專利名稱：一種鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒及由該質(zhì)粒制成的分子佐劑和疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域，特別是一種鴨β -防御素-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒及其使用方法。
背景技術(shù)：
防御素是一類古老的內(nèi)源性抗菌多肽，在動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)體內(nèi)廣泛存在。除具有廣譜抗菌活性外，防御素在機(jī)體的先天性免疫及獲得性免疫中均具有重要作用。體外許多研究表明防御素具有趨化和活化抗原提呈細(xì)胞(APCs)的功能，是天然免疫的重要組成部分，被認(rèn)為是一種很好的內(nèi)源性免疫佐劑。如Tettito等(1989)及Murphy等(1993)的研究證明人α -防御素1，2，3對(duì)單核細(xì)胞具有細(xì)胞趨化活性，對(duì)上皮細(xì)胞及培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞具有促有絲分裂活性。Yang等(1999與2000)研究表明，人上皮β -防御素_1，2對(duì)未成熟樹(shù)狀突細(xì)胞和記憶性T-細(xì)胞具有趨化性；Biragyn等(2001)研究發(fā)現(xiàn)鼠日-防御素_2，3 對(duì)骨髓來(lái)源的未成熟細(xì)胞具有化學(xué)趨化活性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明防御素具有免疫佐劑特性， 可以增強(qiáng)抗原特異性的免疫力。如^iang等(2010)發(fā)現(xiàn)雞β -防御素_1以融合形式與 IBDV VP2基因相連后免疫雞只，能增強(qiáng)VP2特異性抗體水平。Lillard等(1999)研究發(fā)現(xiàn)人α -防御素能顯著增加血清中抗原特異性IgG與IgM的水平；增強(qiáng)抗原特異性CD4+T細(xì)胞的增值與IFN-γ、IL-5、IL-6、IL-10的分泌。Tani等(2000)發(fā)現(xiàn)人α -防御素可以刺激鼠脾臟細(xì)胞的增值及細(xì)胞因子的產(chǎn)生；可以提高小鼠血液IgGl、IgGh、IgG2b抗體水平。對(duì)鴨β -防御素-2在不同組織器官中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)其在脾臟和腎臟組織中均大量表達(dá)，在骨髓中呈中等水平表達(dá)，在心臟和肝臟中僅少量表達(dá)，在其他組織器官中均未檢測(cè)到有表達(dá)。鴨β -防御素-2在脾臟和骨髓的高表達(dá)量，說(shuō)明鴨β -防御素-2是一種髓源性防御素，在內(nèi)源免疫防御中起重要作用。對(duì)鴨防御素-2的生物學(xué)功能研究也表明，體外具有抗菌活性與趨化活性(Soman等，2009)，具備成為一種內(nèi)源性免疫佐劑基礎(chǔ)， 可能在促進(jìn)機(jī)體特異性免疫能力方面具重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種具有鴨β -防御素-2 (AvBD2)所特有的免疫增強(qiáng)作用的、適合在禽類DNA疫苗中使用的鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒及由該質(zhì)粒制成的分子佐劑和疫苗
本發(fā)明的鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒是這樣實(shí)現(xiàn)的，由pcDNA3. 1(+)真核表達(dá)載體、連接在pcDNA3. 1 (+)真核表達(dá)載體上的鴨AvBD2基因片段構(gòu)成，該鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的獲得方法依次包括1、上游引物、下游引物的設(shè)計(jì)過(guò)程；2、鴨AvBD2基因片段的PCR獲取過(guò)程；3、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD-2的構(gòu)建過(guò)程；4、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD-2的制備過(guò)程；
1、上游引物、下游引物的設(shè)計(jì)過(guò)程引物的設(shè)計(jì)及合成是根據(jù)國(guó)內(nèi)外已在GenBank中登錄的鴨AvBD2基因序列經(jīng)多重比較后設(shè)計(jì)而成，并在5’端加入ATG啟動(dòng)子，根據(jù)真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)上的酶切位點(diǎn)，上游引物設(shè)計(jì)去除了前導(dǎo)肽序列處開(kāi)始，并加上/ ^ III酶切位點(diǎn)及2個(gè)保護(hù)性堿基CG ；下游引物設(shè)計(jì)在基因末端，并加上ife // I酶切位點(diǎn)及 2個(gè)保護(hù)性堿基CC，所設(shè)計(jì)的引物序列為
上游引物5’ -cgAAGCTTA^^TATGCGGGACATGTTTCTCTGT-3’ (.Hind III)
下游引物5，-CCGGATCCTACATCCCATGGCGATTTG-3’ (BamHl 酶切位點(diǎn))
