專(zhuān)利名稱(chēng)：β-1,4-內(nèi)切殼聚糖酶(Aus CsnA)基因的克隆及重組酶的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的一種糖苷水解酶 75家族的殼聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆，殼聚糖酶工程菌的構(gòu)建以及重組殼聚糖酶的高效表達(dá)和純化的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
殼聚糖(chitosan)，又叫脫乙酰幾丁質(zhì)、可溶性幾丁質(zhì)、聚甲殼糖、甲殼胺、聚氨基葡萄糖等，是幾丁質(zhì)脫去乙?；玫降漠a(chǎn)物，通常幾丁質(zhì)的脫乙酰度超過(guò)70%時(shí)就叫殼聚糖。殼聚糖廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲(chóng)外殼以及菌類(lèi)、藻類(lèi)的細(xì)胞壁中，但由于殼聚糖分子量大，水溶性差，在人體內(nèi)不易吸收，使其應(yīng)用受到限制；而經(jīng)殼聚糖降解得到的殼寡聚糖不僅具有水溶性好，易吸收等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)更發(fā)現(xiàn)其還具有許多獨(dú)特的生理活性和功能性質(zhì)。 殼聚糖酶能夠降解完全脫乙酰化的殼聚糖，其應(yīng)用前景尤其在食品、醫(yī)藥、保健品方面倍受矚目。根據(jù)殼聚糖酶降解部分乙?；瘹ぞ厶堑淖饔梅绞椒譃槿?lèi)一種切割 GIcNAc-GIcN鍵和GIcN-GIcN鍵，另一種只切割GIcN-GIcN鍵，第三種同時(shí)可以識(shí)別GlcN-GlcNAc鍵和GlcN_GlcN鍵，這三種方式協(xié)同作用，將部分脫乙?；臍ぞ厶墙到獬蔀榫酆隙炔煌臍す丫厶?。從酶的分類(lèi)學(xué)上講，殼聚糖酶屬于0-糖苷水解酶 (O-Glycosidehydrolases, EC3. 2. 1)，根據(jù)已知的殼聚糖酶氨基酸序列，殼聚糖酶分屬其中的5類(lèi)46，75，80，8和5家族。其中從細(xì)菌和放線(xiàn)菌中發(fā)現(xiàn)的殼聚糖酶大都屬于46家族， 而真菌源的殼聚糖酶則屬于75家族，兩族之間沒(méi)有同源性，說(shuō)明真菌殼聚糖酶在進(jìn)化起源上與細(xì)菌殼聚糖酶不同。目前關(guān)于殼聚糖酶的研究主要集中在細(xì)菌和放線(xiàn)菌中，有關(guān)來(lái)源于真菌宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)的殼聚糖酶基因(Aus csnA)的克隆和表達(dá)等的研究未見(jiàn)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種宇佐美曲霉EOOl菌株新型殼聚糖酶基因完整mRNA和 DNA序列克隆，殼聚糖酶工程菌的構(gòu)建以及重組殼聚糖酶的高效表達(dá)和純化的方法。生物信息學(xué)分析表明，來(lái)源于宇佐美曲霉EOOl菌株的一種新型殼聚糖酶屬于糖苷水解酶第75家族，命名為Aus CsnA，其相應(yīng)的基因命名為Aus csnA。Aus CsnA具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本發(fā)明的技術(shù)方案一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株新型 Aus CsnA基因完整mRNA和DNA的核苷酸序列分別為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2。獲取完整mRNA和DNA序列的流程如圖1所示。A. usamii EOOl菌株由江南大學(xué)篩選和保藏，已于2005年在《食品與發(fā)酵工業(yè)》雜志的Vol. 31，No. 4，Pg. 50公開(kāi)，本發(fā)明人承諾該菌株在20年內(nèi)向公眾發(fā)放。
所述的由完整mRNA序列推導(dǎo)的Aus CsnA氨基酸序列為SEQ ID NO :3。所述的重組Aus CsnA的活性測(cè)定方法于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 5. 0、檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液配制的質(zhì)量濃度為0. 5%的膠體殼聚糖溶液2. 4mL, 50°C預(yù)熱lOmin，在A(yíng)管中加入0. ImL適當(dāng)稀釋的酶液，50°C準(zhǔn)確反應(yīng)20min ；立即各加入2. 5mL 3' ,5' - 二硝基水楊酸(DNS)試劑，在 B管中再補(bǔ)加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對(duì)照測(cè)定A管吸光度值，并從氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出相應(yīng)的還原糖(以氨基葡萄糖計(jì))含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測(cè)定條件下，以每分鐘產(chǎn)生1 μ mol還原糖所需的酶量定義為1個(gè)殼聚糖酶活性單位(U)。所述的Aus CsnA完整mRNA和DNA序列的克隆和表達(dá)方法(I)Aus csnA 3'端 mRNA 序列的克隆首先對(duì) Aspergillus fumigatus (GenBank AA041660)、Aspergillus oryzae(GenBank BAA92250)禾口 Aspergillus terreus(GenBank XP_001209034)GH75的殼聚糖酶序列進(jìn)行同源比對(duì)，找出兩段約8個(gè)氨基酸的保守序列；再對(duì)該兩段氨基酸序列的mRNA進(jìn)行同源比對(duì)，設(shè)計(jì)兩條正向簡(jiǎn)并引物Csn-Fl和Csn-F2。