專利名稱：一種Bt蛋白Cry69Aa1、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種Bt蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在人類生產(chǎn)過程中，蟲害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失及影響人類健康的重要因素，據(jù)FAO 統(tǒng)計(jì)，全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)每年因蟲害造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)14%，病害損失達(dá)12%，草害損失達(dá)11%。損失額高達(dá)1260億美元，相當(dāng)于中國農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的一半，英國的4倍多。另外， 蚊媒病在預(yù)防醫(yī)學(xué)中占有重要位置，其中登革熱和黃熱病等蚊媒病傳播力強(qiáng)、流行面廣、發(fā)病率高、危害性大。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全世界每年感染登革熱人數(shù)多達(dá)8000萬，我國的海南省在 1980和1986年曾經(jīng)暴發(fā)過兩次登革熱，發(fā)病分別達(dá)到437469例和113589例。登革熱和黃熱病主要由埃及伊蚊傳播。為了減少這些損失，多年來，對農(nóng)作物害蟲及蚊蟲普遍采用化學(xué)防治手段進(jìn)行防治，但由于化學(xué)農(nóng)藥的長期、大量使用，造成了對環(huán)境的污染，農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量增加， 給人類的生存和健康帶來了危害。此外，化學(xué)農(nóng)藥在殺滅害蟲的同時(shí)，也殺傷了天敵及其它有益物，破壞了生態(tài)平衡。與化學(xué)防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特點(diǎn)。并且避免了化學(xué)防治帶來的一系列問題。因此，生物防治技術(shù)成了人們研究的熱點(diǎn)。在生物殺蟲劑中，蘇云金芽孢桿菌是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的一類微生物殺蟲劑。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時(shí)可形成具有殺蟲活性的由蛋白質(zhì)組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白Gnsectididal crystal proteins，簡稱ICPs)，ICPs是由cry基因編碼的，對敏感昆蟲有強(qiáng)烈毒性，而對高等動物和人無毒性。近幾十年來，Bt已廣泛應(yīng)用于控制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲。此外，Bt還對膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種害蟲及植物病原線蟲、螨類、原生動物有控害作用。目前在農(nóng)田害蟲、森林害蟲及衛(wèi)生害蟲的防治中Bt已成為化學(xué)合成農(nóng)藥的有力替代品，Bt還是轉(zhuǎn)基因抗蟲工程植物重要的基因來源。自1981印f從菌株HD-I中克隆了第一個(gè)能表達(dá)殺蟲活性的基因以來 (Adang M. J et al，Gene，1985，36 (3) :289 300.)，人們已經(jīng)分離克隆了 500 多種編碼殺蟲晶體蛋白的基因，根據(jù)編碼的氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類(Crickmore N, et al. Microbiol Mol Biol Rev，1998，62 :807-813.)。一般而言， Cryl，Cry2和Cry9等毒蛋白對鱗翅目害蟲有效；其中研究的最多的是Cryl和Cry9類蛋白， 它們編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為130-140kD，許多基因目前已被廣泛應(yīng)用于植物的鱗翅目害蟲的防治(Kozie，Μ. G.，et al. Bio/Technology, 1993,11 :194-200 ；王飛，2001，碩士論文，南開大學(xué)·)°蘇云金芽胞桿菌以色列亞禾中(B. thuringiensis subsp. israelensis, 簡稱Bti)產(chǎn)生的毒素蛋白對蚊蟲具有很好殺蟲活性，被廣泛運(yùn)用于蚊蟲的防治(Goldberg L J, et al. Mosqito News，37 :355-358.)。同時(shí)，Cyt蛋白具有溶細(xì)胞性，對某些Cry蛋白具有增效作用及延緩昆蟲的抗性(Wu, D.，et al. Mol. Microbiol. 13 :965-972.)。
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自本世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)蘇云金芽胞桿菌至今已有100多年的歷史，在農(nóng)作物和園藝植物害蟲、森林害蟲以及衛(wèi)生害蟲的防治方面得到廣泛的應(yīng)用，也起到良好的效果。但是，由于大規(guī)模和反復(fù)使用蘇云金芽胞桿菌，許多昆蟲種群已相繼在不同程度上對殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生了抗性。以Bt殺蟲晶體蛋白為基礎(chǔ)的殺蟲劑的使用已有50多年的歷史，最初一直沒有檢測到昆蟲對Bt的抗性，但是，上世紀(jì)80年中期開始，抗性問題不斷在實(shí)驗(yàn)室及田間試驗(yàn)中得到證實(shí)(McGaughey, W. H. 1985. Science. 229 :193-195)，原因主要是持續(xù)使用單品種及亞致劑量的Bt以及Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的應(yīng)用造成昆蟲種群長期受到殺蟲劑的選擇壓力。 