專利名稱：一種采油微生物降解原油過程控制方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物治理石油污染技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種微生物降解石油污染物過程中的控制方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)化發(fā)展、城市化進(jìn)程的深入，石油的使用量加大，而由此帶來的環(huán)境污染不斷加劇。石油類物質(zhì)進(jìn)入土壤造成土壤生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的破壞，嚴(yán)重影響土壤通透性，使土壤肥力下降，從而毒害植物生長，破壞地表植被，造成糧食減產(chǎn)；石油污染海洋后可以通過食物鏈在人體內(nèi)富集對人類健康造成嚴(yán)重危害，同時(shí)，石油污染物進(jìn)入海洋會(huì)對水生生物的生長、發(fā)育、繁殖及整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生巨大破壞。目前，石油污染問題已經(jīng)成為世界各國普遍關(guān)注的問題。石油是各種烷烴、環(huán)烷烴和芳香族化合物所組成的混合物，其中還含有雜環(huán)化合物；其中的多環(huán)芳香族化合物(PAHs)和一些雜環(huán)類物質(zhì)(如咔唑類、噻吩類、呋喃類等)具有持久性和致癌性，是公認(rèn)的環(huán)境毒物。目前，主要依靠機(jī)械刮油和化學(xué)吸附等物理、化學(xué)方法進(jìn)行石油類污染的治理。但是物理、化學(xué)方法成本高、投資大，并且存在二次污染，因此，這不是解決石油污染的最優(yōu)方法。近年來，利用微生物修復(fù)被污染的環(huán)境引起人們的重視。因?yàn)槔梦⑸镄迯?fù)異源生物質(zhì)污染有很多優(yōu)點(diǎn)，比如污染物在原地被降解；就地處理操作簡便，對周圍環(huán)境干擾少；修復(fù)經(jīng)費(fèi)較少；人類直接暴露在這些污染物下的機(jī)會(huì)減少；較少或不產(chǎn)生二次污染，遺留問題少等。然而，單純的微生物治理污染方案效果上還不是特別明顯，因此有業(yè)者研究將表面活性劑與微生物共用來進(jìn)行石油污染物的治理。有文獻(xiàn)表明(表面活性物質(zhì)對多環(huán)芳烴的增溶作用及微生物可利用性的影響，吳應(yīng)琴，2007)，表面活性劑能促進(jìn)PAHs的釋放，使PAHs分配到表面活性劑膠束中或吸附到表面活性劑單體上，提高PAHs表觀溶解度，從而促進(jìn)與PAHs的移動(dòng)，提高生物對PAHs降解的效率。表面活性劑對污染物的增溶作用和生物降解作用與所采用的表面活性劑的種類直接相關(guān)。Doong等(Journal of Hazardous Materials，200 測試了不同表面活性劑對多環(huán)芳烴增溶和生物降解作用的影響，發(fā)現(xiàn)所實(shí)驗(yàn)的表面活性劑中，HLB值較小的表面活性劑 Tritonx-IOO對多環(huán)芳烴的增溶作用較強(qiáng)，HLB值較大的SDS增溶作用較??；TritonX-IOO 可增強(qiáng)多環(huán)芳烴的生物可降解性，不同表面活性劑對污染物生物降解的影響與表面活性劑的生物降解性有關(guān)。TWeen-80是由失水山梨醇油酸單質(zhì)與環(huán)氧乙烷加合而成的非離子型表面活性劑， 具有很好的增溶和乳化作用，其毒性和臨界膠束濃度也較小，是較為理想的降解促進(jìn)劑。宋玉芳等(應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，1999)研究了非離子表面活性劑TWeen-80對土壤中多環(huán)芳烴生物降解的影響，認(rèn)為表面活性劑能夠提高多環(huán)芳烴的生物可利用性，加快多環(huán)芳烴的降解速率，但表面活性劑濃度過高則可抑制微生物(指土壤中原有微生物)活性。楊建剛等(應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2004)研究了非離子表面活性劑Tween-20對多環(huán)芳烴類化合物生物降解過程的影響，結(jié)果表明，Tween-20不僅對菲具有較好的增溶效果，而且在實(shí)驗(yàn)所使用的濃度范圍內(nèi)，TWeen-20都可以增強(qiáng)降解菌對菲的去除效果。