專利名稱：一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結(jié)構(gòu)的直接熒光標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于顯示刺激隱核蟲微管細胞骨架的方法領(lǐng)域，特別涉及一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結(jié)構(gòu)的直接熒光標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
刺激隱核蟲俗稱“海水小瓜蟲”，是一種寄生在海水硬骨魚體的寄生纖毛蟲。該纖毛蟲體被分散排布且長短均一的纖毛，這些纖毛均由微管結(jié)構(gòu)構(gòu)成。刺激隱核蟲生活史分為滋養(yǎng)體、包囊體和幼蟲3個階段。該寄生蟲最早于1937年，由Sikama在日本的水族館內(nèi)發(fā)現(xiàn)。近年來，隨著我國海水魚人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖密度的增加，及養(yǎng)殖管理方面的失誤，刺激隱核蟲病在沿海省市常有發(fā)生，給養(yǎng)殖戶和相關(guān)單位帶來了極大的經(jīng)濟損失。長久以來，為了找到有效防治刺激隱核蟲病的方法，研究者開展了大量探索。眾所周知，所有真核生物細胞均具有高度發(fā)達、復(fù)雜的微管骨架系統(tǒng)。微管是細胞骨架中與細胞生命活動緊密聯(lián)系的基本組分之一，除與維持細胞形態(tài)、承受外力、保持細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性、細胞的分裂增殖和運動等有關(guān)外，還與其致病性密切相關(guān)。因此，全面掌握刺激隱核蟲生命過程中微管骨架的結(jié)構(gòu)及其變化特征，可以為探明刺激隱核蟲細胞結(jié)構(gòu)的形成及致病機理提供基礎(chǔ)資料，為找尋抗蟲藥物的作用靶點提供新的思路。目前，顯示微管細胞骨架的方法包括銀浸法、蛋白銀法、抗α/β_微管蛋白免疫熒光法等。但上述方法步驟相對復(fù)雜，操作耗時較長，且對實驗條件要求較高。因此需要一種既能與微管蛋白特異性結(jié)合，又便于操作，且高效省時的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結(jié)構(gòu)的直接熒光標(biāo)記方法，該方法操作簡單，效率高，且環(huán)保無污染。本發(fā)明的一種顯不刺激隱核蟲微管骨架結(jié)構(gòu)的直接突光標(biāo)記方法，包括(I)將50-100μ O. 5-1.5% (V/V)多聚賴氨酸水溶液涂在潔凈的載玻片上，風(fēng)干，得到涂有多聚賴氨酸的載玻片；(2)吸取10-15只刺激隱核蟲細胞，將其移入盛有ImL含有O. 5% (W/V)皂苷的 PHEM溶液的容器中，滲透O. 5-2min ；(3)吸除70-90%步驟(2)后的溶液，然后加入O. 5_2mL PHEM溶液浸浴3_5秒；(4)吸除70-90%步驟(3)后的溶液，得滲透后的細胞，然后將滲透后的細胞移入盛有O. 5-2mL 4% (W/V)多聚甲醛溶液的容器中，固定10-20秒；(5)吸除70-90%步驟(4)后的多聚甲醛溶液，然后加入O. 5_2mL PHEM溶液，浸浴 3-5 秒；(6)吸除70-90%步驟(5)后的溶液，得固定后的細胞，再將固定后的細胞轉(zhuǎn)移至步驟(I)得到的涂有多聚賴氨酸的載玻片上；(7)吸除步驟(6)后的多余液體，然后迅速向細胞上滴加O. 05-0. 2mL O. 5% (V/V)Triton X-100 水溶液，處理 2_3min ；(8)吸除步驟(7)后的Triton X-100水溶液，然后向細胞上滴加O. 05-0. 2mL PHEM 溶液，浸浴3-5秒；(9)吸除步驟(8)后的PHEM溶液，然后向細胞上滴加O. 05-0. 