2、鴨AvBD2基因的PCR擴(kuò)增過(guò)程以重組質(zhì)粒pMD-18T_AvBD2為模板，加入ExTaqDNA 聚合酶、上游引物、下游引物、dNIPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR的反應(yīng)體系為5yL的10XPCR buffer(10XPCR buffer 包含有 0. 5mmol/L MgC12、50mmol/L KClUOmmol/L Tris(三羥甲基氨基甲烷)*HC1、0. 001wt%明膠)，2μ L的4XdNTPs(4XdNTPs包含有濃度均為2. 5mmol/ L的dATP (三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸)、dTTP (三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸)、dCTP (三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸)和dGTP (三磷酸鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸))，濃度為20ymol/L的0. 5 μ L的上游引物，濃度為20 μ mol/L的0. 5 μ L的下游引物，1 μ L的pMD-18T_AvBD2質(zhì)粒，40. 5 μ L 的ddH20 (雙蒸水)，濃度為5umol/L的0. 5 μ L的Exhq DNA聚合酶，反應(yīng)過(guò)程是a、混合物先在95°C處理:3min ；b、然后在94°C處理30s，再在56°C處理30s，再在72°C處理30s ；反應(yīng)過(guò)程b循環(huán)30次；然后在72°C處理lOmin，重組質(zhì)粒pMD-18T_AvBD2由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系張輝華克隆并保存并保證自申請(qǐng)日起20年內(nèi)向公眾提供；所獲得的鴨AvBD2基因片段核苷酸序列為
atgCGGGACATGTTTCTCTGTAGGAAAGGCTCCTGCCACTTCGGAAGATGTCCCATCCACCTGATCAGAGTTG GAAGCTGCTTTGGGTTCCGCTCCTGCTGCAAATCGCCATGGGATGTATAA ；
PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，見(jiàn)到約120bp的擴(kuò)增條帶，表明已擴(kuò)增到目標(biāo)產(chǎn)物；
3、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1 (+) _AvBD2的構(gòu)建過(guò)程將過(guò)程2的鴨AvBD2基因片段的PCR產(chǎn)物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE溶解，TE 包含有 10mmol/L Tris · HCl 禾Π lmmol/L EDTA (乙二胺四乙酸)，TE 溶解物用 ^aaY !,HincI III進(jìn)行雙酶切處理，膠回收約120bp左右的條帶；以同樣的方法對(duì)pcDNA3. 1(+)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，膠回收5. 4kb左右的DNA片斷，分別取5 μ L雙酶切后膠回收的鴨AvBD2基因片段和3 μ L雙酶切后膠回收的pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒，加入IyL的IOX1M DNA連接Buffer (10XT4 DNA 連接 Buffer 包含有 0. 5mol/L Tris ‘ HCl, 0. lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT (二硫蘇糖醇)，5mmol/L DATP(三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸)，0. 25mg/mL BSA(牛血清白蛋白))， IuL T4 DNA連接酶，在16°C下連接處理18小時(shí)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)18小時(shí)；pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒為hvitrogen公司的產(chǎn)
P
PR，
a、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. l(+)-AvBD2的雙酶切鑒定在含有氨芐青霉素的LB平板上挑取單個(gè)的白色菌落，接種于3ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C振搖培養(yǎng)18小時(shí)，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切鑒定；將鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3. 1⑴-AvBD2分別用及 /7 l.Hind III進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，pcDNA3. 1 (+)-AvBD2雙酶切后產(chǎn)生約5. 