專利名稱：水生黃桿菌及其在微生物轉(zhuǎn)化制備l-色氨酸中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株新的產(chǎn)L-酰胺酶菌株——水生黃桿菌(Flavobacteriumaquati) ZJB-09211，及其在微生物轉(zhuǎn)化制備L-色氨酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
L-色氨酸在生物體內(nèi)不能自然合成，需要從食物中攝取，是動(dòng)物和一些真菌生命活動(dòng)中的必需氨基酸。L-色氨酸在蛋白質(zhì)中含量很低，平均含量約或更少。L-色氨酸能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成、調(diào)節(jié)免疫及消化功能、增加5-羥色胺代謝作用以及增強(qiáng)認(rèn)知能力等，因此在人和動(dòng)物的新陳代謝、生長(zhǎng)發(fā)育中有重要作用。L-色氨酸的這些營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值使其被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、飼料和食品等行業(yè)。L-色氨酸可以采用蛋白質(zhì)水解法、化學(xué)合成法-和微生物法來生產(chǎn)。微生物法大體上可分為酶促轉(zhuǎn)化法和直接發(fā)酵法1982年日本的Nakai (EP 43211)利用L-酰胺酶將DL-色氨酰胺水解獲得L-色氨酸及D-色氨酰胺，然后再利用化學(xué)法生產(chǎn)D-色氨酸，其得率達(dá)到92%。 Komeda 禾口 Asano (Enzyme and Microbial Technology, 2008,43 :276-283)于 2008 年從 Brevibacterium iodinum中克隆了具有D-氨基酰胺酶，該酶對(duì)多種不同類型的氨基酰胺都具有很好的酶活，其對(duì)色氨酰胺也具有一定的活力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一株可用于制備光學(xué)純L-色氨酸的新菌種——水生黃桿菌 (Flavobacterium aquati) ZJB-09211，及其在微生物制備L-色氨酸中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是水生黃桿菌(Flavobacterium aquati)ZJB-09211，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵政編碼430072，保藏日期2011年10月17日，保藏編號(hào) CCTCC NO :M 2011354。該新菌株的特征如下生理生化特征革蘭氏陰性，接觸酶陽(yáng)性，氧化還陽(yáng)酶陽(yáng)性，其他陽(yáng)性項(xiàng)目是組氨酸同化、D-麥芽糖、乙酸鹽、丙酸鹽同化、水楊素、DL-乳酸鹽同化，戊酸鹽同化、D-蜜二糖、葵酸鹽、丙氨酸同化、D-葡萄糖、蔗糖、脯氨酸、N-乙酰-葡萄糖胺、丙二酸鹽利用；全部陰性的項(xiàng)目是檸檬酸鹽利用、衣康酸鹽同化、D-甘露醇、阿拉伯糖、3-羥基-丁酸鹽、D-山梨醇、4-羥基-苯甲酸鹽同化、3-羥基-苯甲酸鹽同化、D-核糖、2-酮基葡萄糖、肌醇、糖原、L-巖澡糖、5-酮基葡糖酸鹽、辛二酸鹽同化、絲氨酸同化、明膠液化、L-鼠李糖、吲哚產(chǎn)生。本發(fā)明所涉及的微生物是通過以下的程序篩選得到的 1)將由浙江省內(nèi)各地采回的土樣和污水樣接種到富集培養(yǎng)基中，在30°C，150rpm 的搖床上培養(yǎng)3天，待培養(yǎng)基變混濁后，取Iml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新鮮的富集培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)3天。如此重復(fù)4 5個(gè)循環(huán)。富集培養(yǎng)基以1 2. 5g/L(終濃度)色氨酰胺為唯一碳、氮源，再加入其他物質(zhì)配方如下(終濃度)=K2HPO4 · 12H20 1. 0 2. 5g/L，KH2PO4 1. 0 2. Og/ L，MgSO4 · 7H20 :0. 2 0. 5g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 :0. 01 0. 05g/L，以自來水配制。2)最后一次富集培養(yǎng)液稀釋后涂布到平板培養(yǎng)基上，挑取單菌落至斜面保藏。平板培養(yǎng)基為富集培養(yǎng)基中加入15 20g/L的瓊脂。3)挑取的單菌落接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，組份如下(終濃度)葡萄糖10. 0 20. Og/ L，牛肉膏 5. 0 10. Og/L，蛋白胨 2. 0 5. Og/L, NaCl 1. 0 3. Og/L, K2HPO4L 0 2. Og/ L, KH2PO4L 0 2. Og/L, MgSO4O. 2 0. 5g/L, FeSO4O. 01 0. 05g/L,乙酰胺 2. 0 5. Og/L, pH自然(121°C下，滅菌20min)，自來水配制；25 45°C下，搖瓶轉(zhuǎn)速100 300rpm，培養(yǎng) 48h 72h，離心后懸浮于蒸餾水體系中。然后利用手性液相色譜法篩選產(chǎn)L-酰胺酶的菌株。4)對(duì)通過上述方法篩選到的產(chǎn)L-酰胺酶菌株，通過水解轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行復(fù)篩。