專利名稱：β-1,4-內(nèi)切甘露聚糖酶(Tvi Man5A)基因的克隆及重組酶的制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及來源于綠色木霉(Trichoderma viride)WL 0422的一種新型β -甘露聚糖酶基因序列的克隆，新型β-甘露聚糖酶工程菌的構建，以及重組β-甘露聚糖酶的高效表達和純化的方法，屬于微生物基因工程技術領域。
背景技術：
β -甘露聚糖酶(β -l，4-D-mannan mannohydrolase, EC 3. 2. 1. 78)是一種能從均一甘露聚糖和異甘露聚糖主鏈的內(nèi)部降解β-1，4-甘露糖苷鍵的水解酶，屬于半纖維素酶類，其廣泛地存在于微生物、植物和動物中。它可以廣泛應用于食品、醫(yī)藥、飼料、造紙、印染和石油工業(yè)等領域。在食品和醫(yī)藥領域，β-甘露聚糖酶作用于甘露聚糖后可以產(chǎn)生功能性低聚糖，這種低聚糖可以有效地降低人體血糖和膽固醇水平且有利于人和動物腸道內(nèi)益生菌群的生長，進而調(diào)節(jié)人和動物的免疫系統(tǒng)、提高免疫力。在飼料工業(yè)中，它作為飼料添加劑能有效降解植物細胞壁中的甘露聚糖成分，消除抗營養(yǎng)因子，提高能量利用率、改善飼料轉(zhuǎn)化率。在造紙工業(yè)中，甘露聚糖酶和木聚糖酶等半纖維素降解酶類協(xié)同使用， 處理紙漿，能明顯改善紙質(zhì)。將甘露聚糖酶運用紡織印染的漂白工藝中，能有效地去除產(chǎn)品上粘附的多余染料，更可以減少氯和堿的用量以及它們帶來的環(huán)境污染問題，有利于生態(tài)環(huán)境的保護。另外，在酶法降解可再生生物質(zhì)資源生產(chǎn)燃料酒精的工藝中添加一定量的β -甘露聚糖酶可以促進可發(fā)酵糖的產(chǎn)生，進一步促進燃料酒精的生產(chǎn)，緩解全球的能源危機。目前已報道的能產(chǎn)甘露聚糖酶的微生物主要來自于細菌、真菌和放線菌，例如細菌中的枯草芽孢桿菌，真菌中的曲霉、木霉、青霉、酵母，以及放線菌中的鏈霉菌等。根據(jù)序列同源性和空間結(jié)構分析，多數(shù)β-甘露聚糖酶都屬于糖苷水解酶第5、26和113家族。 目前，關于第5家族β -甘露聚糖酶的報道較多，它們的最適PH值為3. 0 7. 5，最適溫度在 45 92°C。近年來，隨著對自然界中半纖維素資源的開發(fā)、飼糧中甘露聚糖抗營養(yǎng)因子的消除以及甘露寡糖生理功能的發(fā)現(xiàn)，β-甘露聚糖酶的需求量越來越大，導致對β-甘露聚糖酶的研究和開發(fā)進入一個新高潮。但就國內(nèi)外相關文獻或?qū)＠麍蟮纴砜?，微生物甘露聚糖酶發(fā)酵酶活性普遍不高，導致了生產(chǎn)成本很高，從而阻礙了該酶在眾多領域中的廣泛應用。為了提高甘露聚糖酶的發(fā)酵產(chǎn)率和酶活性，早期的研究工作主要集中在產(chǎn)酶菌種的篩選、誘變、產(chǎn)酶誘導，酶的分離純化及性質(zhì)，酶水解底物方式及應用等方面。進入90 年代，隨著基因工程技術和蛋白質(zhì)工程技術的廣泛應用，研究工作逐步轉(zhuǎn)向酶基因的克隆和表達以及酶活性位點的研究等方面。目前，雖已有一些有關甘露聚糖酶基因的克隆和表達的文獻和專利報道，但有關來源于綠色木霉(Trichoderma viride) β -甘露聚糖酶基因的克隆和表達等的研究未見有報道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型甘露聚糖酶基因序列的克隆，新型甘露聚糖酶工程菌的構建，以及重組甘露聚糖酶的高效表達和純化的方法。生物信息學分析表明來源于Τ. Viride WL 0422的一種新型β -甘露聚糖酶屬于糖苷水解酶的第5家族，命名為Tvi Man5A，其相應的基因命名為Tvi man5A。Tvi Man5A具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)、應用潛力和經(jīng)濟價值。本發(fā)明的技術方案一種源自T. viride WL 0422的新型β -甘露聚糖酶基因完整的核苷酸序列為SEQ ID NO=I0Τ. viride WL 0422菌株由江南大學篩選和保藏，該菌株已于2006年在《江蘇食品與發(fā)酵》雜志的No. IPg. 1公開，本發(fā)明人承諾該菌株在20年內(nèi)向公眾發(fā)放。所述的重組β -甘露聚糖酶的氨基酸序列為SEQ ID NO :2。所述的重組β -甘露聚糖酶的活性測定方法于25mL具塞試管A和B中，各加入用ρΗ 4. 8、乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的質(zhì)量濃度為0. 5%的角豆膠溶液2. 4mL，50°C預熱lOmin，在A管中加入0. ImL適當稀釋的酶液，50°C 準確反應IOmin ；立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補加 0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從甘露糖標準曲線上查出相應的還原糖(以甘露糖計)含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測定條件下，以每分鐘產(chǎn)生1 μ mol還原糖所需的酶量定義為1個β -甘露聚糖酶活性單位(IU)。