專利名稱：融合蛋白及其用途、其抗瘧疾疫苗和抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，涉及一種融合蛋白及其在制備用于預(yù)防和/或治療痕疾的藥物中的用途、含有該融合蛋白的抗痕疾疫苗、以及抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清。
背景技術(shù)：
由蚊媒傳播的瘧疾是危及人類生命的最古老的疾病，已有數(shù)千年歷史，但時(shí)至今日仍舊被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為全球最嚴(yán)重的三大傳染病之一。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)估計(jì)，全球約40%的世界人口，處于罹患瘧疾的危險(xiǎn)之中，而每年有5億人受到瘧原蟲感染，約100萬(wàn)人死于惡性瘧疾，其中大部分是五歲以下的兒童和孕婦。瘧疾不僅對(duì)發(fā)展中國(guó)家人民生命健康造成嚴(yán)重危害，而且還嚴(yán)重阻礙了這些國(guó)家的社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。近幾年來(lái)由于抗藥性瘧原蟲蟲株及抗殺蟲劑蚊媒的產(chǎn)生及蔓延，傳統(tǒng)防治瘧疾的方法受到新的挑戰(zhàn)，因此研制一種有效的瘧疾疫苗是瘧疾防治的重要替代途徑，也是實(shí)現(xiàn)WHO提出的2010年瘧疾發(fā)病率和死亡率下降50%的目標(biāo)的主要手段。生活在頻繁傳播疫區(qū)的居民天然條件下能獲得臨床免疫力，這種免疫力不僅能抵抗臨床癥狀而且能對(duì)抗重癥瘧疾，另外也可能轉(zhuǎn)為帶蟲免疫狀態(tài)；用減毒子孢子或一些重組蛋白質(zhì)疫苗(如紅細(xì)胞前期(紅前期)的RTS，S)免疫哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類以及人類，也能誘導(dǎo)部分或全部抗蟲免疫；這些觀察都為惡性瘧疾疫苗研發(fā)的可行性提供了有利的證據(jù)。

但是瘧原蟲的生活周期復(fù)雜，包括蚊體內(nèi)繁殖期、紅細(xì)胞前期、紅細(xì)胞內(nèi)期，各期均可表達(dá)大量不同抗原。因此，盡管目前已鑒定出約50個(gè)分別針對(duì)瘧原蟲不同的生活時(shí)期的抗原，有些作為疫苗已經(jīng)進(jìn)入不同階段的臨床試驗(yàn)，但迄今為止還未有可用的瘧疾疫苗。其原因包括:人們對(duì)瘧疾免疫保護(hù)的機(jī)制研究不夠深入，無(wú)法為疫苗的研制提供充分理論依據(jù)；仍缺乏具有顯著保護(hù)作用的候選抗原；缺乏有效的動(dòng)物模型；瘧原蟲抗原本身存在多態(tài)性、多變性和蟲株特異性等特點(diǎn)，使得現(xiàn)有候選疫苗保護(hù)人群的范圍可能非常有限等。再加上瘧疾疫苗的研制投入大(每個(gè)候選疫苗平均投入5億美元)，周期長(zhǎng)(10-12年)等因素，都可能延緩有效疫苗的出現(xiàn)。瘧疾疫苗的研制按照保護(hù)人群的不同可分為不同類型:保護(hù)非疫區(qū)健康人不受感染的紅細(xì)胞前期疫苗；保護(hù)疫區(qū)人群尤其是兒童抵抗感染、降低病死率的紅內(nèi)期疫苗；以及蚊媒傳播阻斷型疫苗。紅細(xì)胞內(nèi)期是惡性瘧原蟲致病和發(fā)病的唯一階段，因此研制紅內(nèi)期疫苗就對(duì)降低病死率，減少并發(fā)癥具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。但到目前為止，所有單期單價(jià)疫苗的免疫效果都不理想。目前所公知的是，針對(duì)瘧原蟲具有抗原階段性、高變異性、差異性和多態(tài)性的特點(diǎn)，選取針對(duì)惡性瘧疾不同生活時(shí)期、誘導(dǎo)產(chǎn)生多種免疫反應(yīng)類型的不同抗原或表位，構(gòu)建亞單位疫苗或多表位疫苗，是解決上述技術(shù)問(wèn)題的一種有效手段，這也已經(jīng)成為瘧疾疫苗研究的熱點(diǎn)。對(duì)于紅內(nèi)期多表位疫苗的研制而言，最為理想的紅內(nèi)期瘧疾疫苗應(yīng)該能夠模擬疫區(qū)人群所形成的天然免疫。