按照上述方法培養(yǎng)得到的菌體，離心后懸浮于蒸餾水體系中，加入色氨酰胺作為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化；用手性液相色譜法分析產(chǎn)物的含量及光學(xué)純度。手性色譜法的具體操作條件為美國(guó)戴安U3000液相色譜儀，變色龍色譜工作站； 美國(guó)CHIR0BI0TIC 手性液相色譜柱；流動(dòng)性為乙腈0. 5%醋酸=80 20，流速為ImL/ min ；進(jìn)樣量3 μ L，檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm，柱溫為30°C。通過Plackett-Burman考察了碳源、氮源、誘導(dǎo)劑與金屬離子等培養(yǎng)基組分對(duì)水生黃桿菌ZJB-09211菌株酶活的影響，得到水生黃桿菌ZJB-09211的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為(終濃度)葡萄糖9.0 15. 0g/L，酵母粉6. 0 10. 0g/L, KH2PO4O. 5 1. 5g/L, K2HPO4O. 5 1. 5g/L，NaCl 0. 5 lg/L，乙酰胺 1 3. 0g/L，溶劑為水。水生黃桿菌ZJB-09211的最佳培養(yǎng)條件為起始pH 6. 0 8. 5，裝液量5 30%， 培養(yǎng)溫度20 30°C，搖床轉(zhuǎn)速100 300rpm，培養(yǎng)時(shí)間M 72小時(shí)。本發(fā)明還涉及所述的水生黃桿菌ZJB-09211在微生物轉(zhuǎn)化制備L-色氨酸中的應(yīng)用。具體的，所述應(yīng)用為以外消旋色氨酰胺為反應(yīng)底物，加入水生黃桿菌ZJB-09211 經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)獲得的含酶菌體細(xì)胞，28 35°C搖床振蕩條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)1 30小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到所述L-色氨酸。優(yōu)選的，所述產(chǎn)酶培養(yǎng)在組成如下的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行葡萄糖9. 0 15. 0g/L, 酵母粉 6. 0 10. 0g/L, KH2PO4O. 5 1. 5g/L, K2HPO4O. 5 1. 5g/L, NaCl 0. 5 lg/L,乙酰胺1 3. 0g/L，溶劑為水，pH 6. 0 8. 5。優(yōu)選的，所述產(chǎn)酶培養(yǎng)在20 30°C、100 300rpm條件下進(jìn)行，培養(yǎng)時(shí)間M 72 小時(shí)。優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)在pH7. 0 7. 8的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液中進(jìn)行。優(yōu)選的，底物添加量為0. 5 lOmg/mL緩沖液，含酶菌體細(xì)胞添加量以濕重計(jì)為10 100mg/mL緩沖液。優(yōu)選的，為提高轉(zhuǎn)化效率，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)的體系中還添加有體積為緩沖液體積 1 20%的助溶劑甲醇或乙酸乙酯。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種具有立體選擇性、可制備光學(xué)純L-色氨酸的新菌種，通過該菌種可制備高光學(xué)純度的L-色氨酸；本發(fā)明通過篩選得到不同于以往研究的新菌種，從而為考察在手性拆分方面的微生物菌種的多樣性、進(jìn)而比較不同菌種在轉(zhuǎn)化途徑及反應(yīng)機(jī)理上的差異提供了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1 菌株的分離產(chǎn)L-酰胺酶產(chǎn)生菌的分離在9mL 0. 85% (w/w)的生理鹽水中加入Ig土樣、適量玻璃珠，搖勻，使成均勻的土壤懸液；吸取0. 5mL的土壤懸液接種到裝有30mL富集培養(yǎng)基的 250mL的三角瓶中，置于30°C，150rpm的搖床培養(yǎng)3天，等富集液出現(xiàn)渾濁后，再吸取0. 5mL 轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)3天；如此重復(fù)4 5個(gè)循環(huán)后，將富集液稀釋多個(gè)梯度， 涂布到分離平板上，獲得單菌落；富集培養(yǎng)基以色氨酰胺為唯一碳、氮源，組成如下(終濃度)=K2HPO4 ·12Η20 :lg/L， KH2PO4 :lg/L, MgSO4 · 7H20 :0. 2g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 :0. 01g/L，色氨酰胺3g/L，用自來水配制， pH調(diào)為7.0 ；挑取的單菌落接種到富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4817 后取樣，用手性液相色譜法檢測(cè)產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸的對(duì)應(yīng)體過量值(e. e值)，篩選獲得一株e. e.值超過98%的菌株，該菌株被鑒定為水生黃桿菌Flavobacterium aquati,即為所述的微生物黃桿菌ZJB-09211 (CCTCC NO :M 2011354)。