專利名稱：一種膠體金融合乳膠法半定量檢測(cè)鹽酸克倫特羅的檢測(cè)試劑、試劑條和試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鹽酸克倫特羅的檢測(cè)試劑，具體地說(shuō)是一種膠體金融合乳膠法半定量檢測(cè)鹽酸克倫特羅的檢測(cè)試劑、試劑條和試劑盒及其制備方法，屬于鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鹽酸克倫特羅(Clenbuterol，CL)，又名瘦肉精，分子式為C12H18C12N2q · HC1，藥品名為克喘素、氨哮素等，為白色或類白色的結(jié)晶粉末，無(wú)臭、味苦，易溶于水、甲醇、乙醇，微溶于丙酮、氯仿，不溶于乙醚和苯，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；它是一種人工合成的腎上腺素受體激動(dòng)劑，具有擴(kuò)張支氣管的作用，常用來(lái)防治哮喘、肺氣腫等肺部疾病。當(dāng)其應(yīng)用劑量達(dá)到治療量的5 10倍時(shí)，又具有能量重分配作用，可使肌肉合成增加，脂肪沉積減少，因此將其俗稱為“瘦肉精”，在養(yǎng)豬業(yè)中一些非法使用者將其作為一種生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加到飼料中，用以改善胴體的品質(zhì)，但同時(shí)也造成了豬肉中鹽酸克倫特羅的殘留。當(dāng)人們食用含有鹽酸克倫特羅殘留的肉品后，常常造成心動(dòng)過(guò)速，低血鉀，低磷酸鹽血癥，肌肉震顫，頭暈，口干，失眠甚至于癱瘓等中毒癥狀，對(duì)心臟病患者更有生命危險(xiǎn)。國(guó)家農(nóng)業(yè)部農(nóng)牧發(fā)[2002] 1號(hào)文 《關(guān)于發(fā)布食品動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單的通知》中，鹽酸克倫特羅被列為所有食品動(dòng)物禁止使用。
目前已有多種方法用于對(duì)CL的殘留分析，主要包括酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(ELISA)、化學(xué)發(fā)光法(CLIA)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC/MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC/MS)等。CLIA對(duì)單個(gè)樣本的檢測(cè)速度快，靈敏度和自動(dòng)化程度高，但試劑穩(wěn)定性差、價(jià)格高、需要多次定標(biāo)，不能重復(fù)檢測(cè)，易受環(huán)境干擾，檢測(cè)精度不高。ELISA最大優(yōu)勢(shì)在于避免了對(duì)環(huán)境的污染和人體的危害，但酶的純度和反應(yīng)過(guò)程易受環(huán)境因素的影響， 導(dǎo)致穩(wěn)定性不高。色譜技術(shù)對(duì)CL的檢測(cè)分離效率高、回收率高等自身優(yōu)勢(shì)，但操作繁瑣費(fèi)時(shí)，從樣品預(yù)處理到得出檢測(cè)結(jié)果至少需要2天時(shí)間，另外這種檢測(cè)方法還需要價(jià)格昂貴的儀器設(shè)備，且需專業(yè)人員操作，每次只能檢測(cè)一個(gè)樣品，嚴(yán)重阻礙了這種檢測(cè)方法的普及推廣，更無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。近年來(lái)，隨著膠體金免疫層析技術(shù)的發(fā)展，用膠體金競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析法檢測(cè)樣本中的鹽酸克倫特羅已成為現(xiàn)實(shí)，但是與乳膠法相比，膠體金法檢測(cè)成本高，同時(shí)在檢測(cè)臨界樣本時(shí)，膠體金法檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定。發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種膠體金融合乳膠法半定量檢測(cè)鹽酸克倫特羅的檢測(cè)試劑、試劑條和試劑盒及其制備方法，該檢測(cè)試劑克服了膠體金競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析法檢測(cè)臨界樣本顯色慢、顯色不均一的缺陷，同時(shí)采用該方法制備的試劑成本低、可多水平半定量檢測(cè)鹽酸克倫特羅的含量，且使用方便，操作簡(jiǎn)單。