4kb和120bp左右的兩條帶，證明已經(jīng)成功構(gòu)建了鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；b、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2的PCR鑒定在含有氨芐青霉素的 LB平板上挑取單個(gè)白色菌落，接種于3ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)18小時(shí)，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定；以質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR的反應(yīng)體系為10XPCR Buffer 5 μ L， 4XdNTPs (2. 5mmol/L) 2μ L，上、下游引物(20ymol/L)各 0· 5 μ L，pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 質(zhì) 1 μ L, ddH20 40. 5 μ L, ExTaq DNA 聚合酶(5umol/L) 0· 5 μ L ；反應(yīng)過(guò)程為a、95°C 處理 !3min ;b、然后 94°C 30s,56°C 30s,72°C 30s ；反應(yīng)過(guò)程 b 循環(huán) 30 次，然后 72°C延伸 lOmin， PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見(jiàn)約120bp的擴(kuò)增條帶，證明已經(jīng)成功構(gòu)建了鴨 AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；
4、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2的制備過(guò)程從過(guò)程3的LB固體培養(yǎng)平板中挑取單個(gè)白色菌落，接種于盛有IOml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C震蕩過(guò)夜培養(yǎng)以獲得菌種，然后在500ml的三角瓶中加入IOOml的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入2ml的菌種，在37°C， 以200rpm/min速度搖晃，培養(yǎng)18h，然后用常規(guī)提取質(zhì)粒的堿裂解方法對(duì)500ml三角瓶中的培養(yǎng)物進(jìn)行質(zhì)粒的大量抽提，用硅藻土吸附法進(jìn)行純化即可獲得鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3. l(+)-AvBD2。本發(fā)明的由鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1⑴_(tái)AvBD2制成的分子佐劑是這樣實(shí)現(xiàn)的，將鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2用PBS緩沖液稀釋成lmg/ml 即可。由鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2制成的疫苗是這樣實(shí)現(xiàn)的，將鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2用PBS緩沖液稀釋成lmg/ml，然后與禽DNA 疫苗混合即可。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，由于是選用了鴨AvBD2基因片段與真核表達(dá)載體連接來(lái)作為免疫增強(qiáng)劑，因此，具有鴨AvBD2所特有的免疫增強(qiáng)效果的、適合與禽DNA疫苗一起使用的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述
本發(fā)明的鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒是這樣實(shí)現(xiàn)的，由pcDNA3. 1(+)真核表達(dá)載體、連接在pcDNA3. 1 (+)真核表達(dá)載體上的鴨AvBD2基因片段，該鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的獲得方法依次包括1、上游引物、下游引物的設(shè)計(jì)過(guò)程；2、鴨AvBD2基因片段的PCR獲取過(guò)程；3、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. l(+)-AvBD2的構(gòu)建過(guò)程；4、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2的制備過(guò)程；
1、上游引物、下游引物的設(shè)計(jì)過(guò)程引物的設(shè)計(jì)及合成是根據(jù)國(guó)內(nèi)外已在GenBank中登錄的鴨AvBD2基因序列經(jīng)多重比較后設(shè)計(jì)而成，并在5’端加入ATG啟動(dòng)子，根據(jù)真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)上的酶切位點(diǎn)，上游引物設(shè)計(jì)在去除了前導(dǎo)肽序列處開(kāi)始，并加上/ ^ III酶切位點(diǎn)及2個(gè)保護(hù)性堿基CG ；下游引物設(shè)計(jì)在基因末端，并加上ife // I酶切位點(diǎn)及 2個(gè)保護(hù)性堿基CC，所設(shè)計(jì)的引物序列為
上游引物5’ -cgMGCTT^CTATGCGGGACATGTTTCTCTGT-3' (Hind III) 下游引物5，-CCGGATCCTACATCCCATGGCGATTTG-3’ (BamH I 酶切位點(diǎn))
