專利名稱：調節(jié)細胞微管動態(tài)新機制的發(fā)現(xiàn)的制作方法
技術領域：
: 本發(fā)明屬于基礎生命科學，生物化學，細胞生物學，分子生物學,腦科學,神經(jīng)細胞骨架學和神經(jīng)細胞信號轉導學等多個領域，創(chuàng)新性地揭示了細胞微管解聚的新機理和神經(jīng)細胞形成及工作的基本原理。
背景技術：
:細胞微管的動態(tài)和神經(jīng)細胞軸突的形成，細胞分裂以及細胞移動等有密切的關系。通常認為，細胞內微管的形成間接地被微管結合蛋白(MAP，tau)的磷酸化影響，但微管動態(tài)的基本機理仍然不明。還沒有關于既直接磷酸化微管蛋白也以其磷酸化機理影響微管動態(tài)的激酶的報道。模式生物秀麗線蟲和哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)在形態(tài)學和生物化學上是相似的；一個保存性基因在秀麗線蟲和哺乳動物的不同實驗系里能表達相同的功效。秀麗線蟲的unc-51基因編碼一個從線蟲到人類的進化上具有保存性的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是神經(jīng)形成所必須的；這個基因的突變引起線蟲的神經(jīng)形成及運動的欠缺和短粗體形。揭示unc-51基因所編碼的蛋白激酶的靶蛋白和其生物化學功能的意義是重要的
發(fā)明內容
:本發(fā)明的目的在于揭示unc-51基因所編碼的蛋白激酶的重要底物和其生物化學功能，弄清楚神經(jīng)細胞形成的分子機理，為神經(jīng)疾病的治療提供嶄新的原理和方法。本發(fā)明的內容為:(I)首次揭示微管蛋白既能和UNC-51激酶結合，更能作為此激酶的底物被磷酸化微管蛋白和 UNC-51激酶的結合如圖1，圖2和圖7所示。圖1是把表達UNC-51激酶蛋白的人胚腎HEKs293細胞的溶胞產物用于免疫印跡后的結果，這圖顯示在被轉染的HEKs293細胞內，UNC-51激酶蛋白結合著微管蛋白。圖2的體外酶聯(lián)免疫吸附測定結果顯示，來自秀麗線蟲及牛腦的微管蛋白都能夠結合UNC-51激酶蛋白。圖7是激光掃描熒光共焦顯微鏡的圖像，這圖像顯示在非州綠猴腎細胞(C0S-7)質基質中，帶紅色熒光的顆粒狀UNC-51激酶蛋白和帶綠色螢光的顆粒狀微管蛋白結合產生了顆粒狀的黃色熒光。圖3顯示UNC-51激酶在體外能夠磷酸化來自牛腦的α / β微管蛋白亞基并自我磷酸化，ATP和GTP均可作為磷酸供體。圖4顯示UNC-51激酶在體內(人胚腎ΗΕΚ293細胞)磷酸化微管蛋白并自我磷酸化。圖5顯示UNC-51激酶蛋白本身，秀麗線蟲和牛腦由來微管蛋白的絲氨酸被UNC-51激酶磷酸化。(2)首次揭示UNC-51蛋白激酶活性能解聚微管并能輸送粒狀微管到細胞質基質中去從圖6可看出，過量表達UNC-51激酶蛋白(紅色，圖6左箭頭所指)的C0S-7細胞的微管已經(jīng)消失(圖6右箭頭所指)，這表明UNC-51激酶活性可在細胞里解聚微管。和圖8中無激酶活性的UNC-51突變蛋白(Κ39Μ)在細胞核周圍形成的積聚體相t匕，圖7顯示，UNC-51激酶活性能輸送粒狀微管到細胞質基質中去。
(3)首次揭示UNC-51蛋白激酶活性能夠誘導HeLa細胞變成多分枝的神經(jīng)性細胞圖9顯示，UNC-51激酶活性能誘導人宮頸癌海拉(HeLa)細胞成為分叉神經(jīng)似的細胞。圖10表示UNC-51激酶活性通過對細胞內微管的磷酸化解聚反應誘導神經(jīng)軸突形成的模型。


:圖1微管蛋白和UNC-51激酶的體內結合圖2微管蛋白和UNC-51激酶的體外結合圖3UNC-51激酶在體外磷酸化微管蛋白并自我磷酸化并自我磷酸化圖4UNC-51激酶在體內磷酸化微管蛋白圖5UNC-51激酶在體外磷酸化自我的和微管蛋白的絲氨酸圖6UNC-51激酶活性能解聚細胞內微管