2mL O. Olmol/L磷酸緩沖液PBS漂洗蟲體2-3次，每次2-4min ；(10)吸除步驟(9)后的PBS溶液，隨后迅速向細胞上滴加O. 01-0. 03mL含有 I μ mol/L熒光紫杉醇(FLUTAX-2)的0. 01mol/L的PBS溶液，于室溫避光孵育5_15min ；(11)吸除步驟(10)后的溶液，隨后向細胞上滴加O. 05-0. 2mL O. Olmol/L PBS緩沖液漂洗蟲體2-3次，每次2-4min，然后吸除多余的溶液，加蓋蓋玻片；最后用顯微鏡觀察并照相，其中熒光的激發(fā)波長為492nm，發(fā)射波長為520nm。步驟(I)中所述的涂有多聚賴氨酸的載玻片上的多聚賴氨酸呈直徑Icm的圓形。步驟(2)所述的操作于萊卡Wild M5體視顯微鏡下進行。步驟⑵和⑷所述的容器為凹面皿。步驟⑵、(3)、(5)和⑶中所述的PHEM溶液為pH值為6. 9，含有60mmol/L PIPES, 25mmol/L HEPES, IOmmoI/L EGTA 和 6mmol/L MgCl2 · 6H20 的水溶液。步驟(9)、(10)和(11)中所述的磷酸緩沖液PBS為pH值為7. 4，含有136. 8mmol/ LNaCl, 2. 7mmol/L KCI, 10. lmmol/L Na2HPO4,1. 8mmol/L KH2PO4 的水溶液。步驟(10)中所述的熒光紫杉醇(FLUTAX-2)購買與分子探針公司，其產(chǎn)品號 P22310。步驟(11)中所述的顯微鏡為奧林巴斯BX51熒光顯微鏡，照相采用Cool SNAP-Pro 數(shù)碼相機。紫杉醇(Taxol)是一類可以與β _微管特異性結(jié)合的物質(zhì)，F(xiàn)LUTAX是紫杉醇的一種衍生物，是將熒光素與紫杉醇結(jié)合而成。FLUTAX與β -微管特異性結(jié)合后，通過熒光顯微鏡觀察可以顯示刺激隱核蟲細胞的微管骨架結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中所涉及的V/V的單位均為mL/mL，所涉及的W/V的單位均為g/mL。有益效果本發(fā)明的方法操作簡單，耗時少，且環(huán)保無污染。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例I(I)用微量移液器吸取100 μ L 1% (V/V)多聚賴氨酸水溶液在潔凈的載玻片上涂一片直徑為Icm的圓形區(qū)域，風(fēng)干過夜待用；(2)于萊卡Wild M5體視顯微鏡下，用微吸管吸取10只狀態(tài)良好的刺激隱核蟲滋養(yǎng)體期細胞，將其移入盛有ImL含有0.5% (W/V)皂苷的PHEM緩沖液的凹面皿中，滲透 Imin ；
(3)用微吸管吸除80%左右上步皂苷溶液，隨后用微量移液器向凹面皿中加入 ImLPHEM溶液浸浴5秒；(4)吸除80%左右上步PHEM溶液，隨后用微吸管將滲透后的細胞移入盛有ImL 4% (W/V)多聚甲醛溶液的另一凹面皿中，固定20秒；(5)吸除80%左右上步多聚甲醛溶液，隨后用微量移液器向凹面皿中加入ImL PHEM溶液，浸浴5秒；(6)吸除80%左右上步PHEM溶液，隨后用微吸管將固定后的細胞轉(zhuǎn)移至涂有多聚賴氨酸的載玻片上；(7)用微吸管吸除多余液體，隨后迅速用微量移液器向細胞上滴加O. ImL 0.5% (V/V) Triton X-100 水溶液，處理 3min ；(8)吸除上步Triton X-100水溶液，隨后用微量移液器向細胞上滴加O. ImL PHEM 溶液，浸浴5秒；(9)吸除上步PHEM溶液，隨后用微量移液器向細胞上滴加O. ImL O.Olmol/L磷酸緩沖液(PBS，含有 136. 8mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCI, 10. lmmol/L Na2HPO4,1. 8mmol/ LKH2PO4, pH 7. 4)漂洗蟲體3次，每次3min ；(10)吸除上步PBS溶液，隨后迅速用微量移液器向細胞上滴加0.02mL含有 lymol/L熒光紫杉醇(FLUTAX-2，分子探針公司，產(chǎn)品號P22310)的PBS (0. 