2、鴨AvBD2基因的PCR擴(kuò)增過(guò)程以重組質(zhì)粒pMD-18T_AvBD2為模板，加入ExTaqDNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR的反應(yīng)體系為5μ L的10XPCR buffer (10 XPCR buffer 包含有 0. 5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl, lOmmol/L Tris · HC1， 0. 001% 明膠)，2 μ L 的 4X dNTPs (4X dNTPs 包含有濃度均為 2. 5mmol/L 的 dATP, dTTP, dCTP, dGTP)，0. 5μ L 的上游引物(20 μ mol/L)，0. 5 μ L 的下游引物(20 μ mol/L)，1 μ L 的 pMD-18T-AvBD2質(zhì)粒，40. 5μ L 的 ddH20(雙蒸水)，0. 5 μ L 的 ExTaq DNA 聚合酶(5umol/L)， 反應(yīng)過(guò)程是a、混合物先在95°C處理:3min ；b、然后在94°C處理30s，再在56°C處理30s，再在72°C處理30s ；反應(yīng)過(guò)程b循環(huán)30次；然后在72°C處理lOmin，重組質(zhì)粒pMD-18T_AvBD2 由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系張輝華克隆并保存；所獲得的鴨AvBD2基因片段核苷酸序列為
atgCGGGACATGTTTCTCTGTAGGAAAGGCTCCTGCCACTTCGGAAGATGTCCCATCCACCTGATCAGAGTTG GAAGCTGCTTTGGGTTCCGCTCCTGCTGCAAATCGCCATGGGATGTATAA ；
PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，見(jiàn)到約120bp的擴(kuò)增條帶，表明已擴(kuò)增到目標(biāo)產(chǎn)物；
3、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1 (+) -AvBD2的構(gòu)建過(guò)程將過(guò)程2的鴨AvBD2 基因片段的PCR產(chǎn)物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE (TE 包含有 10mmol/L Tris · HCl, lmmol/L EDTA)溶解，TE 溶解物用 BatnH l.Hind III 進(jìn)行雙酶切處理，膠回收約120bp左右的條帶；以同樣的方法對(duì)pcDNA3. 1(+)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，膠回收5. 4kb左右的DNA片斷，分別取5 μ L雙酶切后膠回收的鴨AvBD2基因片段和 3yL雙酶切后膠回收的pcDNA3. 1(+)質(zhì)粒，加入IyL的10XT4 DNA連接BuffeK 10X T4 DNA 連接 Buffer 包含有 0. 5mol/L Tris · HCl，0. lmol/L MgC12, 50mmol/L DTT,5mmol/L DATP,0. 25mg/mL BSA)，1 μ L T4 DNA連接酶，在16°C下連接處理18小時(shí)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)18小時(shí)；pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒為 Invitrogen公司的產(chǎn)品
a、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.l(+)-AvBD2的雙酶切鑒定在含有氨芐青霉素的LB平板上挑取單個(gè)的白色菌落，接種于3ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C振搖培養(yǎng)18小時(shí)，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切鑒定；將鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3. 1⑴-AvBD2分別用及 /7 l.Hind III進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，pcDNA3. 1 (+)-AvBD2雙酶切后產(chǎn)生約5. 4kb和120bp左右的兩條帶，證明已經(jīng)成功構(gòu)建了鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；
b、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)-AvBD2的PCR鑒定在含有氨芐青霉素的 LB平板上挑取單個(gè)白色菌落，接種于3ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)18小時(shí)，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定；以質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR的反應(yīng)體系為10XPCR Buffer 5 μ L， 4X dNTPs (2. 5mmol/L) 2 μ L,上、下游引物(20 μ mol/L)各 0· 5 μ L，pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 質(zhì)