通過(guò)選用來(lái)自多抗原的多個(gè)表位所產(chǎn)生的協(xié)同作用，激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)瘧原蟲的免疫力，經(jīng)降低蟲載量達(dá)到降低病死率的效果。而在實(shí)際研究中，多個(gè)表位相互連接的組合順序存在巨大的多樣性，通過(guò)手工操作的辦法難以獲得具有最佳連接順序的人工多表位抗原。在中國(guó)專利申請(qǐng)N0.200410080982.6中，公開了一種人工隨機(jī)組合抗原——多表位人工抗原ES312 (本文中以M.RCAg-l/Exp.V-3表示)，其具有323個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為約65kDa。其針對(duì)參與抗瘧原蟲紅內(nèi)期感染的免疫類型，借鑒分子育種技術(shù)的隨機(jī)重組原理，利用表位改組技術(shù)構(gòu)建了多表位基因庫(kù)，并用庫(kù)免疫血清篩選出免疫原性最佳、穩(wěn)定性最好的人工隨機(jī)組合抗原一M.RCAg-1。初步研究證實(shí)，免疫近交系小鼠、新西蘭白兔和恒河猴后可誘導(dǎo)產(chǎn)生很高的抗體水平，并誘發(fā)顯著的⑶4+T細(xì)胞反應(yīng)。在這個(gè)隨機(jī)組合抗原中所包含的所有表位都能誘導(dǎo)產(chǎn)生很強(qiáng)的特異性抗體反應(yīng)。在對(duì)來(lái)自中國(guó)海南、巴西和喀麥隆的惡性瘧患者血清進(jìn)行的檢測(cè)中，血清抗體識(shí)別重組蛋白M.RCAg-1的陽(yáng)性率與正常組有極顯著性差異(P <0.001)，且血清抗體滴度與被檢測(cè)者的年齡呈正相關(guān)。綜上所述，M.RCAg-1蛋白質(zhì)疫苗是一個(gè)極具潛力的候選疫苗，具有較好的開發(fā)前景。因此，對(duì)M.RCAg-1抗原進(jìn)行進(jìn)一步地優(yōu)化重建，以提高蛋白的穩(wěn)定性和針對(duì)惡性瘧原蟲的活性，則顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種其抑制瘧原蟲的活性得到顯著提高的融合蛋白。具體而言，本發(fā)明提供:(I) 一種融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列從N端到C端依次含有SEQ IDN0.:7所示的氨基酸序列和SEQ ID N0.:5所示的氨基酸序列。

(2)根據(jù)(I)所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0.:I所示的氨基酸序列。(3) 一種用于編碼根據(jù)⑴或(2)所述的融合蛋白的DNA。(4)根據(jù)(3)所述的DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列為SEQ ID N0.:2所示的核苷酸序列。(5)根據(jù)(I)或(2)所述的融合蛋白在制備用于預(yù)防和/或治療瘧疾的藥物中的用途。(6)根據(jù)(5)所述的用途，其中，所述的藥物為抗瘧疾疫苗。(7)根據(jù)(6)所述的用途，其中，所述的抗瘧疾疫苗為抗紅內(nèi)期瘧疾疫苗。(8) 一種抗瘧疾疫苗，該抗瘧疾疫苗含有⑴或⑵所述的融合蛋白。(9)根據(jù)(8)所述的抗瘧疾疫苗，其中，所述抗瘧疾疫苗還含有佐劑，所述佐劑為選自油包水型佐劑MontnidelSA720、MontnidelSA51、弗氏佐劑或氫氧化鋁佐劑中的一種或幾種。(10)根據(jù)⑶所述的抗瘧疾疫苗，其中，所述融合蛋白的含量為10 100μ g/ml。(11)根據(jù)(9)所述的抗瘧疾疫苗，其中，所述佐劑的含量為10 100 μ g/ml。(12)根據(jù)⑶所述的抗瘧疾疫苗，其中，所述的抗瘧疾疫苗為抗紅內(nèi)期瘧疾疫苗。
