專利名稱：一種從成體兔的成熟脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)去分化及誘導(dǎo)分化的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用成體兔的成熟脂肪細(xì)胞去分化為多能干細(xì)胞繼而再分化為心肌樣細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
脂肪組織來(lái)源豐富，取材的方法安全便捷，可以作為一種實(shí)用的以及有前景的間充質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源。脂肪組織內(nèi)含有非脂肪細(xì)胞被稱為間質(zhì)血管化組分(stromal-vascular fraction (SVF))。脂肪組織通過(guò)機(jī)械分離或酶消化(后再經(jīng)過(guò)熒光激活細(xì)胞分選術(shù)或細(xì)胞分選)的方法分離得到SVF.培養(yǎng)的SVF被命名為脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(ASCS/ADSC)。 體內(nèi)外的研究表明人的ADSC細(xì)胞能夠分化成多種細(xì)胞系，如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞(Schaffler and Buchler，2007，Concise review :Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells 25:818-827·)。但是 ADSC 細(xì)胞只占脂肪組織中極少量的部分并且培養(yǎng)的原代及最初幾代的ADSC細(xì)胞為異質(zhì)性的細(xì)胞群，可能混雜有內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞(pericytes)等。因此，仍然需要尋找一種來(lái)源明確并具有高純度的細(xì)胞系。成熟的脂肪細(xì)胞是脂肪組織中最為豐富的細(xì)胞類型。這些成熟的脂肪細(xì)胞在體外通過(guò)特殊的培養(yǎng)條件可獲得一群更原始，并有增殖性的細(xì)胞系，稱為去分化的脂肪細(xì)胞 (DFAT)。DFAT細(xì)胞可從白色脂肪組織(成熟的脂肪組織)中獲取。目前的研究表明，DFAT 細(xì)胞是一群同質(zhì)性的細(xì)胞類型；DFAT細(xì)胞具有丟失脂肪特異性的標(biāo)識(shí)分子，并獲得多能性的特性，通過(guò)一定的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法可以分化為多種間質(zhì)細(xì)胞系，具有成骨、成脂、成軟骨、成肌的能力。到目前為止，DFAT細(xì)胞已從人、大鼠、小鼠中獲取。但是培養(yǎng)的具體方法各異。 有研究表明白脂肪細(xì)胞與心血管細(xì)胞有密切的關(guān)系，以及脂肪細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞。并且，Medet Jumabay等用小鼠的DFAT培養(yǎng)出自發(fā)搏動(dòng)的心肌樣細(xì)胞(Medet Jumabay,2009, Spontaneously beating cardiomyocytes derived from white mature adipocytes. Cardiovascular Research 85，17-27)0目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)兔的DFAT細(xì)胞系的建立以及向心肌樣細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從成體兔的成熟脂肪細(xì)胞培養(yǎng)兔的去分化的脂肪細(xì)胞(DFAT)，并誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞。本發(fā)明技術(shù)方案的關(guān)鍵在于如何簡(jiǎn)單的方法獲取兔的DFAT細(xì)胞并誘導(dǎo)成為心肌樣細(xì)胞。本發(fā)明選用的兔是常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在心臟甚至是心的傳導(dǎo)束系統(tǒng)中是目前所研究的動(dòng)物中最多的一種，也是最為典型的動(dòng)物之一。并且，相對(duì)于小鼠來(lái)講，兔是一種較大的哺乳動(dòng)物，與人的關(guān)系更為接近，用兔作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用其脂肪組織培養(yǎng)誘導(dǎo)出心肌樣細(xì)胞，將會(huì)是對(duì)人的心臟干細(xì)胞或者心臟組織工程治療方面提供有力的支持。
本發(fā)明提供了一種從成體兔的成熟脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的方法，如圖 1所示，具體步驟如下
1、分離出成體兔的白色脂肪組織；
可取成體兔腹股溝處白色脂肪組織(或其他皮下脂肪組織)。將其用0. IM的PBS 沖洗，剪成糜狀；
2、獲得上層白色脂肪部分；
采用酶消化法(參照Ken Yagi DK, Yasushi Okazaki, Koichiro Kano A novel preadipocyte cell line established from mouse adult mature adipocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications 2004 ；321 :967-974.)。用膠原酶I，37°C消化40-50min,消化充分；
消化過(guò)程也可放在37°C的搖床內(nèi)。
3、采用天花板法培養(yǎng)后再常規(guī)培養(yǎng)；