1985 年，McGaughey 報(bào)道倉庫谷物害蟲印度谷螟(Plodia interpunctella)在 Dipel (Bt subsp. kurstaik HD-I的商品制劑)的選擇壓力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高劑量選擇壓力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次證實(shí)大田中的小菜蛾對Bt 殺蟲劑產(chǎn)生了明顯的抗性(Tabashnik，B. Ε.，et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 4120-4124)，上世紀(jì)90年代以來，在我國應(yīng)用Bt殺蟲劑時(shí)間較長的深圳、廣州、上海等地， 發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲劑對小菜蛾防治效果明顯下降，意味著抗性已經(jīng)形成(馮夏.1996.昆蟲學(xué)報(bào)， 39(3) =238-244 ’)。目前發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室及田間至少有十幾種昆蟲對Bt及其殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生了抗性，用選擇壓力數(shù)學(xué)模型預(yù)測到，在Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物選擇壓力的條件下，昆蟲將會產(chǎn)生抗性(Schn印f，Ε.，et al. Mol. Biol. Rev. 65(3) :775-806)。另外，有研究證明 Bti 在大田的使用中尚未發(fā)現(xiàn)抗性問題(Regis L，et al. ,2000. Instituto Oswaldo Cruz,95 207-210.)，但是蚊蟲對其抗性問題不斷在實(shí)驗(yàn)室中得到證實(shí)，這種情況也可能會在大田中出現(xiàn)(Georghiou G P, and Wirth M C, 1997. Applied and Environmental Microbiology, 63 :1095-1101.)。為避免抗性昆蟲所造成的損失，尋找新的高毒力基因資源是解決這個(gè)問題的有效途徑，這對我國的生物防治有著十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于針對上述不足提供一種新的Bt毒力蛋白資源。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供編碼所述蛋白的基因。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供上述蛋白及基因的應(yīng)用。本發(fā)明從四川省沐川原始森林地區(qū)土壤中分離得到的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)新菌株此觀。該菌株已于2008年10月21日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)，保藏號為CGMCC No. 2719。(該菌株的保藏證明及其保藏號已經(jīng)在專利號為200910078894. 5專利上公開)通過對Μα8的毒力測試表明，Μα8對鱗翅目害蟲、雙翅目害蟲等等，均具有極高的毒力。從MC^S基因組及質(zhì)粒測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)該菌株存在一個(gè)新的cry基因，進(jìn)一步設(shè)計(jì)其全長基因引物，克隆得到cry69Aal基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示，全長為3651bp，分析表明，GC含量為38. 07%，編碼1216個(gè)氨基酸組成的蛋白。經(jīng)測定，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。在 softberry 網(wǎng)站采用 bacterial sigma 7. Opromoter 程序?qū)θ蛄羞M(jìn)行預(yù)測表明，在基因編碼區(qū)上游含有RNA聚合酶活化位點(diǎn)的序列，將其命名為 cry69Aal。Cry69Aal蛋白的氨基酸組成如表1。
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表1 Cry69Aal蛋白的氨基酸組成
權(quán)利要求
1.一種Bt蛋白Cry69Aal，其氨基酸序列是1)SEQID No. 2所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)載體。
5.由權(quán)利要求4所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞為植物宿主細(xì)胞。
7.含有權(quán)利要求1所述蛋白的殺蟲劑。
8.權(quán)利要求1所述蛋白在植物育種中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述蛋白在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物為農(nóng)作物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的Bt蛋白Cry69Aa1及其編碼基因，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。本發(fā)明蛋白可以用于制備Bt殺蟲劑，所述基因可以轉(zhuǎn)化棉花、玉米、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，使其具備相應(yīng)的抗蟲活性，從而降低農(nóng)藥的使用量，減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/32GK102408474SQ20111040367
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者關(guān)鵬, 朱軍, 李雙成, 李平, 王世全, 鄧其明, 鄭愛萍 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)