專利名稱：計算機輔助β-1,4-內切木聚糖酶(Aus Xyn11A)熱穩(wěn)定性的定向改造的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的常溫木聚糖酶 (Aus XynllA)基因進行熱穩(wěn)定性的定向改造，雜合木聚糖酶工程菌的構建及重組雜合木聚糖酶的高效表達的方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
β-1,4-內切木聚糖酶(endo-^-l,4-xylanase, EC 3. 2. 1.8)，它能從木聚糖主鏈的內部隨機切割木糖苷鍵，將其降解成寡聚木糖、木二糖和少量木糖，是木聚糖降解酶中最關鍵的酶。近幾年，由于木聚糖酶在飼料工業(yè)、食品加工及能源等行業(yè)具有潛在的工業(yè)應用和經濟價值，尤其是在造紙工業(yè)上的應用，減少因漂白產生的環(huán)境污染，受到了越來越多的關注。然而在工業(yè)應用中經常遇到的極端環(huán)境，如紡織、造紙工業(yè)中的高溫條件，已成為木聚糖酶發(fā)展的瓶頸。因此對木聚糖酶耐熱性的研究也引起了國內外研究者的高度重視。 開發(fā)耐熱性木聚糖酶的研究主要包括篩選產耐熱木聚糖酶的微生物菌株和利用基因工程對酶分子進行定向改造，相對于篩菌技術的盲目性，后者具有更強的針對性。根據對催化區(qū)的保守氨基酸和疏水簇的分析，木聚糖酶屬于糖苷水解酶(GH)第 5、第7、第8、第10、第11和第43家族，其中大部分屬于第10和第11家族。由于G/11家族的木聚糖酶分子的分子量較小，并且結構相對簡單，比較適合作為理論研究的分子模型，以及用于極端條件下木聚糖酶催化模式系統(tǒng)及蛋白質分子折疊機理等的研究?；蚬こ碳夹g和生物信息學以及計算機科學的快速發(fā)展，為分子生物學的研究開辟了新的前景。我們可以運用大規(guī)模高性能的計算機及其相關軟件，利用計算機模擬試驗對酶分子進行定向改造提高其熱穩(wěn)定性，然后使用基因工程的手段對木聚糖酶的進行改造，以加速木聚糖酶在各種領域中的應用過程。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種利用計算機技術與生物信息學相結合的方法對常溫的木聚糖酶進行理性設計，并運用基因工程的方法構建產耐熱雜合木聚糖酶的工程菌。已從 A.usamii發(fā)酵曲中分離純化了一種11家族木聚糖酶蛋白(Aus XynllA)，并對酶基因(Aus xynllA)進行了克隆和表達(Genbank :DQ302412)。Aus XynllA最適作用溫度50°C，且催化活性較高，如若提高其熱穩(wěn)定性，則該酶有較大的工業(yè)化生產和潛力以及較高的經濟價值。本發(fā)明的技術方案通過以耐熱木聚糖酶為模板，對常溫木聚糖酶Aus XynllA進行定向改造，得到耐熱雜合木聚糖酶EvAus XynllA,其mRNA序列和氨基酸序列分別為SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO :2。A. usamii EOOl菌株由江南大學篩選和保藏，已于2005年在《食品與發(fā)酵工業(yè)》雜志的Vol. 31，No. 4，Pg. 50公開，本發(fā)明人承諾該菌株在20年內向公眾發(fā)放。所述的重組木聚糖酶的活性測定方法
于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 4. 6、檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制的質量濃度為0.5%的樺木木聚糖(Sigma，USA)溶液2. 4mL，50°C預熱lOmin，在A管中加入0. ImL 適當稀釋的酶液，50°C準確反應15min;立即各加入2. 5mL 3' ,5' - 二硝基水楊酸(DNS) 試劑，在B管中再補加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷卻后各加去離子水5mL，搖勻； 540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從木糖標準曲線上查出相應的還原糖 (以木糖計)含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測定條件下，以每分鐘產生 1 μ mol還原糖所需的酶量定義為1個木聚糖酶活性單位(IU)。耐熱雜合木聚糖酶基因的設計、克隆及表達(1)同源建模模擬Aus XynllA的空間結構登錄蛋白質結構數據庫ftOtein data bank (http //rcsb. org),經BLAST比對，找到與Aus XynllA具有高度同源的耐熱木聚糖酶序列。