(13) 一種抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清,所述的抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清是以根據(jù)(I)或(2)所述的融合蛋白或根據(jù)(8)-(12)中任一項(xiàng)所述的疫苗為免疫原而制備得到的。(14)根據(jù)(13)所述的抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清在制備用于預(yù)防和/或治療瘧疾的免疫制劑中的用途。本發(fā)明的融合蛋白及疫苗與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果:本發(fā)明的融合蛋白(如重組蛋白M.RCAg-l/Exp.V_l)具有較強(qiáng)的免疫原性，理化性質(zhì)穩(wěn)定，能激發(fā)可持續(xù)、高滴度特異性抗體，小鼠免疫血清能識(shí)別惡性瘧原蟲天然抗原，能誘發(fā)顯著的T細(xì)胞應(yīng)答，并能較好抑制瘧原蟲體外生長(zhǎng)，是極具潛力的候選疫苗，具有較好的開發(fā)前景。本發(fā)明的融合蛋白(如重組蛋白M.RCAg-l/Exp.V-1)與M.RCAg-l/Exp.V_2、M.RCAg-l/Exp.V-3兩種多表位蛋白在動(dòng)物模型體內(nèi)的免疫原性相似(p > 0.05)，但蛋白免疫小鼠后卻誘導(dǎo)了不同類型的T細(xì)胞反應(yīng)。此外，上述三種蛋白的免疫血清IgG體外生長(zhǎng)抑制率分別為93.9%，14.7%，54.3%，從上述結(jié)果可以看出，相對(duì)于M.RCAg-l/Exp.V_3，M.RCAg-l/Exp.V-1的體外抑蟲活性得以大幅提高，即評(píng)價(jià)惡性瘧疾紅細(xì)胞內(nèi)期疫苗有效性的標(biāo)準(zhǔn)-免疫兔血清抗體對(duì)體外培養(yǎng)的惡性瘧原蟲的生長(zhǎng)抑制 (GIA)率，在目前沒有疫苗體內(nèi)評(píng)價(jià)模型的情況下，體外保護(hù)力實(shí)驗(yàn)就具有更為重要的意義。而利用生物信息學(xué)和色譜技術(shù)分析，可以發(fā)現(xiàn)從不同表達(dá)載體制備的重組蛋白在二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)極大差異。


圖1 為 M.RCAg-l/Exp.V_l、M.RCAg-l/Exp.V-2 和 M.RCAg-l/Exp.V-3 三種多表位蛋白的氨基酸序列比較示意圖；圖 2 為 M.RCAg-l/Exp.V_l、M.RCAg-l/Exp.V-2 和 M.RCAg-l/Exp.V-3 三種多表位蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中M代表低分子量蛋白Marker ;1、2、3分別代表Μ.RCAg-1/Exp.V-U Μ.RCAg-l/Exp.V-2 和 M.RCAg-l/Exp.V-3 ；圖3為圓二色譜法檢測(cè)三種蛋白的光譜圖；圖 4 為 M.RCAg-1/Exp.V-1 (圖 4A)、M.RCAg-l/Exp.V-2 (圖4B)和M.RCAg-l/Exp.V-3 (圖4C)三種多表位蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型圖；圖 5 為 M.RCAg-l/Exp.V_l、M.RCAg-l/Exp.V-2 和 M.RCAg-l/Exp.V-3 三種多表位蛋白的兔免疫血清對(duì)天然瘧原蟲蛋白的識(shí)別結(jié)果圖；其中，左上為陰性對(duì)照；右下、左下、右上分別代表 M.RCAg-l/Exp.V-1、M.RCAg-l/Exp.V-2 和 M.RCAg-l/Exp.V-3 ；圖6為ELISP0T檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞中IFN- Y和IL_4分泌細(xì)胞克隆數(shù)的圖；圖7為pDS-ex載體質(zhì)粒的示意圖。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施方式
的描述并參照附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