所述的新型β -甘露聚糖酶基因序列的克隆和表達方法(1) β-甘露聚糖酶基因3'端mRNA序列的克隆首先對Aspergillus usamii(GenBank HQ839639) > Aspergillus sulphureus(GenBank DQ328335)禾口 Trichoderma reesei (GenBank L25310) β -甘露聚糖酶的氨基酸序列進行同源比對，找出兩段約10個氨基酸的保守序列；再對它們的核酸序列進行同源比對，設計兩條正向簡并引物 Man5A-3Fl 和 Man5A_3F2。Man5A-3Fl 5 ‘ -GTATGGGGCTTCAACGACGTC-3‘Man5A-3F2 :5, -AC(C/A/G)ATCAAC ACGGG(C/T/A)GCCGA-3‘提取T. viride WL 0422 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. 0)說明書進行RT-PCR擴增。將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與 pUCm-Τ載體連接(pUCm-T-man5A3 ‘)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到T. viride WL 0422新型β-甘露聚糖酶基因3'端mRNA序列。(2) β-甘露聚糖酶基因5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的β -甘露聚糖酶基因3 ‘端mRNA序列，設計兩條反向引物Man5A-5Rl和Man5A_5R2。Man5A-5Rl 5‘ -GGATGACGAGCTTGAGGTTA-3‘Man5A-5R2 5‘ -ACTACATAGTCGAGCGTTTG-3‘按照TaKaRa 5' -Full RACE Kit說明書進行5' -RACE。將兩輪PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-man5A5')，轉(zhuǎn)化JM109， 經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到T. viride WL 0422新型β-甘露聚糖酶基因5' 端mRNA序列。(3) β -甘露聚糖酶基因(Tvi man5A)的生物信息學分析將Tvi man5A的5'和3 ‘端mRNA序列進行拼接，得到自轉(zhuǎn)錄起始位點至poly (A)的完整mRNA序列；在NCBI上對開放閱讀框架(Open Reading Frame)進行分析，進而推導出Tvi Man5A的氨基酸序列；最后進行信號肽預測。(4)構建含編碼β -甘露聚糖酶成熟肽基因的表達質(zhì)?；谏鲜龅玫降摩?-甘露聚糖酶基因完整mRNA序列以及預測的信號肽序列，設計一對引物Man5A-F、Man5A-R進行編碼成熟肽cDNA的合成。Man5A-F 5' GAATTCGCTTCGAGCTTTGTAACCAT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位點Man5A-R 5' GCGGCCGCTCATGTATTCAGGCATTGCG-3 ’，含 Not I 酶切位點按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)使用說明書進行 RT-PCR。以 Oligo dT-Adaptor Primer為引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13Primer M4和Man5A_F 為引物進行第一輪PCR ；以Man5A-F和Man5A-R為引物進行第二輪PCR。將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-man5A)，轉(zhuǎn)化 JM109,經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。將測序結(jié)果正確的pUCm-T_man5A與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質(zhì)粒 pPIC9K-man5A(圖1)，并對重組質(zhì)粒進行序列測定。(5)GS115/man5A的構建、表達、產(chǎn)物純化及活性測定用&ic I對pPIC9K_man5A 進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/ man5A ；按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用DNS法測定重組β -甘露聚糖酶活性；發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過濾層析，得到電泳純的重組β-甘露聚糖酶。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種新型甘露聚糖酶基因序列的克隆，新型β -甘露聚糖酶工程菌GS115/man5A的構建，以其重組β -甘露聚糖酶的高效表達和純化的方法。生物信息學分析表明來源于Τ. viride WL 0422的一種新型β -甘露聚糖酶屬于糖苷水解酶第5家族，命名為Tvi Man5A，其相應的基因命名為Tvi man5A。Tvi Man5A具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)、應用潛力和經(jīng)濟價值，也為其它β -甘露聚糖酶的研究奠定了理論基礎。


圖1 重組質(zhì)粒pPIC9K_man5A的構建示意圖