本發(fā)明的技術(shù)方案為一種膠體金融合乳膠法半定量檢測(cè)鹽酸克倫特羅的檢測(cè)試劑，所述試劑的制備方法包括以下步驟(1)膠體金的制備制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 01%的氯金酸和0. 02%的檸檬酸三鈉的混合水溶液；(2)膠體金標(biāo)記物的制備和純化將上述步驟(1)中制備的膠體金IOOml調(diào)節(jié)pH值至8.0，加入抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體1. 5mg，再逐滴加入25mg/ml聚乙二醇^il，離心棄上清液，離心沉淀用含0. 4mg/mlPEG 的PBS緩沖液IOml清洗2次，再將清洗后得到的沉淀用含體積分?jǐn)?shù)為2% BSA的PBS緩沖液5ml溶解，然后將溶解液用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，得到膠體金-抗體結(jié)合物，4°C保存；(3)乳膠顆粒的標(biāo)記取乳膠顆粒用MES緩沖液透析鹽酸克倫特羅單克隆抗體；將鹽酸克倫特羅單克隆抗體和體積分?jǐn)?shù)為1%的Tween-20溶液加入到乳膠顆粒中，并補(bǔ)充MES緩沖液，使鹽酸克倫特羅單克隆抗體濃度大于5mg/ml，乳膠顆粒濃度為25mg/ml ；超聲混勻并室溫震蕩；加入體積分?jǐn)?shù)為1. 2%的60mg/ml的NHS溶液和體積分?jǐn)?shù)為1. 2%的100mg/ml的EDAC溶液，室溫震蕩； 加入體積分?jǐn)?shù)為20%的100mg/ml BSA溶液封閉，室溫震蕩；離心純化標(biāo)記后的乳膠顆粒，去上清，用體積分?jǐn)?shù)為20%的lOOmg/mL的BSA溶液懸浮沉淀，得到乳膠_抗體結(jié)合物，并稀釋到體積分?jǐn)?shù)為10%后，分裝；(4)膠體金和乳膠標(biāo)記物的固相化將上述步驟(2)中制備的膠體金-抗體結(jié)合物和步驟(3)中制備的乳膠-抗體結(jié)合物溶液，分別固相于玻璃纖維和聚酯膜上；(5)包被硝酸纖維素膜5. 1將CL-BSA偶聯(lián)物稀釋成三個(gè)不同濃度，例如為1. 0mg/mL、3. Omg/mL、10mg/mL,呈橫帶狀間隔噴于硝酸纖維素膜上；5. 2將羊抗鼠IgG單克隆抗體稀釋到0. 5mg/mL,噴于上述步驟5. 1制得的硝酸纖維素膜上；5. 3將上述步驟5. 2制得的固定有偶聯(lián)物和抗體的硝酸纖維素膜置37°C烘箱中干燥， 得到檢測(cè)試劑產(chǎn)品。
一種鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑條，所述試劑條包括上述方法制備的膠體金融合乳膠法半定量檢測(cè)鹽酸克倫特羅的硝酸纖維素膜檢測(cè)試劑；所述試劑條的制備方法，具體包括以下步驟(1)在支持板的中間位置粘貼上述檢測(cè)試劑的方法制備的膠體金融合乳膠法半定量檢測(cè)鹽酸克倫特羅的檢測(cè)試劑硝酸纖維素膜；(2)在支持板固定上述硝酸纖維素膜位置的上方，粘貼吸水墊，吸水墊覆蓋硝酸纖維素膜邊沿0. 5-1. 5毫米；(3)在支持板固定上述硝酸纖維素膜位置的下方粘貼上述檢測(cè)試劑的制備方法中步驟 (4)制備的標(biāo)有膠體金-抗體結(jié)合物的玻璃纖維樣品墊以及標(biāo)有乳膠-抗體結(jié)合物的聚酯膜；所述聚酯膜下方粘貼所述玻璃纖維樣品墊覆蓋聚酯膜0. 5-1. 5毫米；(4)將上述步驟(3)得到的產(chǎn)品壓平整后，切成條。
一種鹽酸克倫特羅的檢測(cè)試劑盒，包括檢測(cè)條和檢測(cè)卡，其中，所述檢測(cè)條為上述方法制備的鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑條，包括底板；5所述底板分為手柄區(qū)、觀察區(qū)、標(biāo)記區(qū)和加樣區(qū)； 所述手柄區(qū)的底板上設(shè)有用來(lái)吸水的濾紙支撐層；所述觀察區(qū)的底板上設(shè)有上述方法制備的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜靠近手柄區(qū)的一端設(shè)有包被羊抗鼠抗體的對(duì)照線，另一端設(shè)有包被CL-BSA偶聯(lián)物的3條檢測(cè)線； 所述標(biāo)記區(qū)的底板上標(biāo)記有CL單克隆抗體； 所述加樣區(qū)的底板上設(shè)有玻璃纖維樣品墊。