由于的脂肪細(xì)胞富含高的脂質(zhì)成分，培養(yǎng)時(shí)，會(huì)漂浮在培養(yǎng)基的頂層，這樣會(huì)使的成熟的脂肪細(xì)胞不能有效的接受營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和接受同樣的處理環(huán)境。1986年Sugihara H提出“天花板培養(yǎng)”的方法，就是利用了成熟脂肪細(xì)胞漂浮的性質(zhì)使細(xì)胞附著在充滿培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的上層(Sugihara H，Yonemitsu N，Miyabara S，Yun K. Primary cultures of unilocular fat cells !characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties.Differentiation 1986 ；31 :42-49.)。Ken Yagi 在試 著使用天花板培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)大量的成熟脂肪細(xì)胞能夠去分化為成纖維樣細(xì)胞，并命名為 DFAT-Dl (ddY小鼠的脂肪細(xì)胞去分化而來(lái))。
用20%完全培養(yǎng)基[20%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養(yǎng)基(DMEM，PAA 公司)，1%雙抗(抗青霉素-鏈霉素)]中和膠原酶I并過(guò)濾；
也可選用5%的完全培養(yǎng)基[FBS (Gibico公司)，高糖培養(yǎng)基(DMEM，PAA公司)， 雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]。
收集過(guò)濾液 1000-1500rpm 離心 3_5min。
4、并用20%的完全培養(yǎng)基同時(shí)誘導(dǎo)。
取上層白色細(xì)胞層采用20%的完全培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)至少七天后常規(guī)培養(yǎng)。七天后，脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂滴基本消失。但是有時(shí)七天后觀察一些細(xì)胞仍會(huì)存在脂滴，這種情況下，可以延長(zhǎng)倒置培養(yǎng)的時(shí)間。
本發(fā)明還提供了根據(jù)上述方法從成體兔的成熟脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化得到的心肌樣細(xì)胞。
近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究從小鼠、大鼠、人上都已建立了 DFAT細(xì)胞，但兔的DFAT細(xì)胞建立并沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。本發(fā)明成功培養(yǎng)出的兔的DFAT細(xì)胞，相比較于之前在小鼠、大鼠、人的DFAT細(xì)胞的培養(yǎng)步驟和方法上更為得簡(jiǎn)化與實(shí)用。首先本發(fā)明不需要特殊的培養(yǎng)基質(zhì)， 本發(fā)明只是采用的實(shí)驗(yàn)室常用的高糖培養(yǎng)基(DMEM，PAA公司)，普通的胎牛血清，以及常用的抗青-鏈霉素。其次本發(fā)明不需要繁瑣的實(shí)驗(yàn)步驟，這在具體實(shí)施方式
中已有體現(xiàn)。另外，本發(fā)明是首次將兔的DFAT細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌樣細(xì)胞。盡管2009年，Medet Jumabay等用小鼠的DFAT培養(yǎng)出自發(fā)搏動(dòng)的心肌樣細(xì)胞。本發(fā)明人所在的研究小組一直重復(fù)前者的培養(yǎng)方法但并未得到成功。本發(fā)明的方法通過(guò)相應(yīng)的改進(jìn)得到了成功首先，前者有既定的步驟，各步驟的時(shí)間設(shè)置都是固定的，而本發(fā)明各步驟的時(shí)間是可以由浮動(dòng)的。其次，前者的消化的過(guò)程中需要特定的搖床，本發(fā)明只是普通的消化，更具普遍性。再次，前者需用了兩性霉素等相關(guān)的培養(yǎng)基質(zhì)，本發(fā)明沒(méi)有選用。采用本發(fā)明的培養(yǎng)誘導(dǎo)方法培養(yǎng)出的心肌樣細(xì)胞其相關(guān)的分子標(biāo)識(shí)確是完全的表達(dá)。本發(fā)明的培養(yǎng)誘導(dǎo)方法簡(jiǎn)便并且不需要特殊的材料及設(shè)備，可在實(shí)驗(yàn)室中得到廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明用兔作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，免與人的關(guān)系更為接近，用其脂肪組織培養(yǎng)誘導(dǎo)出心肌樣細(xì)胞，將會(huì)是對(duì)人的心臟干細(xì)胞或者心臟組織工程治療方面提供有力的支持。


圖1是脂肪組織內(nèi)分離DFAT細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌樣細(xì)胞流程模式2是兔的DFAT細(xì)胞培養(yǎng)相差顯微鏡其中A、DFAT細(xì)胞培養(yǎng)第三天(X200) ；B、DFAT細(xì)胞培養(yǎng)第七天(X100) ；C、DFAT 細(xì)胞培養(yǎng)第十天(X100) ；D、DFAT細(xì)胞培養(yǎng)傳一代(X100)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施作詳細(xì)說(shuō)明，以下實(shí)施例是在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1 一、兔去分化脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)成年荷蘭大白兔(第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，3kg左右)1、相對(duì)無(wú)菌的狀態(tài)下，取出成體兔腹股溝處白色脂肪組織；2、用0. IM的磷酸緩沖液(PBQ洗三遍后，將組織剪成糜狀；3、用等體積(與糜狀的組織塊等體積)的膠原酶I (Worthington公司)37°C消化 40min，期間適當(dāng)?shù)膿u晃，以便消化均勻。