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1β-甘露聚糖酶基因3'端mRNA序列的克隆以01 igo dT-Adaptor Primer為引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以 M13Primer M4和Man5A_3Fl為引物進行第一輪PCR，其反應條件為94°C 2min，30個循環(huán)(94 "C 30s, 55 "C 30s, 72 "C 90s)，72 "C IOmin ；以 M13Primer M4 和 Man5A_3F2 為引物進行第二輪 PCR，其反應條件為94°C 2min，30 個循環(huán)(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 90s),720C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接 (pUCm-T-man5A3 ‘)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Tvi man5A 3 ‘ 端mRNA序列。實施例2β-甘露聚糖酶基因5'端mRNA序列的克隆以 5' -Full RACE Kit 的 Outer Primer 和 Man5A_5Rl 為引物進行第一輪 PCR， 其反應條件為94 °C 3min, 30 個循環(huán)(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s)，72 °C IOmin ；以 Inner Primer和Man5A_5R2為引物進行第二輪PCR，其反應條件為94°C 3min,30個循環(huán) (94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin0將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析， 割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-man5A5')，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到Tvi man5A 5'端mRNA序列。實施例3構建含編碼β -甘露聚糖酶成熟肽基因的表達質(zhì)粒以01 igo dT-Adaptor Primer為引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以 Man5A-F和M13Primer M4為引物進行第一輪PCR，反應條件為94°C 2min,30個循環(huán) (94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s)，72°C IOmin ；以 Man5A_F 禾口 Man5A_R 為弓丨物進行第二輪 PCR， 反應條件為94°C 2min, 30 個循環(huán)(94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s)，72°C lOmin。將第二輪PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-man5A)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。將測序結(jié)果正確的pUCm-T-man5A與pPIC9K 質(zhì)粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接， 得到重組質(zhì)粒pPIC9K-man5A，并對重組質(zhì)粒進行序列測定。實施例4GS115/man5A的構建、表達、產(chǎn)物純化及活性測定用Mc I對pPIC9K-man5A進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉(zhuǎn)化、篩選， 得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/man5A。該基因工程菌用1. 0%甲醇誘導表達96h， 采用DNS法測得發(fā)酵液中重組β -甘露聚糖酶活性達90IU/mL。發(fā)酵液經(jīng)離心后的上清液為重組β -甘露聚糖酶粗酶液，該粗酶液經(jīng)截留分子量為10，OOODa的超濾膜濃縮，再經(jīng) DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和kphadex G_75凝膠過濾層析純化，純化后經(jīng) SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示重組β -甘露聚糖酶的分子量為50kDa。該重組β -甘露聚糖酶的最適作用溫度70°C，最適作用ρΗ 3.5，該酶在？!1 3. 0-7. 0、60°C以下穩(wěn)定；金屬離子Al3+、Ca2+對酶活性有明顯的激活作用，而Ag+則具有很強的抑制作用。
權利要求
1.一種來源于T. Viride WL 0422的新型β -甘露聚糖酶基因，其核苷酸和氨基酸序列分別為 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。