進(jìn)一步地，所述檢測(cè)卡包括卡蓋和盒狀卡體；所述卡蓋的一端設(shè)有用來(lái)滴加測(cè)試樣品的漏斗狀的加樣孔，所述狀加樣孔與所述底板的加樣區(qū)的位置相對(duì)應(yīng)；所述卡蓋的中間部位設(shè)有用來(lái)觀察測(cè)試結(jié)果的條形的觀測(cè)孔，所述觀測(cè)孔與所述底板的觀察區(qū)的位置相對(duì)應(yīng)；所述卡蓋的底面上設(shè)有若干個(gè)用來(lái)固定卡蓋和卡體的定位銷，所述卡體上設(shè)有與定位銷配合的定位槽；所述檢測(cè)條設(shè)置在卡蓋與卡體之間。
作為上述技術(shù)方案的再一種優(yōu)選方案，所述卡蓋的底部設(shè)有固定柱和塊狀凸起； 所述卡體上也設(shè)有塊狀凸起。
作為上述技術(shù)方案進(jìn)一步的優(yōu)選方案，所述卡體上設(shè)有用來(lái)固定檢測(cè)條水平位置的卡位突起。
作為上述技術(shù)方案的另一種優(yōu)選方案，所述卡蓋上對(duì)應(yīng)對(duì)照線的一側(cè)標(biāo)注有字母 “C”，對(duì)應(yīng)檢測(cè)線的一側(cè)標(biāo)注有字母“T”。
檢測(cè)樣的處理方法(1)尿液樣本用干燥、潔凈的離心管或容器采集尿液；如果不立即檢測(cè)，可將尿樣冷凍保存；短期可進(jìn)行冷藏保存，注意避免腐敗造成失效或污染；如果尿樣出現(xiàn)沉淀或渾濁物，要離心后再檢測(cè)。
(2)血清樣本抽取待檢動(dòng)物血液，離心或靜置，取透明的上清液血清層，若血清有過(guò)度溶血現(xiàn)象，將血清以蒸餾水稀釋一倍后再檢測(cè)；(3)飼料樣本樣品粉碎后過(guò)20目篩，得試樣。取2g試樣于50ml離心管中，加入IOmL 的水提取液，混勻，置于超聲波水浴中超聲30分鐘，其間每10分鐘取出混勻1次，然后取出恢復(fù)至室溫，4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，取上清液檢測(cè)；(4)肌肉或內(nèi)臟樣本樣品完全勻漿后，稱取4.Og置于離心管中，加入50mmol/L鹽酸溶液20mL，充分振蕩混勻5min或超聲混勻5min，再靜置10分鐘；或者加入鹽酸后直接搖床振搖30min ；稱取6. Og完全均質(zhì)的樣品，置于另一個(gè)離心管中，加入2mol/L的NaOH溶液 125 μ 1，混勻5min之后4000rpm或更高速離心20min，離心溫度保持在10°C左右，吸取上清直接用于檢測(cè)；檢測(cè)方法測(cè)試過(guò)程中向加樣孔中用吸管吸取待檢樣本，滴加3滴待檢樣本于加樣孔中，樣本沿樣品墊緩慢上移，在加樣后5-10分鐘判讀結(jié)果。
檢測(cè)結(jié)果判斷通過(guò)計(jì)算顯色條帶數(shù)量的多少，從而確定樣本中CL的含量，色帶數(shù)量越少，樣本中CL含量越高。
如果出現(xiàn)四條紅色條帶，不管色帶深淺如何，都表明結(jié)果為陰性；如果第一條帶不顯紅色，后三條顯紅色，結(jié)果為陽(yáng)性，含量Ing/mL;如果第一、二條帶不顯紅色，后兩條帶顯紅色含量為3. Ong/mL;如果第一、二、三條帶不顯紅色，僅第四條帶顯紅色含量彡 100ng/mL。
本發(fā)明檢測(cè)試劑采用納米級(jí)膠體金和乳膠顆粒作為標(biāo)記示蹤物，應(yīng)用CL-BSA偶聯(lián)物，結(jié)合單克隆抗體，依據(jù)免疫競(jìng)爭(zhēng)法原理，檢測(cè)樣本中的鹽酸克倫特羅抗體。
本發(fā)明采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析的原理，檢測(cè)CL抗體時(shí)，將CL單克隆抗體分別固相于聚酯膜的乳膠和玻璃纖維的膠體金上，再將不同濃度的CL-BSA (牛血清白蛋白)偶聯(lián)物噴于硝酸纖維素膜上，滴加樣本后，由于毛細(xì)管作用，如果樣本中存在CL，CL在流動(dòng)過(guò)程中與膠體金和乳膠標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制了抗體與固相載體膜上的CL-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合，通過(guò)計(jì)算顯色條帶數(shù)量的多少，從而確定樣本中CL的含量，色帶數(shù)量越少，樣本中CL 含量越高，使用方便，操作簡(jiǎn)單。