雖然目前對(duì)于某些傳染性疾病多表位疫苗的研發(fā)已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但影響多表位蛋白免疫效能的因素較多，如不同表位的個(gè)體特性，多表位間的排列方式或連接方式，乃至于表位間的側(cè)翼序列等因素，而也包括穩(wěn)定多表位蛋白結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)及構(gòu)建時(shí)載體的選擇等因素，這些都屬于多表位蛋白肽鏈內(nèi)因素，也即如何連接表位才能盡可能誘導(dǎo)出所連接表位最優(yōu)的免疫反應(yīng)，但多表位蛋白構(gòu)建時(shí)肽鏈外因素對(duì)多表位蛋白有效性的影響卻鮮有報(bào)道，其中多表位蛋白的融合表達(dá)對(duì)其免疫有效性的影響更是尚不明確。從理論上看，通過(guò)選擇重要抗原的具有保護(hù)性和保守性的表位進(jìn)行組合，有可能獲得針對(duì)具有復(fù)雜抗原性病原體的高覆蓋率。但在重組抗原分子中不同表位結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白免疫原性的影響是不同的，各表位間的相對(duì)位置，構(gòu)象特征(可及性、柔性、二級(jí)結(jié)構(gòu)等)及表位側(cè)翼順序等都與表位的功能都密切相關(guān)，而理想的疫苗分子應(yīng)該包括一組合理組合與搭配的表位。本發(fā)明人通過(guò)表位改組的隨機(jī)重組和菌落表達(dá)的免疫化學(xué)篩選方法，成功地獲得了具有較高免疫原性和免疫反應(yīng)多樣性的多表位疫苗，已初步證實(shí)其中所有單個(gè)表位都能被遞呈，多表位蛋白能夠 在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)出較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。本發(fā)明是在對(duì)多表位疫苗蛋白M.RCAg-1高效表達(dá)載體的改造實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)的。本發(fā)明人對(duì)M.RCAg-1重組蛋白進(jìn)行優(yōu)化重建，以獲得高表達(dá)量的工程菌，并分析了不同的載體肽融合表達(dá)對(duì)多表位蛋白M.RCAg-1結(jié)構(gòu)及免疫活性的影響，在研究中發(fā)現(xiàn)了部分載體系統(tǒng)對(duì)重組蛋白免疫有效性的影響，而且肽段可增強(qiáng)多表位疫苗M.RCAg-1的體外抑蟲活性，體外免疫保護(hù)性有顯著差異，與直接表達(dá)為不帶載體融合肽的M.RCAg-1/Exp.V-3重組蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體的50%左右的抑蟲率相比，帶有腸激酶(Enterokinase)酶切識(shí)別位點(diǎn)N端融合肽的M.RCAg-l/Exp.V-1蛋白能夠幾乎完全抑制瘧原蟲的生長(zhǎng)，而帶有前切割蛋白酶(PreScission protease)酶切識(shí)別位點(diǎn)的N端融合肽M.RCAg-l/Exp.V-2蛋白，其特異性抗體對(duì)瘧原蟲生長(zhǎng)的抑制率卻降低到15%左右。本發(fā)明為成功構(gòu)建新一代多表位瘧疾疫苗提供了有力的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種融合蛋白，其中，所述融合蛋白的氨基酸序列從N端到C端依次含有SEQ ID N0.:7所示的氨基酸序列(其DNA序列如SEQ ID N0.:8所示)和SEQ ID N0.:5所示的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0.:I所示的氨基酸序列。所述融合蛋白具有366個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為約70kDa。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種分離的用于編碼所述的融合蛋白的DNA。優(yōu)選地，所述DNA的核苷酸序列為SEQ ID N0.:2所示的核苷酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了所述的融合蛋白在制備用于預(yù)防和/或治療瘧疾的藥物中的用途。優(yōu)選地，所述的藥物為疫苗。更優(yōu)選的是，所述疫苗為紅內(nèi)期瘧疾疫苗。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種抗瘧疾疫苗，所述疫苗包含所述的融合蛋白。