1 μ L, ddH20 40. 5 μ L, ExTaq DNA 聚合酶(5umol/L) 0· 5 μ L ；反應(yīng)過(guò)程為a、95°C處理 !3min ;b、然后 94°C 30s,56°C 30s,72°C 30s ；反應(yīng)過(guò)程 b 循環(huán) 30 次，然后 72°C延伸 lOmin， PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見(jiàn)約120bp的擴(kuò)增條帶，證明已經(jīng)成功構(gòu)建了鴨 AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；
4、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1 (+) -AvBD2的制備過(guò)程從過(guò)程3的LB固體培養(yǎng)平板中挑取單個(gè)白色菌落，接種于盛有IOml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C震蕩過(guò)夜培養(yǎng)以獲得菌種，然后在500ml的三角瓶中加入IOOml的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入2ml的菌種，在37°C， 以200rpm/min速度搖晃，培養(yǎng)18h，然后用常規(guī)提取質(zhì)粒的堿裂解方法對(duì)500ml三角瓶中的培養(yǎng)物進(jìn)行質(zhì)粒的大量抽提，用硅藻土吸附法進(jìn)行純化即可獲得鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3. l(+)-AvBD2。本發(fā)明過(guò)程中使用的限制性內(nèi)切酶及 /7 !,Hind III、T4DNA連接酶、ExTaq DNA 聚合酶等均購(gòu)自廣州寶泰克生物科技有限公司。本發(fā)明的由鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3. l(+)-AvBD2制成的分子佐劑是這樣實(shí)現(xiàn)的，將鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2用PBS緩沖液稀釋成lmg/ml 即可。本發(fā)明由鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3. l(+)-AvBD2制成的疫苗是這樣實(shí)現(xiàn)的，將鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) _AvBD2用PBS緩沖液稀釋成lmg/ml，然后與禽DNA疫苗混合即可。用該分子佐劑pcDNA3. l(+)-AvBD2與禽流感病毒DNA疫苗(AIV HA DNA疫苗)聯(lián)合應(yīng)用，免疫AIV HA血清抗體陰性雞只，通過(guò)檢測(cè)血清AIV HA特異性抗體值、血液IL_4、IL_6 和INF-Y變化水平；同時(shí)分離淋巴細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)；并于免疫后17d 和31d測(cè)免疫器官指數(shù)(包括法氏囊、胸腺和脾臟指數(shù))，以評(píng)價(jià)其對(duì)禽流感病毒DNA疫苗 (AIV HA DNA疫苗)的免疫增強(qiáng)作用。60只14日齡健康雞，隨機(jī)分成3組，每組20只，飼養(yǎng)在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院家禽研究室。免疫兩次，第一次免疫后10天進(jìn)行二免。第一組為PBS組(免疫劑量為0. 15ml)，第二組為AIV HA DNA疫苗組(免疫劑量為150 μ g)，第三組為AIV HA DNA疫苗組(免疫劑量為150 μ g) + pcDNA3. 1 (+) _AvBD2 (免疫劑量為150 μ g)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)第二組與第三組雞只血清HA特異性抗體水平及IL-4、IL-6及INF- Y細(xì)胞因子水平隨免疫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在Md時(shí)達(dá)到最高水平，31d時(shí)開(kāi)始下降；并且自從一免后的17d開(kāi)始，第三組血清HA特異性抗體水平及IL-4、IL-6及INF-Y細(xì)胞因子水平顯著高于第二組。第一組血清撤特異性抗體水平及11^-4、11^-6及1順-^細(xì)胞因子水平一直變化不大，顯著低于第二與第三組。免疫后第17 d、31 d，法氏囊、胸腺和脾臟指數(shù)，第三組均顯著高于第二組與第一組，第二組顯著高于第一組。外周血T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，隨著時(shí)間增加，三個(gè)組均呈下降趨勢(shì)，但在各個(gè)日齡第三組顯著高于第二組與第一組，第二組顯著高于第一組。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分子佐劑pcDNA3. l(+)-AvBD2對(duì)AIV HA DNA疫苗具有很好的免疫增強(qiáng)作用。
權(quán)利要求