雖然化學(xué)合成的表面活性劑對疏水性有機(jī)污染物的增溶作用十分有效，但鑒于一些化學(xué)表面活性劑所具有的毒性以及生物可降解性差，有可能在污染場地引入二次污染，因而人們把目光轉(zhuǎn)向了天然綠色的生物表面活性劑。在微生物降解原油的過程中，生物表面活性劑起到了非常重要的作用，有報(bào)道認(rèn)為生物表面活性劑可以促使烴類物質(zhì)乳化、分散，并改變微生物細(xì)胞表面的疏水性，達(dá)到加強(qiáng)微生物與烴類物質(zhì)間的親和力，同時(shí)也起到促使烴類物質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的作用，從而強(qiáng)化微生物對石油污染物的降解。然而，如何利用這些化學(xué)或生物表面活性劑來促使其在微生物降解石油污染物過程中發(fā)揮作用仍然是需要攻克的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種采油微生物降解原油過程控制方法及應(yīng)用，以及活性物質(zhì)與微生物共用降解石油污染物的方法。本發(fā)明微生物降解原油過程控制方法，用于確定石油污染物降解劑中活性物質(zhì)的種類和濃度，包括通過研究活性物質(zhì)對微生物生長和原油降解的影響分析確定所用的活性物質(zhì)種類、濃度、用量等參數(shù)。其中，對微生物生長的影響分析包括以下步驟1) LB斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)Mh，活化菌株；2)活化后種子接種到LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 后，離心收集菌體，用磷酸緩沖液洗，并重懸于此緩沖液作為種子液；3) 5%接種量將種子液接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基，分別添加原油作為碳源，分別添加設(shè)定濃度的活性物質(zhì)作為激活劑，振蕩培養(yǎng)后分析菌液值，以不接種和不添加活性物質(zhì)的培養(yǎng)基作為對照。所述原油降解的影響分析是針對原油在處理前后的表觀粘度隨剪切速率變化的流變曲線來進(jìn)行測定分析。所述處理是指將原油與微生物菌種和活性物質(zhì)共同接觸并保持接觸一段時(shí)間。上述方法的一個(gè)直接應(yīng)用為用于確定石油污染物降解劑組配。本發(fā)明利用上述方法確定的石油污染物降解劑，包括微生物菌和活性物質(zhì)，所述活性物質(zhì)為選自烷基苯磺酸鹽、曲拉通 X-100 ((TritonX-IOO)Jiija (TWeen20)、羧酸鹽、石油磺酸鹽、吐溫(tween80)等化學(xué)表活劑中的一種或生物表活劑脂肽或酵母粉。其中，所述菌為選自菌004(波茨坦短芽孢桿(Brevibacillus borstelensis) CGMCC No. 2441)、菌 shp (蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) CGMCC No. 1141)和菌 019(銅綠假單胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC No. 208114)中的任一種，菌濃度為 2% (ν/ν) 10% (ν/ν)，優(yōu)選5% (ν/ν) 0所述化學(xué)表活劑在石油污染物降解劑中濃度為100mg/l 500mg/l，優(yōu)選500mg/l ；所述酵母粉在石油污染物降解劑中重量濃度為 0. 01% 0. 2%，優(yōu)選0. 2%;所述生物表活劑脂肽在石油污染物降解劑中濃度為10mg/l 200mg/l，優(yōu)選 50mg/l。具體的，所述石油污染物降解劑中其包含以下終濃度的組分菌004，2 10% (ν/ν)，化學(xué)表活劑500mg/l或酵母粉0. 2wt %或脂肽50mg/l，Iwt %的石油原油為碳源，KH2PO4lg/1, CaCL2. 2H20 0. 05g/l、Na2HPO4lg/1, FeSO4O. 01g/l、MgSO4. 7H20 0. 16g/l、 MnCL2O. 01g/l、NH4NO3Ig/!、NaCL 3g/l、KCL lg/1，用水配制，pH7_8。更具體的，為包括Iwt %的石油原油為碳源，KH2PO4lg/1, CaCL2. 2H200.05g/l、 Na2HPO4lg/1, FeSO4O. 01g/l、MgSO4. 7H20 0. 16g/l、MnCL2O. 01g/l、NH4NO3lg/1, NaCL 3g/l、 KCL lg/1, pH值7-8的水溶液，還含有以下所列組配之一組配一烷基苯磺酸鹽500mg/l ；菌004，5% ；
組配二曲拉通 X-100 ((TritonX-100) 100mg/l ；菌 019，2% ；