Csn-Fl :5，-ATGGACAT(A/T)GACTGCGA(C/T)GG-3，Csn-F2 5，-GCCAATAT (A/C)CA (T/C)CC (G/C)TATGTGGT-3，提取A.usamii EOOl 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. 0)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增。將兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與 pUCm-Τ載體連接(pUCm-T-CSnA3 ‘)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到 Aus csnA 3'端 mRNA 序列。(2)Aus csnA 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus csnA 3'端mRNA序列，設(shè)計(jì)兩條反向引物Csn-REl和Csn-RE2。Csn-REl TTTGGTCTTGGATGGACTCGCsn-RE2 CCCGTCGCAGTCTATGTCCA按照TaKaRa 5' -Full RACE Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行5' -RACE。將兩輪PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-csnA 5')，轉(zhuǎn)化JM109， 經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到Aus csnA 5'端mRNA序列。(3) Aus csnA 5'端啟動(dòng)子序列的克隆采用先前我們發(fā)明的一種T載體介導(dǎo)的PCR方法，以經(jīng)處理的A. usamii EOOl基因組DNA為模板，第一輪PCR以T-PrimerF和 Csn-REl為引物，第二輪PCR以T-PrimerF和Csn_RE2為引物。將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-csnAP)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到Aus csnA 5'端啟動(dòng)子序列。(4)Aus csnA 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的克隆采用先前我們發(fā)明的一種T載體介導(dǎo)的 PCR方法，以經(jīng)處理的A. usamii EOOl基因組DNA為模板，第一輪PCR以Csn-Fl和T-PrimerR 為引物，第二輪PCR以Csn-F2和T-PrimerR為引物。將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-CSnA3T)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到Aus csnA 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列。(5)Aus csnA的生物信息學(xué)分析將Aus csnA的5'和3'端mRNA序列進(jìn)行拼接，得到自轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至Poly(A)完整的mRNA序列；在NCBI上對(duì)開(kāi)放閱讀框架(OpenReading Frame)進(jìn)行分析，進(jìn)而推導(dǎo)出Aus CsnA的氨基酸序列；進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。將Aus csnA的編碼區(qū)DNA序列與其兩側(cè)序列進(jìn)行拼接，獲得完整DNA序列，并對(duì)其5 ’端啟動(dòng)子區(qū)域和3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。(6) Aus csnA內(nèi)含子序列的測(cè)定基于上述得到的Aus csnA完整mRNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物Csn-F和Csn-R。Csn-F 5' -GAATTCATGCACCTCCTAACCACCCT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位點(diǎn)Csn-R 5' -CCTAGGCTAAGTAAGCGTCGCAACCAA-3‘，含 Avr II 酶切位點(diǎn)以A. usamii EOOl基因組DNA為模板，Csn-F和Csn-R為引物進(jìn)行PCR，將其產(chǎn)物用 1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-csnA-DNA)，轉(zhuǎn)化JM109， 經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到Aus csnA的編碼區(qū)DNA序列。將編碼區(qū)DNA序列與mRNA序列用DNAMAN 6. 0進(jìn)行序列比對(duì)，得出Aus csnA的2個(gè)內(nèi)含子序列。(7)含編碼Aus CsnA成熟肽基因的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建基于上述得到的Aus csnA完整mRNA序列以及預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列，設(shè)計(jì)一條正向引物mCsn-F。mCsn-F 5' -GAATTC ATCCCCCCCAACCTATCC-3 ’，含 EcoR I 酶切位點(diǎn)按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 RT-PCR。以 Oligo dT-Adaptor Primer為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和mCsn-F 為引物進(jìn)行第一輪PCR;以mCsn-F和Csn-R為引物進(jìn)行第二輪PCR。將兩輪PCR產(chǎn)物用
瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-csnA)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確的pUCm-T-csnA與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I和Avr II進(jìn)行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒 pPIC9K-csnA(圖2)，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。(8)GS115/csnA的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及活性測(cè)定用Ml I對(duì)pPIC9K_csnA進(jìn)行線(xiàn)性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/ csnA ；按照手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用DNS法測(cè)定殼聚糖酶活性；發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析，得到電泳純的重組殼聚糖酶。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種宇佐美曲霉EOOl菌株新型殼聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列克隆，殼聚糖酶工程菌的構(gòu)建以及重組殼聚糖酶的高效表達(dá)和純化的方法，并對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。生物信息學(xué)分析表明來(lái)源于宇佐美曲霉EOOl的一種新型殼聚糖酶屬于糖苷水解酶的第75家族，命名為Aus CsnA，其相應(yīng)的基因命名為Aus csnA.Aus CsnA具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)、應(yīng)用潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖1 獲取A. usami i EOOl CsnA基因完整mRNA和DNA序列的流程2 重組質(zhì)粒pPIC9K_csnA的構(gòu)建示意圖
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 Aus csnA 3'端mRNA序列的克隆以O(shè)ligo dT-Adaptor Primer為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和Csn-Fl為引物進(jìn)行第一輪PCR，其反應(yīng)條件為94°C 2min，30個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 90s) ,72°C IOmin ；以 M13 Primer M4 和 Csn_F2 為引物進(jìn)行第二輪 PCR，其反應(yīng)條件為94°C 2min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 90s) ,72°C IOmin0 將兩輪 PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-CSnA3')，轉(zhuǎn)化 JM109,經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序。實(shí)施例2Aus csnA 5'端mRNA序列的克隆以 5' -Full RACE Kit 的 Outer Primer 和 Csn-REl 為引物進(jìn)行第一輪 PCR，其反應(yīng)條件為94°C 3min，30 個(gè)循環(huán)(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s) ,72 °C IOmin ；以 hner I^rimer和Csn-RE2為引物進(jìn)行第二輪PCR，其反應(yīng)條件為94°C 3min，30個(gè)循環(huán)(94°C 30s， 55 °C 30s, 72 °C 60s),72°C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-CSnA5')，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序。實(shí)施例3 Aus csnA 5'端啟動(dòng)子序列的克隆以經(jīng)處理的A. usamii EOOl基因組DNA為模板，第一輪PCR以Τ-PrimerF和 Csn-REl 為引物，反應(yīng)條件為94°C %iin，30 個(gè)循環(huán)(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s)， 72°C IOmin ；第二輪 PCR 以 T-PrimerF 和 Csn_RE2 為引物，反應(yīng)條件為:94°C，4min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72 °C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-csnAP)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序。實(shí)施例4 Aus csnA 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的克隆以經(jīng)處理的A. usamii EOOl基因組DNA為模板，第一輪PCR以Csn-Fl和T-PrimerR 為引物，反應(yīng)條件為:94°C 4min，30 個(gè)循環(huán)(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72 °C IOmin ；第二輪PCR以Csn-F2和T-PrimerR為引物，反應(yīng)條件為94°C %iin，30個(gè)循環(huán)(94°C 30s， 55 °C 30s, 72 °C 60s),72°C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-CSnA3T)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序。