2.Τ. viride WL 0422新型β -甘露聚糖酶基因序列的克隆方法(1)β-甘露聚糖酶基因3'端mRNA序列的克隆首先對A. usamii、A. sulphureus和 Τ. reesei β -甘露聚糖酶的氨基酸序列進行同源比對，找出兩段約10個氨基酸的保守序列；再對它們的核酸序列進行同源比對，設計兩條正向簡并引物Man5A-3Fl和Man5A-3F2 ；Man5A-3F1:5' -GTATGGGGCTTCAACGACGTC-3‘Man5A-3F2 5' -AC(C/A/G)ATCAAC ACGGG(C/T/A)GCCGA-3‘以T. viride WL 0422總RNA為模板，Oligo dT-Adaptor Primer為引物反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA的第一條鏈；以Man5A-3Fl和M13 Primer M4為引物進行第一輪PCR，其反應條件為94°C 2min, 30 個循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s)，72°C IOmin ；以 Man5A_3F2 和 M13 ft~imerM4為引物進行第二輪PCR，其反應條件為94°C 2min，30個循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s， 72°C 90s)，72°C IOmin ；目的條帶經(jīng)克隆、測序，得到Tvi man5A 3'端mRNA序列；(2)β-甘露聚糖酶基因5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Tvi man5A 3'端 mRNA序列，設計兩條反向引物Man5A-5Rl和Man5A_5R2 ；Man5A-5Rl 5‘ GGATGACGAGCTTGAGGTTA-3‘Man5A-5R2 5‘ -ACTACATAGTCGAGCGTTTG-3‘以合成的 cDNA第一條鏈為模板，5' -Full RACE Kit 的 Outer Primer 禾口Man5A_5Rl 為引物進行第一輪PCR，其反應條件為94°C 3min，30個循環(huán)(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72 "C IOmin ；以hner Primer和Man5A_5R2為引物進行第二輪PCR，其反應條件為 94 0C 3min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72 °C IOmin ；目的條帶經(jīng)克隆、測序， 得到Tvi man5A5 ‘端mRNA序列；
3.T. viride新型β -甘露聚糖酶工程菌的構建和表達方法(1)構建含編碼TviMan5A成熟肽基因的表達質(zhì)粒以合成的cDNA第一條鏈為模板，第一輪PCR以Man5A-F和M13 Primer M4為引物，反應條件為94°C 2min，30個循環(huán) (94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s) ,72°C IOmin ；第二輪 PCR 以 Man5A-F 和 Man5A-R 為引物，反應條件為94°C 2min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s) ,72°C IOmin ；將第二輪 PCR 的目的條帶進行克隆、測序；測序結(jié)果正確的pUCm-T-man5A與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I和 Not I進行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組表達質(zhì)粒 pPIC9K-man5A,并對表達質(zhì)粒進行測序鑒定；(2)GS115/man5A的構建、表達、產(chǎn)物純化及活性測定用MeI對pPIC9K_man5A進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/ man5A;該基因工程菌用1.0%甲醇誘導表達96h，采用DNS法測得發(fā)酵液中重組β -甘露聚糖酶活性達90IU/mL ；發(fā)酵液經(jīng)離心后的上清液為重組β -甘露聚糖酶粗酶液，該粗酶液經(jīng)截留分子量為10，OOODa的超濾膜濃縮，再經(jīng)DEAE-kpharose Fast Flow離子交換層析和kphadex G-75凝膠過濾層析純化，純化后經(jīng)SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示重組 β -甘露聚糖酶的分子量為50kDa ；該重組β -甘露聚糖酶的最適作用溫度70°C，最適作用 PH 3. 5，在pH 3.0-7.0、60°C以下穩(wěn)定；金屬離子Al3+、Ca2+對酶活性有明顯的激活作用，而 Ag+則具有很強的抑制作用。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種源自綠色木霉(Trichoderma viride)WL 0422的新型β-甘露聚糖酶基因序列的克隆方法，其核苷酸序列為SEQ ID NO1。生物信息學分析表明該β-甘露聚糖酶屬于糖苷水解酶第5家族，命名為Tvi Man5A，其氨基酸序列為SEQ ID NO2，相應的基因命名為Tvi man5A。本發(fā)明還公開了β-甘露聚糖酶工程菌的構建以及重組β-甘露聚糖酶的高效表達和純化的方法，制備的重組β-甘露聚糖酶的最適作用溫度和pH分別為70℃和3.5，在pH3.0-7.0、60℃以下穩(wěn)定，具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟價值。
文檔編號C12N15/10GK102392036SQ20111041051
公開日2012年3月28日 申請日期2011年12月12日 優(yōu)先權日2011年12月12日
發(fā)明者唐存多, 李劍芳, 胡蝶, 鄔敏辰, 閔柔 申請人:江南大學