圖7UNC-51激酶活性能輸送粒狀微管到細胞質基質中去圖8無激酶活性的UNC-51突變蛋白(K39M)和微管蛋白在細胞核周圍形成積聚體圖9UNC-51激酶活性能誘導海拉(HeLa)細胞成為分叉神經(jīng)似的細胞圖10UNC-51激酶活性通過對細胞內微管的磷酸化解聚反應誘導神經(jīng)軸突形成的模型
具體實施方式
:1UNC_51蛋白激酶和微管蛋白結合的測定用細胞溶解緩沖液溶解表達UNC-51蛋白激酶的HEK293細胞，得到的溶胞產物的上清用于免疫印跡。利用親和層析法從以上溶胞產物的上清純化得到UNC-51蛋白激酶。運用固相酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)分析微管蛋白和UNC-51蛋白激酶的體外結合。2激酶活性的測定在含有50μΜ末端放射性表記的腺苷三磷酸[Υ-32Ρ]-ΑΤΡ或者鳥苷三磷酸[Y-32Pl-GTP的H印es激酶緩沖反應液(pH7.4)中，進行了 UNC-51蛋白激酶磷酸化微管蛋白的反應。用6.5%的SDS-PAGE和X-線膠片放射自顯影法分析測定了激酶活性。薄層纖維素板(TLC)上的雙向分離電泳法用于磷酸化絲氨酸的同定。3激光掃描熒光共焦顯微鏡的觀察DAPI用于細胞核染色，TexasRed和FITC分別用于UNC-51和微管蛋白的染色。ZeiSSLSM510共焦顯微鏡被用于細胞觀察和記錄。
權利要求
1.本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 UNC-51的激酶活性能夠直接地磷酸化微管蛋白并解聚細胞微管成為粒狀構造和運輸粒狀構造微管到細胞質基質。UNC-51是第一個既磷酸化微管蛋白也直接地以其激酶活性影響微管構造和分布的激酶。其關鍵發(fā)現(xiàn)為:在試管內和在活體內的生化實驗中，UNC-51的激酶活性直接地磷酸化α-，β-的絲氨酸，UNC-51結合α -，β -微管蛋白，無激酶活性的UNC-51突變體(Κ39Μ)不能磷酸化α-, 微管蛋白。
2.UNC-51的激酶活性解聚細胞微管成為粒狀構造并使粒狀構造微管分布到細胞質基質，UNC-51也能誘導HeLa細胞成為分叉神經(jīng)似的細胞，無激酶活性的UNC-51突變體(Κ39Μ)蛋白和微管在細胞核周圍形成積聚體構造物，不能誘導HeLa細胞成為分叉神經(jīng)似的細胞。
纖維狀微管+UNC-51+GTP(ATP)—磷酸化粒狀微管+GDP(ADP)
3.上記二項要求的技術原理在生命科學，腦科學，腫瘤科學，計算機科學，宇宙科學，交通科學，醫(yī)學，藥學和制藥學，中藥科學，各種疾病的治療法，醫(yī)療技術以及所有其他方面的應 用和推廣。
全文摘要
細胞骨架的動態(tài)變化是神經(jīng)細胞為代表的極性細胞的分化形成所必須的。微管是主要細胞骨架之一，微管的解聚在細胞骨架的動態(tài)變化中占有重要位置，其分子機理還不清楚。本研究首次發(fā)現(xiàn)，從秀麗線蟲到哺乳動物具有保守性的UNC-51蛋白激酶既能結合又能磷酸化微管蛋白，而且能導致細胞內微管的解聚，使微管成顆粒狀分布并輸送顆粒狀微管到細胞質基質中去；UNC-51蛋白激酶還能把非神經(jīng)由來的HeLa細胞誘導變成為分叉神經(jīng)狀的細胞；無激酶活性的UNC-51突變體(K39M)蛋白則和微管在細胞核周圍一起形成積聚體構造物，不能誘導HeLa細胞變成為分叉神經(jīng)狀的細胞。根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)結果，提出以下模型UNC-51蛋白激酶通過直接地磷酸化微管蛋白，導致細胞微管的解聚，并且輸送顆粒狀微管到細胞質基質的分子機理，調節(jié)神經(jīng)細胞軸突的形成和功能。
文檔編號C12Q1/48GK103160572SQ20111040780
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權日2011年12月9日
發(fā)明者田懷澤, 李素云, 田華希 申請人:彩虹天健康科技研究(北京)有限責任公司