01mol/L)溶液，于室溫避光孵育IOmin ；(11)吸除上步溶液，隨后用微量移液器向細胞上滴加0. ImL 0. 01mol/L PBS緩沖液漂洗蟲體3次，每次3min，然后吸除多余的溶液，加蓋蓋玻片；用奧林巴斯BX51熒光顯微鏡觀察，Cool SNAP-Pro數(shù)碼相機照相。熒光的激發(fā)波長為492nm，發(fā)射波長為520nm。實施例2(I)用微量移液器吸取50 μ L 1% (V/V)多聚賴氨酸水溶液在潔凈的載玻片上涂一片直徑為Icm的圓形區(qū)域，風(fēng)干過夜待用；(2)于萊卡Wild M5體視顯微鏡下，用微吸管吸取15只狀態(tài)良好的刺激隱核蟲幼蟲期細胞，將其移入盛有ImL含有0. 5% (W/V)皂苷的PHEM緩沖液的凹面皿中，滲透Imin ；(3)用微吸管吸除80%左右上步皂苷溶液，隨后用微量移液器向凹面皿中加入 ImLPHEM溶液浸浴3秒；(4)吸除80%左右上步PHEM溶液，隨后用微吸管將滲透后的細胞移入盛有ImL 4% (W/V)多聚甲醛溶液的另一凹面皿中，固定10秒；(5)吸除80%左右上步多聚甲醛溶液，隨后用微量移液器向凹面皿中加入ImL PHEM溶液，浸浴3秒；(6)吸除80%左右上步PHEM溶液，隨后用微吸管將固定后的細胞轉(zhuǎn)移至涂有多聚賴氨酸的載玻片上；(7)用微吸管吸除多余液體，隨后迅速用微量移液器向細胞上滴加0. ImL 0.5% (V/V) Triton X-100 水溶液，處理 2min ；(8)吸除上步Triton X-100水溶液，隨后用微量移液器向細胞上滴加0. ImL PHEM 溶液，浸浴3秒；(9)吸除上步PHEM溶液，隨后用微量移液器向細胞上滴加0. ImL O.Olmol/L磷酸緩沖液(PBS，含有 136. 8mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCI, 10. lmmol/L Na2HPO4,1. 8mmol/ LKH2PO4, pH 7. 4)漂洗蟲體2次，每次3min ；(10)吸除上步PBS溶液，隨后迅速用微量移液器向細胞上滴加O. 02mL含有 lymol/L熒光紫杉醇(FLUTAX-2，分子探針公司，產(chǎn)品號P22310)的PBS (O. Olmol/L)溶液，于室溫避光孵育IOmin ；(11)吸除上步溶液，隨后用微量移液器向細胞上滴加O. ImL O. Olmol/L PBS緩沖液漂洗蟲體2次，每次3min，然后吸除多余的溶液，加蓋蓋玻片；用奧林巴斯BX51熒光顯微鏡觀察，Cool SNAP-Pro數(shù)碼相機照相。熒光的激發(fā)波長為492nm，發(fā)射波長為520nm。
權(quán)利要求
1.一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結(jié)構(gòu)的直接熒光標(biāo)記方法，包括(1)將50-100μ O. 5-1.5% (V/V)多聚賴氨酸水溶液涂在潔凈的載玻片上，風(fēng)干，得到涂有多聚賴氨酸的載玻片；(2)吸取10-15只刺激隱核蟲細胞，將其移入盛有ImL含有O.5% (W/V)皂苷的PHEM 溶液的容器中，滲透O. 5-2min ；(3)吸除70-90%步驟(2)后的溶液，然后加入O.5-2mL PHEM溶液浸浴3_5秒；(4)吸除70-90%步驟(3)后的溶液，得滲透后的細胞，然后將滲透后的細胞移入盛有O.5-2mL 4% (W/V)多聚甲醛溶液的容器中，固定10-20秒；(5)吸除70-90%步驟(4)后的多聚甲醛溶液，然后加入O.5-2mL PHEM溶液，浸浴3_5秒；(6)吸除70-90%步驟(5)后的溶液，得固定后的細胞，再將固定后的細胞轉(zhuǎn)移至步驟(I)得到的涂有多聚賴氨酸的載玻片上；(7)吸除步驟(6)后的多余液體，然后迅速向細胞上滴加O.05-0. 2mL 0.5% (V/V) Triton X-IOO 水溶液，處理 2_3min ；(8)吸除步驟(7)后的TritonX-100水溶液，然后向細胞上滴加O. 