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、成本低不需特殊儀器及其他試劑，使現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)一步到位，見(jiàn)效快；成本主要取決于原料，乳膠和所標(biāo)抗體用量?jī)H為膠體金和所標(biāo)抗體用量的一半，乳膠法原料成本僅為膠體金法的1/5 1/6，在達(dá)到同樣靈敏度、特異性和穩(wěn)定性的情況下，成本大大降低；2、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性強(qiáng)采用本發(fā)明所的技術(shù)方案，顯示條帶越少，濃度越高，實(shí)現(xiàn)了多水平半定量式檢測(cè)；在鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0. Ing/mL時(shí)，膠體金融合乳膠法的檢測(cè)結(jié)果有199例出現(xiàn)陽(yáng)性，膠體金法的檢測(cè)結(jié)果有197例出現(xiàn)陽(yáng)性，說(shuō)明兩種檢測(cè)方法的靈敏度均能達(dá)到0. Ing/mL，但是膠體金融合乳膠法的穩(wěn)定性要強(qiáng)于膠體金法；3、顯色更快、更均一、更穩(wěn)定采用了膠體金融合乳膠法生產(chǎn)檢測(cè)條，由于乳膠標(biāo)記除了被動(dòng)吸附，還可以用共價(jià)結(jié)合，因此在臨界樣本時(shí)，膠體金融合乳膠法顯色更快、更均一、 更穩(wěn)定；4、使用方便，操作簡(jiǎn)單減少了許多繁瑣的程序，方便、快捷、直觀，易操作，全過(guò)程只需 10分鐘，能夠滿足食品安全、飼料、屠宰企業(yè)及政府檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)需求，具有較高的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值；5、真正達(dá)到復(fù)雜原理與簡(jiǎn)易操作的有機(jī)統(tǒng)一，同時(shí)該試劑盒具有保存方便，有效期長(zhǎng)的特點(diǎn)。
膠體金法和乳膠法是免疫層析法中根據(jù)標(biāo)記物不同而出現(xiàn)的兩種檢測(cè)技術(shù)，它們?cè)诟?jìng)爭(zhēng)法中的特點(diǎn)對(duì)比如下表所示表1膠體金法、乳膠法及膠體金融合乳膠法檢測(cè)對(duì)比
權(quán)利要求
1.一種膠體金融合乳膠法半定量檢測(cè)鹽酸克倫特羅的檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)膠體金的制備制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 01%的氯金酸和0. 02%的檸檬酸三鈉的混合水溶液；(2)膠體金標(biāo)記物的制備和純化將上述步驟(1)中制備的膠體金IOOml調(diào)節(jié)pH值至8. 0，加入抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體1. 5mg,再逐滴加入25mg/ml聚乙二醇^il，離心棄上清液，離心沉淀用含0. 4mg/mlPEG 的PBS緩沖液IOml清洗2次，再將清洗后得到的沉淀用含體積分?jǐn)?shù)為2% BSA的PBS緩沖液5ml溶解，然后將溶解液用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，得到膠體金-抗體結(jié)合物，4°C保存；(3)乳膠顆粒的標(biāo)記取乳膠顆粒用MES緩沖液透析鹽酸克倫特羅單克隆抗體；將鹽酸克倫特羅單克隆抗體和Tween-20溶液加入到乳膠顆粒中，并補(bǔ)充MES緩沖液，使鹽酸克倫特羅單克隆抗體濃度大于5mg/ml，乳膠顆粒濃度為25mg/ml ；超聲混勻并室溫震蕩；加入體積分?jǐn)?shù)為1. 2%的 60mg/ml的NHS溶液和體積分?jǐn)?shù)為1. 2%的100mg/ml的EDAC溶液，室溫震蕩；加入體積分?jǐn)?shù)為20%的100mg/ml BSA溶液封閉，室溫震蕩；離心純化標(biāo)記后的乳膠顆粒，去上清，用BSA 溶液懸浮沉淀，得到乳膠-抗體結(jié)合物，并稀釋到體積分?jǐn)?shù)為10%后，分裝；(4)膠體金和乳膠標(biāo)記物的固相化將上述步驟(2)中制備的膠體金-抗體結(jié)合物和步驟(3)中制備的乳膠-抗體結(jié)合物溶液，分別固相于玻璃纖維和聚酯膜上；(5)包被硝酸纖維素膜5. 1將CL-BSA偶聯(lián)物稀釋成三個(gè)不同濃度，呈橫帶狀間隔噴于硝酸纖維素膜上；5. 2將羊抗鼠IgG單克隆抗體稀釋到0. 5mg/mL,噴于上述步驟5. 1制得的硝酸纖維素膜上；5. 3將上述步驟5. 2制得的固定有偶聯(lián)物和抗體的硝酸纖維素膜置37°C烘箱中干燥， 得到檢測(cè)試劑產(chǎn)品。