實(shí)施例5含編碼Aus CsnA成熟肽基因的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以O(shè)ligo dT-Adaptor I^rimer為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以mCsn-F 和M13 Primer M4為引物進(jìn)行第一輪PCR，反應(yīng)條件為94°C anin，30個(gè)循環(huán)(94°C 30s， 53°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；以 mCsn-F 和 Csn-R 為引物進(jìn)行第二輪 PCR，反應(yīng)條件為 94°C 2min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s，53°C 30s，72°C 45s)，72°C IOmin0 將第二輪 PCR產(chǎn)物用
瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-csnA)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確的pUCm-T-csnA與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I 和Avr II進(jìn)行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒 pPIC9K-cSnA，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。實(shí)施例6 GS115/csnA的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及活性測(cè)定用Ml I對(duì)pPIC9K-cSnA進(jìn)行線(xiàn)性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/CsnA。該基因工程菌用1. 0 %甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96h，采用DNS法測(cè)得發(fā)酵液中重組殼聚糖酶活性達(dá)80U/mL。發(fā)酵液經(jīng)離心后的上清液為重組Aus CsnA粗酶液，該粗酶液經(jīng)截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再經(jīng)DEAE-kpharose Fast Flow離子交換層析和kphadex G_75凝膠過(guò)濾層析純化，純化后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶，并顯示重組Aus CsnA的分子量為MkDa。該重組Aus CsnA的最適作用溫度50°C，最適作用pH 5. 0，該酶在pH 4. 0-7. 0、50°C以下穩(wěn)定。
權(quán)利要求
1.一種來(lái)源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株糖苷水解酶第75家族 (GH75)的新型殼聚糖酶基因(Aus csnA)，其完整mRNA和DNA的核苷酸序列分別為SEQ ID NO :1 禾口 SEQ ID NO :2。
2.由權(quán)利要求1所述的殼聚糖酶基因(AuscsnA)編碼的新型殼聚糖酶(Aus CsnA), 其完整的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于序列表中的為SEQ ID NO :3。
3.Aus csnA完整mRNA和DNA序列的獲取方法(1)AuscsnA 3' ^m mRNA ^lJ W3 HAspergillus fumigatus> Aspergillus oryzae和Aspergillus terreus GH75的殼聚糖酶序列進(jìn)行同源比對(duì)，找出兩段約8個(gè)氨基酸的保守序列，再對(duì)該兩段氨基酸序列的mRNA進(jìn)行同源比對(duì)，設(shè)計(jì)兩條正向簡(jiǎn)并引物 Csn-Fl 禾口 Csn-F2 ；Csn-Fl :5，-ATGGACAT(A/T)GACTGCGA(C/T)GG-3，Csn-F2 :5，-GCCAATAT(A/C)CA(T/C)CC(G/C)TATGTGGT-3，以A. usamii EOOl總RNA為模板，Oligo dT-Adaptor Primer為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和Csn-Fl為引物進(jìn)行第一輪PCR，其反應(yīng)條件為94°C 2min, 30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s，52°C 30s，72°C 90s)，72°C IOmin ；以 M13Primer M4 和 Csn_F2 為引物進(jìn)行第二輪 PCR，其反應(yīng)條件為94 °C 2min，30 個(gè)循環(huán)(94 °C 30s, 52 °C 30s, 72 °C 90s), 72°C 1 Omin ；目的條帶經(jīng)克隆、測(cè)序，得到Aus csn 3'端mRNA序列;(2)Aus csnA 5 ‘端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus csnA 3 ‘端mRNA序列，設(shè)計(jì)兩條反向引物Csn-REl和Csn-RE2 ；Csn-REl TTTGGTCTTGGATGGACTCGCsn-RE2 CCCGTCGCAGTCTATGTCCA以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一條鏈為模板、Outer