05-0. 2mL PHEM溶液，浸浴3-5秒；(9)吸除步驟(8)后的PHEM溶液，然后向細胞上滴加O.05-0. 2mL O. Olmol/L磷酸緩沖液PBS漂洗蟲體2-3次，每次2-4min ；(10)吸除步驟(9)后的PBS溶液，隨后迅速向細胞上滴加O.01-0. 03mL含有I μ mo I/L 熒光紫杉醇的0. 01mol/L的PBS溶液，于室溫避光孵育5_15min ；(11)吸除步驟(10)后的溶液，隨后向細胞上滴加0.05-0. 2mL 0. 01mol/L PBS緩沖液漂洗蟲體2-3次，每次2-4min，然后吸除多余的溶液，加蓋蓋玻片；最后用顯微鏡觀察并照相，其中熒光的激發(fā)波長為492nm，發(fā)射波長為520nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結(jié)構(gòu)的直接熒光標(biāo)記方法，其特征在于步驟(I)中所述的涂有多聚賴氨酸的載玻片上的多聚賴氨酸呈直徑Icm的圓形。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結(jié)構(gòu)的直接熒光標(biāo)記方法，其特征在于步驟(2)所述的操作于萊卡Wild M5體視顯微鏡下進行。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結(jié)構(gòu)的直接熒光標(biāo)記方法，其特征在于步驟(2)和(4)所述的容器為凹面皿。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種顯不刺激隱核蟲微管骨架結(jié)構(gòu)的直接突光標(biāo)記方法， 其特征在于步驟(2)、(3)、(5)和(8)中所述的PHEM溶液為pH值為6.9，含有60mmol/ LPIPES,25mmol/L HEPES, IOmmoI/L EGTA 和 6mmol/L MgCl2 · 6H20 的水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種顯不刺激隱核蟲微管骨架結(jié)構(gòu)的直接突光標(biāo)記方法，其特征在于步驟(9)、(10)和(11)中所述的磷酸緩沖液PBS為pH值為7. 4，含有136. 8mmol/ L NaCl, 2. 7mmol/L KCI, 10. lmmol/L Na2HPO4,1. 8mmol/L KH2PO4 的水溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結(jié)構(gòu)的直接熒光標(biāo)記方法， 其特征在于步驟(11)中所述的顯微鏡為奧林巴斯BX51熒光顯微鏡，照相采用Cool SNAP-Pro數(shù)碼相機。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結(jié)構(gòu)的直接熒光標(biāo)記方法，包括先制備涂有多聚賴氨酸的載玻片；然后將刺激隱核蟲細胞用含有皂苷的PHEM溶液滲透，加入PHEM溶液浸??；然后將滲透后的細胞用多聚甲醛溶液固定后用PHEM溶液浸浴，再將固定后的細胞移至上述涂有多聚賴氨酸的載玻片上；吸除多余液體后向細胞上滴加Triton X-100水溶液，然后用PHEM溶液浸浴、0.01mol/L磷酸緩沖液漂洗；用含有1μmol/L熒光紫杉醇的PBS溶液于室溫避光孵育后用0.01mol/L PBS緩沖液漂洗，再吸除多余的溶液，加蓋蓋玻片；最后用顯微鏡觀察并照相。本發(fā)明的方法操作簡單，效率高，且環(huán)保無污染。
文檔編號C12Q1/02GK102608082SQ20111040748
公開日2012年7月25日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者孫鵬, 尹飛, 彭士明, 施兆鴻 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所