組配三吐溫(TWeen20) 200mg/l ；菌 004，4% ；
組配四羧酸鹽 300mg/l ；菌 004，8% ；
組配五石油磺酸鹽400mg/l ；菌shp，10% ；
組配六吐溫(tween80) 500mg/l ；菌 004,5% ；
組配七吐溫(tween80) 100mg/l ；菌 004，5% ；
組配八酵母粉0. 2% ；菌004，5% ；
組配九酵母粉0. 1% ；菌004，5% ；
組配十酵母粉 0.01% ；菌 004，5% ；
組配十-一脂肽 50mg/l ；菌 004，5%。
一種石油污染物的降解方法也屬于本發(fā)明，包括將以上所述降解劑加入含有石油
污染物的環(huán)境中，針對被污染的土壤，可按降解劑與土壤體積比1 50加入。通過本發(fā)明方法，使微生物降解原油過程得以控制，通過活性物質(zhì)和降解菌共用的方式減少或消除環(huán)境中的石油污染。


圖IA顯示添加酵母粉對菌004的作用，圖IB顯示添加酵母粉對菌019的作用；圖2A顯示添加烷基苯磺酸鹽對菌004的作用，圖2B顯示添加烷基苯磺酸鹽對菌 019的作用；圖3A、圖;3B和圖3C分別顯示Tween80對菌004、菌019和菌shp的作用；圖4A、圖4B和圖4C分別顯示Tween20對菌004、菌019和菌shp的作用；圖5A、圖5B和圖5C分別顯示石油羧酸鹽對菌004、菌019和菌shp的作用；圖6A、圖6B和圖6C分別顯示磺酸鹽對菌004、菌019和菌shp的作用；圖7A和圖7B分別顯示曲拉通XlOO對菌004和菌019的作用；圖8A、圖8B和圖8C分別顯示脂肽生物表活劑對菌004、菌shp和菌019的作用；圖9A、圖9B和圖9C分別顯示石油羧酸鹽菌組合004、菌019和菌shp對原油流變性的影響；圖10A、圖IOB和圖IOC分別顯示脂肽菌組合004、菌019和菌shp對原油流變性的影響；圖11A、圖IlB和圖IlC分別顯示Tween20組合菌004、菌019和菌shp對原油流變性的影響；圖12A、圖12B和圖12C分別顯示Tween80組合菌004、菌019和菌shp對原油流變性的影響；圖13A、圖1 分別顯示酵母粉組合菌004、菌019對原油流變性的影響；圖14A、圖14B分別顯示烷基苯磺酸鹽組合菌004、菌019對原油流變性的影響；圖15A、圖15B分別顯示曲拉通XlOO組合菌004、菌019對原油流變性的影響；圖16A、圖16B和圖16C分別顯示磺酸鹽組合菌004、菌019和菌shp對原油流變性的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明在于提供一種活性物質(zhì)與微生物共用降解石油污染物的方法。本發(fā)明首先選用了七種表面活性劑其中化學(xué)表活劑有采油領(lǐng)域中常用的石油磺酸鹽、石油羧酸鹽、烷基苯磺酸鹽以及吐溫80 (Tween80)、吐溫20 (Tween20)、曲拉通 X-100 (TritonX-IOO)，一種脂肽類生物表活劑(大慶沃太斯化工有限公司提供)，以及一種營養(yǎng)物質(zhì)酵母粉(如表1所示)作為活性物質(zhì)，研究它們對細(xì)菌生長和原油降解的影響。表1活性物質(zhì)類型
權(quán)利要求
1.一種石油污染物降解劑，包括微生物菌和活性物質(zhì)，其特征在于所述活性物質(zhì)為選自烷基苯磺酸鹽、曲拉通X-100 ((TritonX-IOO)、吐溫(TWeen20)、羧酸鹽、石油磺酸鹽、 吐溫(tweenSO)等化學(xué)表活劑中的一種或生物表活劑脂肽或酵母粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述石油污染物降解劑，其特征在于所述菌為選自菌004(波茨坦短芽孢桿(Brevibacillus borstelensis) CGMCC No. M41)、菌 shp (蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)CGMCC No. 1141)和菌 019(銅綠假單胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC No. 208114)中的任一種，菌濃度為 2% (ν/ν) 10% (ν/ν)，優(yōu)選 5% (ν/ν)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述石油污染物降解劑，其特征在于所述化學(xué)表活劑在石油污染物降解劑中濃度為100mg/l 500mg/l，優(yōu)選500mg/l ；所述酵母粉在石油污染物降解劑中重量濃度為0. 01% 0. 2%，優(yōu)選0. 