專(zhuān)利名稱(chēng)：磷酸化肌球蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白的激酶的發(fā)現(xiàn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
: 本發(fā)明屬于基礎(chǔ)生命科學(xué)，生物化學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué),腦科學(xué),神經(jīng)細(xì)胞骨架學(xué)和神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，創(chuàng)新性地揭示了同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞肌球蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白的新機(jī)理和神經(jīng)細(xì)胞形成及工作的基本原理。
背景技術(shù)：
:生命在于運(yùn)動(dòng)，探索生命運(yùn)動(dòng)的原理是生命科學(xué)的最重要領(lǐng)域之一。肌球蛋白(myosin)和驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin)作為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的主要分子馬達(dá)，在肌肉收縮，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，小胞和膜細(xì)胞器的輸送以及動(dòng)態(tài)細(xì)胞骨架的構(gòu)成和功能上起著重要的作用。細(xì)胞微管和微絲的動(dòng)態(tài)和神經(jīng)細(xì)胞軸突的形成，細(xì)胞分裂以及細(xì)胞移動(dòng)等有密切的關(guān)系。肌球蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白分別與細(xì)胞微絲和細(xì)胞微管緊密地協(xié)作，擔(dān)負(fù)著各種復(fù)雜細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的使命。揭示調(diào)節(jié)肌球蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白功能的基本分子原理是生命科學(xué)家的最熱衷研究領(lǐng)域之一。還沒(méi)有關(guān)于既磷酸化肌球蛋白也磷酸化驅(qū)動(dòng)蛋白的激酶的報(bào)道。模式生物秀麗線蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)在形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)上是相似的；一個(gè)保存性基因在秀麗線蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物的不同實(shí)驗(yàn)系里能表達(dá)相同的功效。秀麗線蟲(chóng)的unc-51基因編碼一個(gè)從線蟲(chóng)到人類(lèi)的進(jìn)化上具有保存性的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是神經(jīng)形成所必須的；這個(gè)基因的突變引起線蟲(chóng)的神經(jīng)形成及運(yùn)動(dòng)的欠缺和短粗體形。揭示unc-51基因所編碼的蛋白激酶的底物和其生物化學(xué)功能的意義是重要的
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的在于揭示unc-51基因所編碼的蛋白激酶的重要底物和其生物化學(xué)功能，弄清楚神經(jīng)細(xì)胞形成的分子機(jī)理，為神經(jīng)疾病的治療提供嶄新的原理和方法。本發(fā)明的內(nèi)容為: (I)首次揭示肌球蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白都能夠結(jié)合UNC-51激酶肌球蛋白及驅(qū)動(dòng)蛋白和UNC-51激酶的體外結(jié)合如圖1所示。圖1顯示體外酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)的結(jié)果,肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC),肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)和驅(qū)動(dòng)蛋白重鏈(myosin heavy chain,KHC)都能夠在體外結(jié)合UNC-51激酶。(2)首次揭示UNC-51蛋白激酶活性既能夠磷酸化肌球蛋白也能夠磷酸化驅(qū)動(dòng)蛋白圖2顯示UNC-51激酶在體外能夠磷酸化肌球蛋白重鏈(MHC)并自我磷酸化。圖3顯示UNC-51激酶在體外能夠磷酸化肌球蛋白輕鏈(MLC)并自我磷酸化。圖4顯示用凝膠移位分析法的結(jié)果，UNC-51激酶在體內(nèi)(HeLa細(xì)胞)能夠磷酸化驅(qū)動(dòng)蛋白。圖5表示UNC-51激酶活性通過(guò)對(duì)肌球蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白的磷酸化反應(yīng)誘導(dǎo)神經(jīng)軸突形成的模型。