1. 一種鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于由pcDNA3. 1(+)真核表達(dá)載體、連接在pcDNA3. 1 (+)真核表達(dá)載體上的鴨AvBD2基因片段構(gòu)成，該鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的獲得方法依次包括1、上游引物、下游引物的設(shè)計(jì)過(guò)程；2、鴨AvBD2基因片段的PCR獲取過(guò)程；3、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD-2的構(gòu)建過(guò)程；4、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD-2的制備過(guò)程；(1)上游引物、下游引物的設(shè)計(jì)過(guò)程引物的設(shè)計(jì)及合成是根據(jù)國(guó)內(nèi)外已在GenBank中登錄的鴨AvBD2基因序列經(jīng)多重比較后設(shè)計(jì)而成，并在5’端加入ATG啟動(dòng)子，根據(jù)真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)上的酶切位點(diǎn)，上游引物設(shè)計(jì)去除了前導(dǎo)肽序列處開(kāi)始，并加上/ ^ III酶切位點(diǎn)及2個(gè)保護(hù)性堿基CG ；下游引物設(shè)計(jì)在基因末端，并加上ife // I酶切位點(diǎn)及 2個(gè)保護(hù)性堿基CC，所設(shè)計(jì)的引物序列為上游引物5，-cgAAGCTTA^^TATGCGGGACATGTTTCTCTGT-3’ Hind III，下游引物5，-CCGGATCCTACATCCCATGGCGATTTG-3’ BamHl 酶切位點(diǎn)，(2)鴨AvBD2基因的PCR擴(kuò)增過(guò)程以重組質(zhì)粒pMD-18T_AvBD2為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNIPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR的反應(yīng)體系為5 μ L的10 X PCR buffer, 2 μ L的4Χ dNTPs，濃度為20 μ mol/L的0. 5 μ L的上游引物，濃度為20 μ mol/L的 0. 5 μ L 的下游引物，1 μ L 的 pMD-18T-AvBD2 質(zhì)粒，40. 5 μ L 的 ddH20,濃度為 5umol/L 的 0. 5μ L 的 ExTaq DNA 聚合酶，10XPCR buffer 包含有 0. 5mmol/L MgC12、50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris ·Ηα、0. 001wt% 明膠，4X dNIPs 包含有濃度均為 2. 5mmol/L 的 dATP、dTTP、 dCTP和dGTP，反應(yīng)過(guò)程是a、混合物先在95°C處理^iin ；b、然后在94°C處理30s，再在 56°C處理30s，再在72°C處理30s ；反應(yīng)過(guò)程b循環(huán)30次；然后在72°C處理lOmin，所獲得的鴨AvBD2基因片段核苷酸序列為atgCGGGACATGTTTCTCTGTAGGAAAGGCTCCTGCCACTTCGGAAGATGTCCCATCCACCTGATCAGAGTTG GAAGCTGCTTTGGGTTCCGCTCCTGCTGCAAATCGCCATGGGATGTATAA ；PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，見(jiàn)到約120bp的擴(kuò)增條帶，表明已擴(kuò)增到目標(biāo)產(chǎn)物；(3)鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1 (+) -AvBD2的構(gòu)建過(guò)程將過(guò)程2的鴨AvBD2 基因片段的PCR產(chǎn)物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE溶解， TE 包含有 10mmol/L Tris 'HCl 禾Π lmmol/L EDTA, TE 溶解物用 ^aaY l.Hind III 進(jìn)行雙酶切處理，膠回收約120bp左右的條帶；以同樣的方法對(duì)pcDNA3. 1(+)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理， 膠回收5. 4kb左右的DNA片斷，分別取5 μ L雙酶切后膠回收的鴨AvBD2基因片段和3 μ L 雙酶切后膠回收的pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒，加入IyL的10ΧΤ4 DNA連接Buffer，1 μ L T4 DNA 連接酶，在16°C下連接處理18小時(shí)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)18小時(shí)，10XT4 DNA連接Buffer包含有0. 5mol/L Tris · HCl、 0. lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT、5mmol/L DATP、0. 25mg/mL BSA ；a、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. l(+)-AvBD2的雙酶切鑒定在含有氨芐青霉素的LB平板上挑取單個(gè)的白色菌落，接種于3ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 3 7 °C振搖培養(yǎng)18小時(shí)，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切鑒定；將鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3. 