培養(yǎng)瓶中，攪拌成均一的培養(yǎng)基液。用NaOH水溶液將該種子培養(yǎng)基的PH值調(diào)節(jié)至7. 3，用去離子水補(bǔ)加至IOOmL,棉花塞口，在15psig與溫度121°C的條件下滅菌15min，再接入以所述種子培養(yǎng)基體積計(jì)5%解淀粉類芽孢桿菌 (Paenibacillus amylolyticus)ΒΜ-Β- ΜΟ，然后在室溫下培養(yǎng)80小時(shí)，得到種子液；
B、搖瓶發(fā)酵
以葉黃素取代葡萄糖作為碳源，其發(fā)酵培養(yǎng)基組成是酵母浸膏5. 5g/L、NaCl 30. Og/L、蛋白胨10. 0g/L、葉黃素190. 0mg/L、微量元素液1. 0mL/L ；微量元素液組成是H3BO3 3. 0g/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H20 0. 03g/L、 ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H200. 04g/L ；
把所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基300mL加到培養(yǎng)瓶中，用NaOH水溶液將該發(fā)酵培養(yǎng)基的pH 值調(diào)節(jié)至7. 2，然后在15psig與溫度121°C的條件下進(jìn)行滅菌15min，再在室溫下接入在步驟A)得到的種子培養(yǎng)基，接種量是以所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)10%，在SOrpm搖床中在溫度下培養(yǎng)85h，得到發(fā)酵液；
為了避免葉黃素(類胡蘿卜素)見光分解，培養(yǎng)瓶應(yīng)用鋁箔遮光。
C、分離
步驟B)得到的發(fā)酵液進(jìn)行離心(離心力MOOg)分離20min，再往其上清液中加入以所述上清液體積計(jì)1 1有機(jī)溶劑(有機(jī)溶劑是丙酮、乙醚與石油醚混合物，其比例是以體積計(jì)1 1 1)，在溫度20°C下萃取20min，然后分離含有7，8_ 二氫-β-紫羅蘭醇的有機(jī)相，它再進(jìn)行揮干，得到具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物，其發(fā)酵物進(jìn)行下述分析。
D、產(chǎn)物分析
準(zhǔn)確吸取0. 1 μ L含有7，8_ 二氫- β -紫羅蘭醇的二氯甲烷溶液進(jìn)行氣-質(zhì)聯(lián)用分析；
HP 5890ΙΙ型氣相色譜分析條件為石英毛細(xì)管柱20-Μ、柱長(zhǎng)30m、膜厚1 μ m ；升溫程序50°C保持5min，以升溫速度4°C /min升溫至200°C，在這個(gè)溫度下保持25min ；進(jìn)樣口溫度 200°C ；
HP 5945A型質(zhì)譜分析條件為EI源、電離電壓70eV、離子源溫度200°C、接口溫度 200°C，檢測(cè)器電壓1KV，全范圍掃描；
然后，準(zhǔn)確稱取該實(shí)施例制備的發(fā)酵物l.Omg，用二氯甲烷定容至IOOyL,得到待分析樣品；再準(zhǔn)確吸取0. 1 μ L其樣品按照與上述相同條件進(jìn)行氣-質(zhì)聯(lián)用分析；
檢測(cè)得出該實(shí)施例發(fā)酵物含有66. 2mg/L7,8- 二氫-β -紫羅蘭醇。
采用實(shí)施例1所述的質(zhì)量評(píng)定方法，確定7，8_ 二氫-β -紫羅蘭醇具有增加煙草獨(dú)特的本草香作用，顯著增強(qiáng)卷煙的香氣質(zhì)，同時(shí)降低雜氣，余味舒適干凈。1權(quán)利要求
1.一種具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的方法包括以下步驟A、種子培養(yǎng)使用酵母浸膏、NaCl、葡萄糖、蛋白胨、微量元素液與去離子水制備含有酵母浸膏4-6g/ L、NaCl 25-32g/L、葡萄糖0. 1-0. 4g/L、蛋白胨8_15g/L、微量元素液1. OmL/L的種子培養(yǎng)基；所述的微量元素液是含有 H3BO3 3. Og/L、MgSO4 1. 8g/L、FeSO4 1. 36g/L、C4H4KNaO6 · 4H20 1. 77g/L、CuCl2 · 2H200. 03g/L、ZnCl2 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 04g/L 的水溶液；把所述種子培養(yǎng)基加到培養(yǎng)瓶中，用無(wú)機(jī)堿將該種子培養(yǎng)基的PH值調(diào)節(jié)至弱堿性， 然后滅菌，再接入以所述種子培養(yǎng)基體積計(jì)0. 1-5%解淀粉類芽孢桿菌I^enibacillus amylolyticus BM-B-MO，然后在室溫下培養(yǎng)80-120小時(shí)，得到種子液；B、搖瓶發(fā)酵使用酵母浸膏、NaCl、蛋白胨、葉黃素、上述微量元素液與去離子水制備含有酵母浸膏 5. 