本實驗選擇具有非常高的熱穩(wěn)定性的木聚糖酶EvXynATS(Protein Data Bank登錄號為2VUL，本實驗室已經合成這段基因序列)為模板，并且兩者的同源性為63. 21%，運用 SWISS-MODEL服務器在線全自動為Aus XynllA構建空間結構。運用軟件Verify_3D對同源建模的結構模型進行評估和優(yōu)化，獲得準確性較高的空間結構模型。其中，由于Aus XynllA 存在一段長度為37個氨基酸的信號肽，因此在同源建模過程中去掉這一段序列，為了保證后續(xù)分子動力學研究的準確性，需要充分評估建模獲得的三級結構的可靠性。(2)利用分子動力學(Molecular Dynamics,MD)模擬的方法理性設計耐熱雜合基因使用GR0MACS4. 0軟件對由(1)得到的Aus XynllA空間結構和耐熱型EvXynATS分別進行分子動力學模擬。采用的力場是GR0M0S96力場，該力場中蛋白的立場參數數據均給予實驗值擬合。模擬溫度為300K，溶劑采用TIP3P水模型。對于每個模擬體系，均在溶質外圍加上1.5nm的水分子層。MD模擬之前，對體系分別進行了兩次能量優(yōu)化，首先約束溶質，用最陡下降法優(yōu)化800步，再用共軛梯度法優(yōu)化1200步。然后去約束后再進行800步最陡下降法優(yōu)化，1200步共軛梯度法優(yōu)化。MD模擬分為兩步首先進行20ps的約束溶質分子的MD 模擬；而且溫度從OK逐步升高到300K，接著進行500ps的無約束恒溫MD模擬。最后得到其總體能量，RMSD值及Aus XynllA各個氨基酸的B_factor值。(3)雜合基因EvAus xynllA及其表達質粒的構建根據GenBank上EvXynATS基因序列(登錄號為EU591743)及AusxynlIA設計引物XynllAsc-F 5' -GAATTCAACGCTCAAACTTGTCTTACC-3‘，含 EcoR I 酶切位點XynllAsc-Rl 5' -TCCACTGCCTGGTGGACGCCAACTACC-3’，含公共序列XynllAsc-Fl 5' -CGTCCACCAGGCAGTGGAGGCACATAC-3’，含公共序列XynllAsc-R 5' -GCGGCCGCTTACTGAACAGTGATGGACG-3‘，含 Not I 酶切位點以本實驗保存的 pUCm-T-EvXynATS 為模板，以 Xynl IAsc-F 和 Xynl IAsc-Rl 為引物進行第一輪PCR ；以pUCm-T-Aus xynllA(實驗室保藏)為模板，以XynllAsc-Fl和 XynllAsc-R為引物進行第二輪PCR;將兩輪PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，純化后混合、在無引物的情況進行第三輪PCR;以第三輪PCR反應液為模板，以XynllAsc-F和 XynllAsc-R為引物進行第四輪PCR(圖1)。將第四輪PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析， 割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-EvAus xynllA)，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序。將測序結果正確的pUCm-T-EvAus xynllA與pPIC9K質粒均用EcoR I和NotI進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒 pPIC9K-EvAus xynllA(圖2)，并對重組表達質粒進行序列測定。(4)GS115/EvAusxynllA重組子的構建、表達及酶活的測定用Sal I對 pPIC9K-EvAus xynllA進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/EvAUSXynllA ；按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用DNS法測定重組木聚糖酶活性。


圖1 獲取雜合EvAus xynllA基因序列的流程2 重組質粒pPIC9K_EvAus xynllA的構建示意圖