消化過(guò)程也可放在37°C的搖床內(nèi)。4、用20%完全培養(yǎng)基[20%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養(yǎng)基(DMEM，PAA 公司)，1%雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]中和膠原酶的活性并且輔助過(guò)濾。為了節(jié)約可選用5%的完全培養(yǎng)基[5%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養(yǎng)基(DMEM，PAA公司)，1 %雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]。收集濾液，IOOOrpm離心3分鐘.5、取上層白色脂肪層培養(yǎng)在12cm2的培養(yǎng)瓶中，用20%的完全培養(yǎng)基充滿培養(yǎng)瓶， 倒置培養(yǎng)在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中。6、七天后，倒掉培養(yǎng)基，加入2-3ML的20%的完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。(流程如圖1 所示)七天后，脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂滴基本消失。但是有時(shí)七天后觀察一些細(xì)胞仍會(huì)存在脂滴，這種情況下，可以延長(zhǎng)倒置培養(yǎng)的時(shí)間。
開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)脂肪細(xì)胞呈圓形漂浮在最上層。在培養(yǎng)第3/4天，有些細(xì)胞貼附在培養(yǎng)瓶的上壁上生長(zhǎng)。七天后絕大多數(shù)的細(xì)胞脂滴丟失，成長(zhǎng)梭形細(xì)胞形態(tài)(如圖2所示)。二、DFAT細(xì)胞的鑒定取傳1代的DFAT細(xì)胞常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Sarcomeric Action (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CX45 (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CD40 ( KiXffiii 公司)、CX43 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)、Troponin I (Abeam)禾口 HCN4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)等的表達(dá)(以上檢測(cè)的分子均為心肌細(xì)胞的標(biāo)識(shí)分子)。結(jié)果表明 Sarcomeric Action、肌鈣蛋白、0ct_4、CX45和CX43是成陽(yáng)性的，HCN4弱陽(yáng)性。表明20% 的完全培養(yǎng)基將DFAT細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌樣細(xì)胞。實(shí)施例2 —、兔去分化脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)成年荷蘭大白兔(第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，3kg左右)1、相對(duì)無(wú)菌的狀態(tài)下，取出成體兔腹股溝處白色脂肪組織；2、用0. IM的磷酸緩沖液(PBQ洗三遍后，將組織剪成糜狀；3、用等體積(與糜狀的組織塊等體積)的膠原酶I (Worthington公司)37°C消化 45min，期間適當(dāng)?shù)膿u晃，以便消化均勻。消化過(guò)程也可放在37°C的搖床內(nèi)；4、用20%完全培養(yǎng)基[20%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養(yǎng)基(DMEM，PAA 公司)，1%雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]中和膠原酶的活性并且輔助過(guò)濾。為了節(jié)約，可選用5%的完全培養(yǎng)基[5%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養(yǎng)基(DMEM， PAA公司)，1 %雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]，收集濾液，IOOOrpm離心5分鐘；5、取上層白色脂肪層培養(yǎng)在12cm2的培養(yǎng)瓶中，用20%的完全培養(yǎng)基充滿培養(yǎng)瓶， 倒置培養(yǎng)在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中；6、七天后，倒掉培養(yǎng)基，加入2-3ML的20%的完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。(流程如圖1 所示)七天后，脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂滴基本消失。但是有時(shí)七天后觀察一些細(xì)胞仍會(huì)存在脂滴，這種情況下，可以延長(zhǎng)倒置培養(yǎng)的時(shí)間。開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)脂肪細(xì)胞呈圓形漂浮在最上層。