本發(fā)明的疫苗可含有佐劑，也可以不含有佐劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要確定所述融合蛋白在本發(fā)明的疫苗中的含量。優(yōu)選地，所述融合蛋白的含量為10 100 μ g/ml。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗中含有佐劑。佐劑可以為本領(lǐng)域公知的常用的佐劑，例如:油包水型佐劑MontnidelSA720、MontnidelSA51、弗氏佐劑或氫氧化鋁佐劑中的一種或幾種。更優(yōu)選地，所述佐劑為MontnidelSA51。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要確定佐劑在本發(fā)明的疫苗中的含量。優(yōu)選地，所述佐劑的含量為10 100 μ g/ml。 優(yōu)選地，每劑疫苗為0.1 Iml ;更優(yōu)選地，每劑疫苗為0.2 0.4ml。 本發(fā)明的疫苗可以通過(guò)肌肉注射、皮下注射或腹腔注射的方式來(lái)施用。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清，所述的抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清是以所述的融合蛋白或所述的疫苗為免疫原而制備得到的?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域常用的方法，來(lái)制備抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清。單克隆抗體是由淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對(duì)復(fù)合抗原分子上某一單個(gè)抗原決定簇的特異性抗體。淋巴細(xì)胞雜交瘤是用人工方法使骨髓瘤細(xì)胞(純系小鼠的腹水瘤型漿細(xì)胞)與已用抗原致敏并能分泌某種抗體的淋巴細(xì)胞(常用致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞，起作用的是其中的B細(xì)胞)融合而成的。用來(lái)使上述淋巴細(xì)胞致敏的抗原有人和動(dòng)物的T細(xì)胞、B細(xì)胞、紅細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、各種微生物或其他抗原物質(zhì)等。用適當(dāng)方法把雜交瘤細(xì)胞分離出來(lái)，進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，使之大量繁殖，則在該培養(yǎng)液中增殖而形成的細(xì)胞克隆，只產(chǎn)生完全均一的、單一特異性的抗體，即單克隆抗體。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了所述的抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清在制備用于預(yù)防和/或治療瘧疾的免疫制劑中的用途。本發(fā)明中的免疫制劑為人工主動(dòng)或被動(dòng)免疫制劑，人工主動(dòng)免疫制劑是指用于預(yù)防接種的生物制品，接種后可使機(jī)體獲得免疫力，可能為亞單位疫苗，基因工程疫苗以及DNA疫苗，人工被動(dòng)免疫制劑是含有特異性抗體的免疫制劑，接種于人體后，可立即獲得免疫力。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，將M.RCAg-1基因克隆到含有不同載體標(biāo)簽或不含有載體標(biāo)簽的原核表達(dá)載體PDS-ex上，表達(dá)純化得到M.RCAg-l/Exp.V_1、M.RCAg-1/Exp.V-2、M.RCAg-l/Exp.V-3三種多表位蛋白，其氨基酸序列分別如SEQ ID N0.:USEQ ID N0.:3 以及 SEQ ID N0.:5 所示；其 DNA 序列分別為 SEQ ID N0.:2、SEQ ID N0.:4 以及 SEQ IDN0.:6所示。