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1同源建模模擬Aus XynllA及其雜合蛋白的空間結構登錄蛋白質結構數據庫ftOteindata bank(http//rcsb. org),經BLAST 比對，找到與Aus XynllA具有高度同源序列。本實驗選擇具有非常高的熱穩(wěn)定的EvXynWProtein Data Bank登錄號為2VUL)為模板，并且兩者的同源性為63. 21%，運用SWISS-MODEL服務器在線全自動為Aus XynllA構建空間結構。運用軟件Verify_3D對同源建模的結構模型進行評估和優(yōu)化，獲得準確性較高的空間結構模型。實施例2利用分子動力學模擬的方法理性設計耐熱雜合基因分別對通過同源建模獲得的野生型Aus XynllA的晶體結構和耐熱型EvXynATS進行分子動力學模擬。主要包括以下幾步首先我們對空間結構進行預處理，使用GR0MACS中的pdb2gmx命令添加所有缺失的氫原子，并輸出一個包含所有原子信息的.gro文件。該命令的格式為pdb2gmx-f llbs.pdb-o libs, gro-p libs, top-ignh-ter第二步利用GR0MACS中的editconf和genbox命令為Aus XynllA空間結構添加適當的水溶液來模擬Aus XynlIA在水溶液中的運動。其中溶劑采用TIP3P水模型，對于模擬的體系，在溶質外圍加上1. 5nm的水分子層。其具體過程是首先使用editconf 命令定義盒子的大小，然后用genbox命令讀入GR0MACS的結構文件，并讀入水盒子的大小，輸出文件包含分子文件和水盒子。同時genbox更改原來的top文件，使其含有水分子。該命令的格式為Editconf-f libs. gro_o llbs_box. gro-bt cubic-d 1. 5Genbox-cp llbs_box. gro-cs-p libs, top-o llbs_water. gro第三步用金屬離子平衡體系的電荷，命令格式為grompp-f em. mdp-c llbs_water_ion. gro-p libs, top-o minimize—water, tprgenion-s minimize—water. tpr_o llbs_water_ion. gro-p libs.top-pname Na+_np 10-random-gtrp—ion· loggenion-s minimize—water. tpr~o libs—water—ion. gro-p libs, top-nname CL-
6-nn l-random-gtrp_ion. log并且需要手動對得到的llbs_Water_i0n. gro與libs, top文件中的原子數目進行修改，與添加的金屬離子相匹配。第四步分別利用grompp和mdrim兩個命令進行能量最小化處理。首先約束溶質， 用最陡下降法優(yōu)化800步，再用共軛梯度法優(yōu)化1200步。然后去約束后再進行800步最陡下降法優(yōu)化，1200步共軛梯度法優(yōu)化。命令格式為grompp-f emstl. mdp-c 1lbs_water_ion. gro-ρ libs.top-o minimize—water, tprmdrun _s minimize—water, tpr _o minimize—water, trr _c minimize— water, gro —eminimize—water, edr-g minimize—water, loggrompp-f emst. mdp-c minimize—water· gro_p libs, top-o minimize—water· tprmdrun _s minimize—water, tpr _o minimize—water, trr _c minimize— water2. gro —eminimize—water, edr -g minimize—water, log第五步分子動力學模擬分為兩步，首先進行20ps的約束溶質的MD模擬；而且模擬溫度從OK逐步升高到300K然后進行500ps的無約束恒溫MD模擬。命令格式為grompp-f pr. mdp-c minimize—water2. gro_p libs, top-o minimize—waterL tprmdrun-s minimize—waterL tpr_o minimize—water 1. trr_c minimize—waterL gro—eminimize—waterL edr-g minimize—waterL loggrompp-f full, mdp _c minimize—waterL gro_p libs, top-o minimize—water2. tprmdrun _s minimize—water2. tpr_o minimize—water2. trr _c minimize—water3. gro—eminimize—water2. edr-g minimize—water2. log最后得到其總體能量，RMSD值及Aus XynllA各個氨基酸的B_factor值。