2% ；所述生物表活劑脂肽在石油污染物降解劑中濃度為 10mg/l 200mg/l，優(yōu)選 50mg/l。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述石油污染物降解劑，其特征在于所述石油污染物降解劑中其包含以下終濃度的組分菌004，2 10% (v/v)，化學(xué)表活劑500mg/l或酵母粉 0. 2wt% 或脂肽 50mg/l, lwt% 的石油原油為碳源，KH2P04lg/l、CaCL2. 2H20 0. 05g/l、 Na2HPO4lg/1, FeSO4O. 01g/l、MgSO4. 7H20 0. 16g/l、MnCL2O. 01g/l、NH4NO3Ig/!、NaCL 3g/l、 KCL lg/1，用水配制，pH7-8。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述石油污染物降解劑，其特征在于為包括的石油原油為碳源，KH2PO4lg/1, CaCL2. 2H20 0. 05g/l、Na2HPO4lg/1, FeSO4O. 01g/l、MgSO4. 7H20 0. 16g/l、 MnCL2O. 0lg/1,NH4NO3lg/1,NaCL 3g/l、KCL lg/l，pH 值 7-8 的水溶液，還含有以下所列組配之一組配一烷基苯磺酸鹽500mg/l ；菌004，5% ；組配二 曲拉通 X-100 (CTritonX-100) 100mg/l ；菌 019，2% ；組配三吐溫(Tffeen20) 200mg/l ；菌 004，4% ；組配四羧酸鹽300mg/l ；菌004，8% ；組配五石油磺酸鹽400mg/l ；菌shp，10% ；組配六吐溫(tween80) 500mg/l ；菌 004，5% ；組配七吐溫(tween80) 100mg/l ；菌 004，5% ；組配八酵母粉0.2% ；菌004，5% ；組配九酵母粉0. 1% ；菌004，5% ；組配十酵母粉0.01% ；菌004，5% ；組配4^一 脂肽 50mg/l ；菌 004，5%。
6.一種石油污染物的降解方法，其特征在于包括將權(quán)利要求1至5任一所述降解劑加入含有石油污染物的環(huán)境中，針對被污染的土壤，可按降解劑與土壤體積比1 50加入。
7.—種微生物降解原油過程控制方法，用于確定權(quán)利要求1至5任一所述石油污染物降解劑中活性物質(zhì)的種類和濃度，包括通過研究活性物質(zhì)對微生物生長和原油降解的影響分析確定所用的活性物質(zhì)種類、濃度、用量等參數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，對微生物生長的影響分析包括以下步驟 1) LB斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)Mh，活化菌株；2)活化后種子接種到LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 后，離心收集菌體，用磷酸緩沖液洗，并重懸于此緩沖液作為種子液；3)5%接種量將種子液接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基，分別添加原油作為碳源，分別添加設(shè)定濃度的活性物質(zhì)作為激活劑，振蕩培養(yǎng)后分析菌液值，以不接種和不添加活性物質(zhì)的培養(yǎng)基作為對照。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述原油降解的影響分析是針對原油在處理前后的表觀粘度隨剪切速率變化的流變曲線來進(jìn)行測定分析。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其特征在于，所述處理是指將原油與微生物菌種和活性物質(zhì)共同接觸并保持接觸一段時(shí)間。
全文摘要
本發(fā)明一種微生物降解原油過程控制方法，包括通過研究表面活性劑對微生物生長和原油降解的影響確定所用的表活劑種類、濃度、用量等參數(shù)。本發(fā)明還提供一種石油污染物降解劑，包括采油菌和確定的表活劑；本發(fā)明還提供一種利用微生物對石油污染物的降解方法，其中包括將所確定的石油污染物降解劑注入被污染環(huán)境的過程。本發(fā)明使微生物降解原油過程得以控制，通過表活劑和降解菌共用的方式減少或消除環(huán)境中的石油污染。
文檔編號C12Q3/00GK102559194SQ20111040915
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者侯兆偉, 張繼元, 王艷玲, 王穎, 竇緒謀, 陸會(huì)民, 陳星宏 申請人:大慶油田有限責(zé)任公司