:圖1肌球蛋白及驅(qū)動(dòng)蛋白和UNC-51激酶的體外結(jié)合圖2UNC-51激酶在體外磷酸化微管蛋白并自我磷酸化圖3UNC-51激酶在體外磷酸化微管蛋白并自我磷酸化圖4UNC-51激酶在體外磷酸化微管蛋白并自我磷酸化圖5UNC-51激酶活性通過(guò)對(duì)肌球蛋白及驅(qū)動(dòng)蛋白的磷酸化反應(yīng)誘導(dǎo)神經(jīng)軸突形成的模型
具體實(shí)施方式
:1肌球蛋白及驅(qū)動(dòng)蛋白和UNC-51蛋白激酶結(jié)合的測(cè)定用細(xì)胞溶解緩沖液溶解表達(dá)UNC-51蛋白激酶的HEK293細(xì)胞，得到溶胞產(chǎn)物的上清。利用親和層析法從以上溶胞產(chǎn)物的上清純化得到UNC-51蛋白激酶。運(yùn)用固相酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)分析肌球蛋白及驅(qū)動(dòng)蛋白和UNC-51蛋白激酶的體外結(jié)合。2激酶活性的測(cè)定在含有50 μ M末端放射性表記的腺苷三磷酸[Y -32Pl-ATP的Ifepes激酶緩沖反應(yīng)液(ρΗ7.4)中，進(jìn)行了 UNC-51蛋白激酶磷酸化肌球蛋白及驅(qū)動(dòng)蛋白的反應(yīng)。用6.5%的SDS-PAGE和X-線膠片放射自顯影法分析測(cè)定了激酶活性。用凝膠移位分析法發(fā)現(xiàn)了 UNC-51激酶在體內(nèi)(HeLa細(xì)胞)能夠磷酸化驅(qū)動(dòng)蛋白。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)第一個(gè)既結(jié)合肌球蛋白及驅(qū)動(dòng)蛋白也磷酸化肌球蛋白及驅(qū)動(dòng)蛋白的激酶是UNC-51激酶。其關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)為:在試管內(nèi)的生化實(shí)驗(yàn)中，首次揭示肌球蛋白(MHC和MLC)和驅(qū)動(dòng)蛋白(KHC)都能夠結(jié)合UNC-51激酶。
2.首次揭示UNC-51蛋白激酶活性既能夠磷酸化肌球蛋白(MHC和MLC)也能夠磷酸化驅(qū)動(dòng)蛋白(KHC)。
肌球蛋白+UNC-51+驅(qū)動(dòng)蛋白+ATP(GTP)— —移動(dòng)性P-肌球蛋白-UNC-51-驅(qū)動(dòng)蛋白-P復(fù)合體+ADP (⑶P)
3.上記二項(xiàng)要求的技術(shù)原理在生命科學(xué)，腦科學(xué)，腫瘤科學(xué)，計(jì)算機(jī)科學(xué)，宇宙科學(xué)，交通科學(xué)，醫(yī)學(xué)，藥學(xué)和制藥學(xué)，中藥科學(xué)，各種疾病的治療法，醫(yī)療技術(shù)以及所有其他方面的應(yīng)用 和推廣。
全文摘要
生命在于運(yùn)動(dòng)。肌球蛋白(myosin)和驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin)作為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的主要分子馬達(dá)，在肌肉收縮，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，小胞和膜細(xì)胞器的輸送以及動(dòng)態(tài)細(xì)胞骨架的構(gòu)成和功能上起著重要的作用。揭示調(diào)節(jié)肌球蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白功能的基本分子原理是生命科學(xué)家的最熱衷研究領(lǐng)域之一。還沒(méi)有關(guān)于既磷酸化肌球蛋白也磷酸化驅(qū)動(dòng)蛋白的激酶的報(bào)道。在這里，首次揭示肌球蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白都能夠結(jié)合UNC-51激酶，首次揭示UNC-51蛋白激酶活性既能夠磷酸化肌球蛋白也能夠磷酸化驅(qū)動(dòng)蛋白，并提出UNC-51激酶活性通過(guò)對(duì)肌球蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白的磷酸化反應(yīng)誘導(dǎo)神經(jīng)軸突形成的模型。
文檔編號(hào)C12Q1/48GK103160571SQ20111040779
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者田懷澤, 李素云, 田華希 申請(qǐng)人:彩虹天健康科技研究(北京)有限責(zé)任公司