圖1 顯示了 M.RCAg-l/Exp.V-1, M.RCAg-l/Exp.V-2 和 M.RCAg-l/Exp.V-3 三種多表位蛋白的氨基酸序列比較示意圖，其中M.RCAg-l/Exp.V-1是在N端融合有帶有腸激酶酶切識(shí)別位點(diǎn)的43個(gè)載體氨基酸的多表位蛋白，M.RCAg-l/Exp.V-2是在N端融合有帶有前切割蛋白酶(PreScission Protease)酶切識(shí)別位點(diǎn)的43個(gè)載體氨基酸的多表位蛋白，M.RCAg-l/Exp.V-3是沒有融合載體氨基酸的多表位蛋白。從圖中可看出M.RCAg-1/Exp.V-1與M.RCAg-l/Exp.V-2這兩種蛋白總的氨基酸數(shù)目相同，但M.RCAg-1蛋白基因序列N端融合有43個(gè)氨基酸的載體肽段中具有不同的蛋白酶酶切識(shí)別位點(diǎn)，所以兩者有8個(gè)氨基酸種類的差別，而M.RCAg-l/Exp.V-3蛋白不帶有任何融合肽段，與前二者有43個(gè)氨基酸數(shù)量的差別。當(dāng)同一基因序列與不同的肽段融合表達(dá)后，其制備的重組蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫原性并無(wú)顯著差異(P > 0.05)，但體外免疫保護(hù)性卻有顯著差異。M.RCAg-l/Exp.V-1與M.RCAg-l/Exp.V-2這兩種蛋白總的氨基酸數(shù)目相同，因?yàn)槟康男蛄兄熬哂胁煌牡鞍酌该盖形稽c(diǎn)，所以兩者有8個(gè)氨基酸種類的差別，通過(guò)兩者二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的比較，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)二者的二級(jí)結(jié)構(gòu)差別迥異，而且蛋白免疫小鼠后誘導(dǎo)了不同類型的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，M.RCAg-l/Exp.V-2誘導(dǎo)出以IL-4為主的Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)，但M.RCAg-l/Exp.V-1卻是誘發(fā)了以IFN- Y為主的Thl型細(xì)胞 免疫反應(yīng)。研究表明Thl型CD4+T細(xì)胞免疫在抵抗瘧疾時(shí)具有重要的免疫保護(hù)作用，M.RCAg-l/Exp.V-1蛋白免疫機(jī)體后產(chǎn)生以Thl為主的細(xì)胞反應(yīng)類型，輔以適中的Th2反應(yīng)類型，這種細(xì)胞免疫反應(yīng)模式有利于抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲的攻擊，蛋白免疫機(jī)體后產(chǎn)生以Th2為主的細(xì)胞反應(yīng)類型，這種細(xì)胞反應(yīng)將更有利于抗體水平的提高，但降低的IFN-Y水平卻直接導(dǎo)致了蛋白免疫血清抑蟲效果的下降，這一點(diǎn)在體外GIA試驗(yàn)中得以證實(shí)。這表明，多表位蛋白分子的構(gòu)象會(huì)受到某些特定氨基酸序列的影響，也即某些特定氨基酸影響了整個(gè)肽鏈的折疊。從以上結(jié)果可知，目的序列克隆入pDS-ex表達(dá)載體后，43個(gè)氨基酸的載體序列在多表位蛋白表達(dá)時(shí)，影響了蛋白分子的折疊，這一結(jié)果提示:M.RCAg-1構(gòu)建在不同的表達(dá)載體后，由于載體肽段或其中某些特殊氨基酸的影響，表達(dá)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響了其折疊和構(gòu)象，進(jìn)而影響了蛋白的免疫效能，而這種影響有可能是正面的也可能是負(fù)面的。有研究表明具有相似的長(zhǎng)度和氨基酸的序列在改變部分氨基酸后可折疊為不同的蛋白結(jié)構(gòu)，而這一現(xiàn)象在其它蛋白的研究中也被多次證實(shí)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)顯示出，多表位蛋白的免疫原性與免疫保護(hù)性不僅與多表位間的組合排列方式有關(guān)，且受組裝后肽鏈外融合肽段的影響，可能增強(qiáng)或抑制多表位蛋白的生物活性，構(gòu)建多表位蛋白時(shí)，應(yīng)該充分地考慮到影響蛋白折疊的因素，才能達(dá)到預(yù)期的目的。