實(shí)施例2 菌株的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基組成牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂20g/L，自來水配制后制成斜面；于平板上挑取黃桿菌ZJB-09211的單菌落，接種至斜面，于30°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 后，放入4 °C冰箱內(nèi)保藏備用。實(shí)施例3 濕菌體細(xì)胞的獲得培養(yǎng)基配制葡萄糖10. 0g，牛肉膏 5. 0g，蛋白胨 2. 0g, KH2PO4, lg, K2HPO4Ig, NaCl lg，乙酰胺lg，自來水補(bǔ)足至IL ；250ml搖瓶裝液量25 %，接種一環(huán)水生黃桿菌ZJB-09211，于30°C、150rpm振蕩培養(yǎng)48h ；培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液離心并用生理鹽水洗滌兩次，收集濕菌體細(xì)胞，懸浮于蒸餾水中，得濕菌體細(xì)胞含量為0. lg/mL的菌懸液，備用。實(shí)施例4 濕菌體細(xì)胞的獲得培養(yǎng)基配制葡萄糖10. 0g，酵母粉 7. 0g，KH2PO4L 0g，K2HPO4L 0g, NaCl lg,乙酰胺 l.Og，自來水補(bǔ)足至lL，pH 8. 0 ；250ml搖瓶裝液量20%，接種一環(huán)水生黃桿菌ZJB-09211，于30°C、150rpm振蕩培養(yǎng)48h ；培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液離心并用生理鹽水洗滌兩次，收集濕菌體細(xì)胞，懸浮于50mM、pH 7. 8的磷酸鹽緩沖溶液中，得濕菌體細(xì)胞含量為0. 5g/mL的菌懸液，備用。實(shí)施例5 在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7. 8)中，加入4mL實(shí)施例3所得菌懸液；力口入12mg外消旋色氨酰胺作為底物，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)30小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上清液，經(jīng)液相檢測(cè)，產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸的光學(xué)純度99. 5% e. e，轉(zhuǎn)化率49. 5%。實(shí)施例6:在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7. 8)中，加入1. 6mL實(shí)施例3所得菌懸液； 加入外消旋色氨酰胺作為底物，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)液離心， 取上清液，經(jīng)液相檢測(cè)，產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸的光學(xué)純度99. 2% e. e，轉(zhuǎn)化率42%。實(shí)施例7 在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.8)中，加入6mL實(shí)施例4所得菌懸液；力口入Mmg外消旋色氨酰胺作為底物，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上清液，經(jīng)液相檢測(cè)，產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸的光學(xué)純度99% e. e，轉(zhuǎn)化率48%。實(shí)施例8 在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7. 8)中，加入4mL實(shí)施例3所得菌懸液；力口入外消旋色氨酰胺作為底物，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上清液，產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸的光學(xué)純度99 % e. e，轉(zhuǎn)化率48 %。實(shí)施例9 在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.8)中，加入4mL實(shí)施例4所得菌懸液；力口入36mg外消旋色氨酰胺作為底物，于恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)液離心，產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸的光學(xué)純度99% e. e，轉(zhuǎn)化率42%。實(shí)施例10 在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7. 0)中，加入4mL實(shí)施例3所得菌懸液；力口入48mg外消旋色氨酰胺作為底物。于32°C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上清液萃取，產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸的光學(xué)純度98. 9% e. e，轉(zhuǎn)化率49%。實(shí)施例11 在10mL、50mM的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7. 