命令格式為g_rms-s minimize—waterL tpr-f minimize—waterL trr_o rms. xvgxmgrace-nxy rms. xvgg_rmsf-s minimize_water2. tpr-f minimize_water2. trr~b 400_e 600~o rmsf. xvg-oq 1. pdbxmgrace-nxy rmsf. xvgg—energy-f minimize—water2_o energy, xvgxmgrace-nxy energy, xvg我們分別將MD得到的Aus XynllA和已知的EvXynATS各個氨基酸的B-factor 值導入到PDB文件中，使用B-FITTER軟件導出各個氨基酸的B-factor值，由圖可以看出 EvXynATS序列中各氨基酸的柔性較小，波動幅度較為平均，而Aus XynllA序列尤其是N端較為不穩(wěn)定，可通過N端序列替換方法進行分子改造。我們分別隨機的將Aus XynllA的N 端分別用EvXynATS相應的序列進行替換改造，然后我們以EvXynATS為模板，分別對雜合木聚糖酶進行同源建模，運用分子動力學模擬方法分別對雜合蛋白進行總體能量及RMSD值的計算。由結果我們得出將Aus XynllA的N端96個氨基酸由EvXynATS&N端102個氨基酸替換時，其總體能量和RMSD值最小，即熱穩(wěn)定性最好。
實施例3雜合基因EvAus xynllA及其表達質粒的構建采用重疊PCR技術構造融合基因EvAus xynllA，主要分為四步以XynllAsc-F和 XynllAsc-Rl 為引物進行第一輪 PCR(94°C 2min ；30 個循環(huán)，94°C 30s, 54°C 30s, 72°C 30s ； 72°C IOmin)；以 XynllAsc-Fl 和 XynllAsc-R 為引物進行第二輪 PCR(94°C 2min ；30 個循環(huán)， 940C 30s,54°C 30s, 72°C 30s ；72°C IOmin)；將兩輪PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶，分別純化后混勻，在無引物的條件下進行第三輪PCR(94°C 2min ；10個循環(huán)，94°C 30s, 50°C 30s,72°C 45s ；72°C IOmin)；以第三輪 PCR 反應液為模板，以 XynlIAsc-F 和 Xyn 1 IAsc-R 為引物進行第四輪 PCR(94°C 2min ；30 個循環(huán)，94°C 30s，54°C 30s, 72°C 45s ； 72°C IOmin)。將第四輪PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T 連接(pUCm-T-EvAus xynllA)，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序。將測序正確的pUCm-T-EvAus xynllA與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-EvAus xynllA,并對重組表達質粒進行序列測定。實施例4 GS115/EvAus xynllA重組子的構建、表達及酶活的測定用Ml I對pPIC9K-EvAus xynllA進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/EvAUSXynllA。該工程菌用1.0%甲醇誘導 96h,DNS法測得發(fā)酵液中重組木聚糖酶活性達5IU/mL。酶學性質分析結果表明該重組木聚糖酶最適作用溫度60°C。
權利要求
1.一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的木聚糖酶(Aus XynllA)與耐熱木聚糖酶EvXynATS的耐熱雜合木聚糖酶EvAus Xynl 1A，其核苷酸序列對應于序列表中的 SEQ ID NO 1。
2.由權利要求1所述的耐熱雜合木聚糖酶基因(EvAusxynllA)編碼的耐熱木聚糖酶 (EvAus XynllA)，其完整的氨基酸序列對應于序列表中的SEQ ID NO :2。
3.理性設計耐熱雜合基因使用GR0MACS4. 0軟件分別對通過同源建模獲得的野生型Aus XynllA的晶體結構和耐熱型EvXynATS進行分子動力學模擬，主要包括以下幾步采用的力場是GR0M0S96力場，該力場中蛋白的立場參數數據均給予實驗值擬合，模擬溫度為300K，溶劑采用TIP3P水模型；對于每個模擬體系，均在溶質外圍加上1. 5nm的水分子層；MD模擬之前，對體系分別進行了兩次能量優(yōu)化，首先約束溶質，用最陡下降法優(yōu)化800步，再用共軛梯度法優(yōu)化1200步；然后去約束后再進行800步最陡下降法優(yōu)化，1200步共軛梯度法優(yōu)化；MD模擬分為兩步首先進行20ps的約束溶質分子的MD模擬；而且溫度從OK逐步升高到300K，接著進行500ps的無約束恒溫MD模擬；最后得到其總體能量，RMSD值及Aus XynllA各個氨基酸的B_factor 值；分別將MD得到的Aus XynllA和已知的EvXynATS各個氨基酸的B_factor值導入到PDB 文件中，使用B-FITTER軟件導出各個氨基酸的B-factor值，由圖可以看出EvXynATS序列中各氨基酸的柔性較小，波動幅度較為平均，而Aus XynllA序列尤其是N端較為不穩(wěn)定，可通過N端序列替換方法進行分子改造；分別隨機的將Aus XynllA的N端分別用EvXynATS相應的序列進行替換改造，然后我們以EvXynATS為模板，分別對雜合木聚糖酶進行同源建模， 運用分子動力學模擬方法分別對雜合蛋白進行總體能量及RMSD值的計算；由結果我們得出將Aus XynllA的N端96個氨基酸由EvXynATS的N端102個氨基酸替換時，其總體能量和RMSD值最小，即熱穩(wěn)定性最好。