在培養(yǎng)第3/4天，有些細(xì)胞貼附在培養(yǎng)瓶的上壁上生長(zhǎng)。七天后細(xì)胞內(nèi)脂滴丟失，成長(zhǎng)梭形生長(zhǎng)。(如圖2所示)二、DFAT細(xì)胞的鑒定取21天的DFAT細(xì)胞常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Sarcomeric Action (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CX45 (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CD40 ( KiXffiii 公司)、CX43 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)、Troponin I (Abeam)禾口 HCN4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)等的表達(dá)(以上檢測(cè)的分子均為心肌細(xì)胞的標(biāo)識(shí)分子)。結(jié)果表明 Sarcomeric Action、肌鈣蛋白、0ct_4、CX45和CX43是成陽(yáng)性的，HCN4弱陽(yáng)性，這與實(shí)施例 1結(jié)果是一致的。實(shí)施例3 —、兔去分化脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)成年荷蘭大白兔(第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，3kg左右)1、相對(duì)無(wú)菌的狀態(tài)下，取出成體兔腹股溝處白色脂肪組織；
2、用0. IM的磷酸緩沖液(PBQ洗三遍后，將組織剪成糜狀；
3、用等體積(與糜狀的組織塊等體積)的膠原酶I (Worthington公司)37°C消化50min，期間適當(dāng)?shù)膿u晃，以便消化均勻。消化過(guò)程也可放在37°C的搖床內(nèi)；
4、用20%完全培養(yǎng)基[20%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養(yǎng)基(DMEM，PAA 公司)，1%雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]中和膠原酶的活性并且輔助過(guò)濾。
為了節(jié)約，可選用5%的完全培養(yǎng)基[5%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養(yǎng)基(DMEM，PAA公司)，1 %雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]，收集濾液，1500rpm離心3分鐘；
5、取上層白色脂肪層培養(yǎng)在12cm2的培養(yǎng)瓶中，用20%的完全培養(yǎng)基充滿培養(yǎng)瓶， 倒置培養(yǎng)在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中；
6、七天后，倒掉培養(yǎng)基，加入2-3ML的20%的完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。(流程如圖1 所示)
七天后，脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂滴基本消失。但是有時(shí)七天后觀察一些細(xì)胞仍會(huì)存在脂滴，這種情況下，可以延長(zhǎng)倒置培養(yǎng)的時(shí)間。
開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)脂肪細(xì)胞呈圓形漂浮在最上層。在培養(yǎng)第3/4天，有些細(xì)胞貼附在培養(yǎng)瓶的上壁上生長(zhǎng)。七天后細(xì)胞內(nèi)脂滴丟失，成長(zhǎng)梭形生長(zhǎng)。(如圖2所示)
二、DFAT細(xì)胞的鑒定
取21天的DFAT細(xì)胞常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Sarcomeric Action (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CX45 (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CD40 ( KiXffiii 公司)、CX43 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)、Troponin I (Abeam)禾口 HCN4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)等的表達(dá)(以上檢測(cè)的分子均為心肌細(xì)胞的標(biāo)識(shí)分子)。結(jié)果表明 Sarcomeric Action、肌鈣蛋白、0ct_4、CX45和CX43是成陽(yáng)性的，HCN4弱陽(yáng)性，這與實(shí)施例 1結(jié)果是一致的。
實(shí)施例4
一、兔去分化脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)
成年荷蘭大白兔(第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，3kg左右)
1、相對(duì)無(wú)菌的狀態(tài)下，取出成體兔腹股溝處白色脂肪組織；
2、用0. IM的磷酸緩沖液(PBQ洗三遍后，將組織剪成糜狀；
3、用等體積(與糜狀的組織塊等體積)的膠原酶I (Worthington公司)37°C消化 45min，期間適當(dāng)?shù)膿u晃，以便消化均勻。消化過(guò)程也可放在37°C的搖床內(nèi)；
4、用20%完全培養(yǎng)基[20%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養(yǎng)基(DMEM，PAA 公司)，1%雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]中和膠原酶的活性并且輔助過(guò)濾。