I^rimer和Csn-REl為引物進(jìn)行第一輪 PCR，其反應(yīng)條件為94°C 3min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s) ,72°C IOmin ； 以hner Primer和Csn_RE2為引物進(jìn)行第二輪PCR，其反應(yīng)條件為94°C 3min,30個(gè)循環(huán) (94°C 30s，55°C 30s，72°C 60s)，72°C IOmin ；目的條帶經(jīng)克隆、測(cè)序，得到 Aus csnA 5'端 mRNA序列；(3)Aus csnA 5'端啟動(dòng)子序列的克隆以經(jīng)處理的A. usamii EOOl基因組DNA為模板，第一輪PCR以T-PrimerF和Csn-REl為引物，反應(yīng)條件為94°C 4min,30個(gè)循環(huán) (94°C 30s, 55°C 30s，72°C 60s)，72°C IOmin ；第二輪 PCR 以 T-PrimerF 和 Csn_RE2 為引物， 反應(yīng)條件為94°C，4min, 30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；目的條帶經(jīng)克隆、測(cè)序，得到Aus csnA 5'端啟動(dòng)子序列；(4)AuscsnA 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列的克隆以經(jīng)處理的A. usamii EOOl基因組DNA 為模板，第一輪PCR以Csn-Fl和T-PrimerR為引物，反應(yīng)條件為94 °C %iin，30個(gè)循環(huán) (94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s) ,72°C IOmin ；第二輪 PCR 以 Csn_F2 和 T-PrimerR 為引物，反應(yīng)條件為94°C 4min，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；將兩輪 PCR 產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-CSnA3T)，轉(zhuǎn)化 JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序得到Aus csnA 3'端轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列；
4.Aus CsnA工程菌的構(gòu)建和表達(dá)方法(1)含編碼Aus CsnA成熟肽基因的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以M13 Primer M4和mCsn_F為引物進(jìn)行第一輪 PCR(94°C 2min ；30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 60s ；72°C IOmin)；以 mCsn-F 和 Csn-R 為引物第二輪 PCR(94 °C 2min ；30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 45s ； 72°C IOmin)；將第二輪PCR的目的條帶進(jìn)行克隆、測(cè)序；測(cè)序正確的pUCm-T-csnA與pPIC9K 質(zhì)粒均用EcoR I和Avr II進(jìn)行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-cSnA，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定；(2)GS115/CsnA的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及活性測(cè)定用Ml I對(duì)pPIC9K-CSnA進(jìn)行線(xiàn)性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/CsnA; 該工程菌用1. 0%甲醇誘導(dǎo)96h，DNS法測(cè)得發(fā)酵液中重組殼聚糖酶活性達(dá)80U/mL ；發(fā)酵液經(jīng)離心后的上清液為重組Aus CsnA粗酶液，經(jīng)截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再經(jīng) DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和kphadex G_75凝膠過(guò)濾層析純化，純化后經(jīng) SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶，并顯示重組殼聚糖酶分子量為MkDa ；該重組殼聚糖酶最適作用溫度50°C，最適作用pH 5.0，該酶在？!1 4.0 7.0、501以下穩(wěn)定。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的新型殼聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆方法，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。生物信息學(xué)分析表明該殼聚糖酶屬于糖苷水解酶第75家族，命名為Aus CsnA，其氨基酸序列為SEQ ID NO3，相應(yīng)的基因命名為Aus csnA。本發(fā)明還公開(kāi)了Aus CsnA工程菌的構(gòu)建以及重組Aus CsnA的高效表達(dá)和純化的方法，制備的重組Aus CsnA的最適作用溫度和pH分別為50℃和5.0，在pH 4.0-7.0、50℃以下穩(wěn)定，具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/56GK102392035SQ20111041046
公開(kāi)日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
發(fā)明者史紅玲, 李劍芳, 胡蝶, 鄔敏辰, 陳忠法 申請(qǐng)人:江南大學(xué)