2.一種鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑條的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)在支持板的中間位置粘貼上述權(quán)利要求1所述的方法制備得到的鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑硝酸纖維素膜；(2)在支持板固定上述步驟(1)所述硝酸纖維素膜位置的上方，粘貼吸水墊，吸水墊覆蓋硝酸纖維素膜邊沿0. 5-1. 5毫米；(3)在支持板固定上述步驟(2)所述硝酸纖維素膜位置的下方粘貼上述權(quán)利要求1所述方法步驟(4)制備的標(biāo)有膠體金-抗體結(jié)合物的玻璃纖維樣品墊以及標(biāo)有乳膠-抗體結(jié)合物的聚酯膜；所述聚酯膜下方粘貼所述玻璃纖維樣品墊覆蓋聚酯膜0. 5-1. 5毫米；(4)將上述步驟(3)得到的產(chǎn)品壓平整后，切成條。
3.—種鹽酸克倫特羅的檢測(cè)試劑盒，包括檢測(cè)條和檢測(cè)卡，其特征在于所述檢測(cè)條為上述權(quán)利要求2所述的方法制備的鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑條，所述檢測(cè)條包括底板；所述底板分為手柄區(qū)、觀察區(qū)、標(biāo)記區(qū)和加樣區(qū)；所述手柄區(qū)的底板上設(shè)有用來(lái)吸水的濾紙支撐層；所述觀察區(qū)的底板上設(shè)有上述權(quán)利要求1所述的方法制備得到的鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜靠近手柄區(qū)的一端設(shè)有包被羊抗鼠抗體的對(duì)照線， 另一端設(shè)有包被CL-BSA偶聯(lián)物的3條檢測(cè)線；所述標(biāo)記區(qū)的底板上標(biāo)記有CL單克隆抗體；所述加樣區(qū)的底板上設(shè)有玻璃纖維樣品墊。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鹽酸克倫特羅的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)卡包括卡蓋和盒狀卡體；所述卡蓋的一端設(shè)有用來(lái)滴加測(cè)試樣品的漏斗狀的加樣孔，所述狀加樣孔與所述底板的加樣區(qū)的位置相對(duì)應(yīng)；所述卡蓋的中間部位設(shè)有用來(lái)觀察測(cè)試結(jié)果的條形的觀測(cè)孔，所述觀測(cè)孔與所述底板的觀察區(qū)的位置相對(duì)應(yīng)；所述卡蓋的底面上設(shè)有若干個(gè)用來(lái)固定卡蓋和卡體的定位銷，所述卡體上設(shè)有與定位銷配合的定位槽；所述檢測(cè)條設(shè)置在卡蓋與卡體之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鹽酸克倫特羅的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述卡蓋的底部設(shè)有固定柱和塊狀凸起；所述卡體上也設(shè)有塊狀凸起。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鹽酸克倫特羅的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述卡體上設(shè)有用來(lái)固定檢測(cè)條水平位置的卡位突起。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種膠體金融合乳膠法半定量檢測(cè)鹽酸克倫特羅的檢測(cè)試劑、試劑條和試劑盒及其制備方法，包括膠體金的制備、膠體金標(biāo)記物的制備和純化、乳膠顆粒的標(biāo)記、膠體金和乳膠標(biāo)記物的固相化、包被硝酸纖維素膜、試劑條的制備以及檢測(cè)試劑盒的制備；本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于成本低，準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性強(qiáng)，顯色更快、更均一、更穩(wěn)定，使用方便，操作簡(jiǎn)單，真正達(dá)到復(fù)雜原理與簡(jiǎn)易操作的有機(jī)統(tǒng)一，同時(shí)該試劑盒具有保存方便，有效期長(zhǎng)的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102520180SQ20111041454
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者付偉光, 單永德, 楊致亭, 王增祺, 王好玉 申請(qǐng)人:青島漢唐生物科技有限公司