1 (+) -AvBD2分別用及 /7 l.Hind III進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，pcDNA3. 1 (+)-AvBD2雙酶切后產(chǎn)生約5. 4kb和120bp左右的兩條帶，證明已經(jīng)成功構(gòu)建了鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；b、鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2的PCR鑒定在含有氨芐青霉素的 LB平板上挑取單個(gè)白色菌落，接種于3ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)18小時(shí)，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定；以質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR的反應(yīng)體系為10XPCR Buffer 5 μ L， 4XdNTPs (2. 5mmol/L) 2μ L，上、下游引物(20ymol/L)各 0· 5 μ L，pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 質(zhì) 1 μ L, ddH20 40. 5 μ L, ExTaq DNA 聚合酶(5umol/L) 0· 5 μ L ；反應(yīng)過(guò)程為a、95°C 處理 !3min ;b、然后 94°C 30s,56°C 30s,72°C 30s ；反應(yīng)過(guò)程 b 循環(huán) 30 次，然后 72°C延伸 lOmin， PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見(jiàn)約120bp的擴(kuò)增條帶，證明已經(jīng)成功構(gòu)建了鴨 AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；(4)鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2的制備過(guò)程從過(guò)程3的LB固體培養(yǎng)平板中挑取單個(gè)白色菌落，接種于盛有IOml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C震蕩過(guò)夜培養(yǎng)以獲得菌種，然后在500ml的三角瓶中加入IOOml的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入2ml的菌種，在 37°C，以200rpm/min速度搖晃，培養(yǎng)18h，然后用常規(guī)提取質(zhì)粒的堿裂解方法對(duì)500ml三角瓶中的培養(yǎng)物進(jìn)行質(zhì)粒的大量抽提，用硅藻土吸附法進(jìn)行純化即可獲得鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3. 1 (+) -AvBD2。
2.由鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1 (+) -AvBD2制成的分子佐劑，其特征在于將權(quán)利要求1所述的鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2用PBS緩沖液稀釋成 lmg/ml 艮阿。
3.由鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.l(+)-AvBD2制成的疫苗，其特征在于將權(quán)利要求1所述的鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2用PBS緩沖液稀釋成Img/ ml，然后與禽DNA疫苗混合即可。
全文摘要
一種鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒及由該質(zhì)粒制成的分子佐劑和疫苗其特征在于鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒由pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體、連接在pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體上的鴨AvBD2基因片段構(gòu)成，由該質(zhì)粒制成的分子佐劑是將鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-AvBD2用PBS緩沖液稀釋成1mg/ml即可，疫苗是將鴨AvBD2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-AvBD2用PBS緩沖液稀釋成1mg/ml，然后與禽DNA疫苗混合即可。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有鴨β-防御素-2(AvBD2)所特有的免疫增強(qiáng)作用的、適合在禽類DNA疫苗中使用的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102433353SQ20111040078
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者張輝華, 李辰, 畢英佐, 謝青梅, 韓小鳳, 馬保華, 馬靜云 申請(qǐng)人:佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院