為了節(jié)約，可選用5%的完全培養(yǎng)基[5%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培養(yǎng)基(DMEM，PAA公司)，1 %雙抗(抗青霉素-鏈霉素)(上海生工)]，收集濾液，IOOOrpm離心3分鐘；
5、離心后取上層部分洗1-2遍(純化作用)。每次離心1500rpm，1分鐘；
6、取上層白色脂肪層培養(yǎng)在12cm2的培養(yǎng)瓶中，用20%的完全培養(yǎng)基充滿培養(yǎng)瓶， 倒置培養(yǎng)在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中；
7、七天后，倒掉培養(yǎng)基，加入2-3ML的20%的完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。(流程如圖1所示)七天后，脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂滴基本消失。但是有時(shí)七天后觀察一些細(xì)胞仍會(huì)存在脂滴，這種情況下，可以延長(zhǎng)倒置培養(yǎng)的時(shí)間。開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)脂肪細(xì)胞呈圓形漂浮在最上層。在培養(yǎng)第3/4天，有些細(xì)胞貼附在培養(yǎng)瓶的上壁上生長(zhǎng)。七天后細(xì)胞內(nèi)脂滴丟失，成長(zhǎng)梭形生長(zhǎng)。(如圖2所示)二、DFAT細(xì)胞的鑒定取21天的DFAT細(xì)胞常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Sarcomeric Action (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CX45 (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CD40 ( KiXffiii 公司)、CX43 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)、Troponin I (Abeam)禾口 HCN4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)等的表達(dá)(以上檢測(cè)的分子均為心肌細(xì)胞的標(biāo)識(shí)分子)。結(jié)果表明 Sarcomeric Action、肌鈣蛋白、0ct_4、CX45和CX43是成陽(yáng)性的，HCN4弱陽(yáng)性，這與實(shí)施例 1結(jié)果是一致的。
權(quán)利要求
1.一種從成體兔的成熟脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的方法，具體步驟如下A、分離出成體兔的白色脂肪組織；B、酶消化法獲得上層白色脂肪層部分；C、采用天花板法培養(yǎng)后再常規(guī)培養(yǎng)；用20%完全培養(yǎng)基或者5%的完全培養(yǎng)基，中和膠原酶I并過(guò)濾，收集過(guò)濾液 1000-1500rpm 離心 3_5min ；D、取上層白色細(xì)胞層采用20%的完全培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)至少七天后常規(guī)培養(yǎng)； 所述的完全培養(yǎng)基配方為FBS、高糖培養(yǎng)基和抗青霉素-鏈霉素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從成體兔的成熟脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的方法，其特征在于分離出成體兔的白色脂肪組織后用0. IM的PBS沖洗，剪成糜狀。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種從成體兔的成熟脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的方法，其特征在于步驟B中，用膠原酶I，37°C的環(huán)境下消化40-50min。
4.一種如權(quán)利要求1、2或3的方法制備得到的從成體兔的成熟脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化得到的心肌樣細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)去分化及誘導(dǎo)分化的技術(shù)領(lǐng)域。去分化的脂肪細(xì)胞(DFAT)可從白色脂肪組織中獲取，DFAT細(xì)胞通過(guò)一定的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法可以分化為多種間質(zhì)細(xì)胞系，具有成骨、成脂、成軟骨、成肌的能力。本發(fā)明的目的是從成體兔的成熟脂肪細(xì)胞培養(yǎng)兔的DFAT，并誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞。本發(fā)明選用成體兔的白色脂肪組織，通過(guò)膠原酶I等體積消化，并采用20％完全培養(yǎng)基，天花板培養(yǎng)的方法使成熟的脂肪細(xì)胞去分化為DFAT細(xì)胞，并有心肌細(xì)胞的形態(tài)及標(biāo)識(shí)分子的表達(dá)。本發(fā)明為組織工程提供了種子細(xì)胞，為基礎(chǔ)研究帶來(lái)便捷，為臨床應(yīng)用帶來(lái)前景。
文檔編號(hào)C12N5/077GK102492653SQ201110404788
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者張傳森, 張喜, 李曉童 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)