4.融合基因EvAusxynllA序列的獲取方法根據GenBank上EvXynATS基因序列(登錄號為ETO91743)及Aus xynllA設計引物Xyn IlAsc-F 5' -GAATTCAACGCTCAAACTTGTCTTACC-3‘，含 EcoR I 酶切位點Xyn IlAsc-Rl 5' TCCACTGCCTGGTGGACGCCAACTACC-3’，含公共序列Xyn IlAsc-Fl 5' -CGTCCACCAGGCAGTGGAGGCACATAC-3’，含公共序列Xyn IlAsc-R 5' -GCGGCCGCTTACTGAACAGTGATGGACG-3‘，含 Not I 酶切位點采用重疊PCR技術構造融合基因EvAus xynllA，主要分為四步以XynlIAsc-F和 XynllAsc-Rl 為引物進行第一輪 PCR(94°C 2min ；30 個循環(huán)，94°C 30s, 54°C 30s, 72°C 30s ； 72°C IOmin)；以 XynllAsc-Fl 和 XynllAsc-R 為引物進行第二輪 PCR(94°C 2min ；30 個循環(huán)， 940C 30s,54°C 30s, 72°C 30s ；72°C IOmin)；將兩輪PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶，分別純化后混勻，在無引物的條件下進行第三輪PCR(94°C 2min ；10個循環(huán)，94°C 30s, 50°C 30s,72°C 45s ；72°C IOmin)；以第三輪 PCR 反應液為模板，以 XynlIAsc-F 和 Xyn 1 IAsc-R 為引物進行第四輪 PCR(94°C 2min ；30 個循環(huán)，94°C 30s，54°C 30s, 72°C 45s ； 72°C IOmin)；將第四輪PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，目的條帶經克隆、測序，得到融合基因EvAus xynllA序列。
5.EvAus XynllA工程菌的構建和表達方法(1)含EvAusxynllA基因的表達質粒的構建將測序正確的PUCm-T-EvAus xynllA與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切， 回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-EvAus xynllA, 并對重組表達質粒進行序列測定；(2)GS115/EvAusxynllA 的構建、表達及活性測定用 Sal I 對 pPIC9K_EvAus xynllA 進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子 GS115/EvAus xynllA ；該工程菌用1. 0%甲醇誘導96h，DNS法測得發(fā)酵液中重組木聚糖酶活性達5IU/mL ；該重組木聚糖酶最適作用溫度60°C。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種通過計算機技術與生物信息學相結合的手段獲得耐熱雜合木聚糖酶EvAus Xyn11A的方法，其核苷酸和氨基酸序列分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。本發(fā)明公開了利用分子動力學模擬理性設計耐熱雜合基因的方法，并通過重疊PCR獲得了這一雜合基因EvAus xyn11A；此外本發(fā)明還公開了EvAus Xyn11A工程菌的構建以及重組EvAus Xyn11A異源表達的方法，制備的重組EvAus Xyn11A的最適作用溫度60℃，具有較大的工業(yè)化生產潛力和經濟價值。
文檔編號C12N1/19GK102492676SQ20111041049
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月12日 優(yōu)先權日2011年12月12日
發(fā)明者張慧敏, 李劍芳, 殷欣, 汪俊卿, 鄔敏辰 申請人:江南大學