5)中，加入4mL實(shí)施例3所得菌懸液； 加入48mg外消旋色氨酰胺作為底物，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)液離心， 取上清液，產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸的光學(xué)純度99% e. e，轉(zhuǎn)化率48%。實(shí)施例12 在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.8)中，加入4mL實(shí)施例4所得菌懸液；力口入48mg外消旋色氨酰胺作為底物和0. 3mL甲醇，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上清液，產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸的光學(xué)純度99. 3% e. e，轉(zhuǎn)化率49%。實(shí)施例13 在10mL、50mM的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.8)中，加入4mL實(shí)施例4所得菌懸液；力口入48mg外消旋色氨酰胺作為底物和ImL甲醇，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上清液，產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸的光學(xué)純度99. 5% e. e，轉(zhuǎn)化率48%。實(shí)施例14 在10ml、50mM的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7. 4)中，加入4mL實(shí)施例3所得菌懸液； 加入48mg外消旋色氨酰胺和0. 6mL乙酸乙酯，于30°C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上清液，產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸的光學(xué)純度99. 2% e. e，轉(zhuǎn)化率48%。
權(quán)利要求
1.水生黃桿菌(Flavobacteriumaquati)ZJB_09211，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵政編碼430072，保藏日期2011年10月17日，保藏編號(hào) CCTCC NO :M 2011354。
2.如權(quán)利要求1所述的水生黃桿菌ZJB-09211在微生物轉(zhuǎn)化制備L-色氨酸中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為以外消旋色氨酰胺為反應(yīng)底物， 加入水生黃桿菌ZJB-09211經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)獲得的含酶菌體細(xì)胞，28 35°C搖床振蕩條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)1 30小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到所述L-色氨酸。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)酶培養(yǎng)在組成如下的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行葡萄糖 9. 0 15. Og/L,酵母粉 6. 0 10. Og/L, KH2PO4O. 5 1. 5g/L，K2HPO4O. 5 1. 5g/ L，NaCl 0. 5 lg/L，乙酰胺 1 3. Og/L，溶劑為水，pH 6. 0 8. 5。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)酶培養(yǎng)在20 30°C、100 300rpm條件下進(jìn)行，培養(yǎng)時(shí)間M 72小時(shí)。
6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)在pH7.0 7. 8的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液中進(jìn)行。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)的體系中還添加有體積為緩沖液體積1 20%的甲醇或乙酸乙酯。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株可用于制備光學(xué)純L-色氨酸的新菌種——水生黃桿菌(Flavobacterium aquati)ZJB-09211，及其在微生物制備L-色氨酸中的應(yīng)用。該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵政編碼430072，保藏日期2011年10月17日，保藏編號(hào)CCTCC M2011354。本發(fā)明提供了一種具有立體選擇性、可制備光學(xué)純L-色氨酸的新菌種，通過該菌種可制備高光學(xué)純度的L-色氨酸；本發(fā)明通過篩選得到不同于以往研究的新菌種，從而為考察在手性拆分方面的微生物菌種的多樣性、進(jìn)而比較不同菌種在轉(zhuǎn)化途徑及反應(yīng)機(jī)理上的差異提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12P13/22GK102559540SQ20111040510
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者徐建妙, 沈寅初, 鄭裕國(guó), 陳奔 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)