0-5. 5g/L、NaCl 25_32g/L、蛋白胨 8. 5-12. Og/L、葉黃素 180_200mg/L、微量元素液 1. OmL/L的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基；把所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基加到培養(yǎng)瓶中，用無(wú)機(jī)堿將該搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值調(diào)節(jié)至弱堿性，然后滅菌，再在室溫下接入在步驟A得到的種子培養(yǎng)基，接種量是以所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)5-10%，在50-80rpm搖床中在溫度下培養(yǎng)80_120h，得到發(fā)酵液；C、分離將步驟B得到的發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，往其上清液中加入以所述上清液體積計(jì)1 1 有機(jī)溶劑，在室溫下進(jìn)行振蕩萃取，分離得到的有機(jī)相進(jìn)行揮干，得到具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的無(wú)機(jī)堿是NaOH、KOH或Ca(0H)2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟A與B中，所述弱堿性pH值是 7. 2-7. 4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟C中，所述有機(jī)溶劑選自正己烷、氯仿、 丙酮、乙醚、四氯化碳和/或石油醚。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟C中，有機(jī)相揮干是吹氮法、真空減壓法或蒸餾法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述方法得到的具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物，其特征在于它含有60. 0-70. 0mg/L 7，8_ 二氫- β -紫羅蘭醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物，其特征在于7，8_二氫- β -紫羅蘭醇是采用下述分析方法測(cè)定的準(zhǔn)確吸取0. 1 μ L含有7，8- 二氫-β -紫羅蘭醇的二氯甲烷溶液進(jìn)行氣-質(zhì)聯(lián)用分析；HP 5890ΙΙ型氣相色譜分析條件為石英毛細(xì)管柱20-Μ、柱長(zhǎng)30m、膜厚1 μ m ；升溫程序50°C保持5min，以升溫速度4°C /min升溫至200°C，在這個(gè)溫度下保持25min ；進(jìn)樣口溫度 200°C ；HP 5945A型質(zhì)譜分析條件為EI源、電離電壓70eV、離子源溫度200°C、接口溫度 200°C，檢測(cè)器電壓1KV，全范圍掃描；然后，準(zhǔn)確稱取權(quán)利要求6所述產(chǎn)品l.Omg，用二氯甲烷定容至IOOyL,得到待分析樣品；準(zhǔn)確吸取0. 1 μ L樣品按照與上述相同條件進(jìn)行氣-質(zhì)聯(lián)用分析；這些測(cè)定結(jié)果通過下式計(jì)算得到步驟A中樣品溶液中7，8_ 二氫-β-紫羅蘭醇的含量·7，8_ 二氫-β-紫羅蘭醇含量(mg/L) = 7，8_ 二氫-β-紫羅蘭醇質(zhì)量(mg)/0. lyL。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的具有紫羅蘭香氣的發(fā)酵物作為煙用香料的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有紫羅蘭香氣的微生物發(fā)酵物及其制備方法，該方法包括解淀粉類芽孢桿菌Paenibacillus amylolyticus BM-B-340種子培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)與發(fā)酵物分離等步驟。本發(fā)明含7，8-二氫-β-紫羅蘭醇的發(fā)酵物具有天然煙草植物的香氣。與目前煙用香料β-紫羅蘭酮相比，該產(chǎn)品香氣更清雅、獨(dú)特、柔和，因此，將具有非常好的市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102492729SQ201110400140
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日 公開號(hào)201110400140.發(fā)明者袁毅, 谷向春 申請(qǐng)人:華寶食用香精香料(上海)有限公司