以下通過(guò)例子的方式進(jìn)一步解釋或說(shuō)明本發(fā)明內(nèi)容，但這些例子不應(yīng)被理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。以下實(shí)施例及試驗(yàn)例中所用的EcoR 1、Bgl I1、Nde 1、堿性磷酸酶、T4DNA連接酶可購(gòu)自TAKARA公司；大腸桿菌BL21(DE3)可購(gòu)自N0VEGEN公司；油包水型佐劑MontnidelSA720、MontnidelSA51可購(gòu)自法國(guó)SEPPIC公司；弗氏佐劑可購(gòu)自sigma公司；BAL B/c小鼠、新西蘭大白兔可購(gòu)自北京天壇生物股份有限公司；羊血清、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體可購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；惡性瘧原蟲3D7株可購(gòu)自美國(guó)TheMalaria Research and Reference Reagent Resource Center ;FITC 標(biāo)記的羊抗兔 IgG 可購(gòu)自BD公司；EZ-S印TM Mouse IX淋巴細(xì)胞分離液、RPM1-1640培養(yǎng)基、IFN-Y ELISP0T和IL-4 ELISP0T培養(yǎng)板可購(gòu)自廣州達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；PHA刺激劑可購(gòu)自廣州達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；小量質(zhì) 粒抽提試劑盒可購(gòu)自QIAGEN公司；E.coli BL21(DE3)可購(gòu)自MERK公司；IPTG可購(gòu)自invitorgen公司；正常人血細(xì)胞可購(gòu)自北京紅十字血液中心；DNA片段回收試劑盒可購(gòu)自QIAGEN公司。SOC培養(yǎng)基可購(gòu)自Amresco公司；RP_C培養(yǎng)液可購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司；Giemsa染液可購(gòu)自德國(guó)AppliChem公司。以下實(shí)施例及試驗(yàn)例中所用的BCA法測(cè)定多表位蛋白的濃度，使用的是TheThermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Reagent試劑盒,購(gòu)自 Thermo ScientificPierce 公司。實(shí)施例1構(gòu)建VR1012-312質(zhì)粒和pDS-ex質(zhì)粒按照中國(guó)專利申請(qǐng)N0.200410080982.6中公開的方法，構(gòu)建VR1012-312質(zhì)粒和pDS-ex質(zhì)粒。具體如下:按照中國(guó)專利申請(qǐng)N0.200410080982.6中公開的方法獲得基因片段m.rcag-Ι (即中國(guó)專利申請(qǐng)N0.200410080982.6中公開的ES312基因片段)，并將所得的基因片段m.rcag-Ι連接在pDS-ex質(zhì)粒上(按照中國(guó)專利申請(qǐng)N0.200410080982.6中公開的方法，將原核表達(dá)載體pET-30a(+)(得自Novagen公司)利用PCR技術(shù)將Not I和Eag I酶切位點(diǎn)替換為Bgl II，前移Kpn I，并去除EcoRV、Bgl I1、Nsp V酶切位點(diǎn)，從而得到pDS-ex質(zhì)粒)，其DNA序列如SEQ ID N0.: 10所示，其物理圖譜為圖7所示。實(shí)施例2 獲得 M.RCAg-l/Exp.V-1 蛋白1.將實(shí)施例1得到的VR1012-312質(zhì)粒和pDS-ex質(zhì)粒分別進(jìn)行EcoR I和BglII雙酶切，從而使m.rcag-Ι連接入pDS_ex載體,從而構(gòu)建得到重組質(zhì)粒M.RCAg-1/pDS-ex。具體步驟如下所示:1)VR1012-312質(zhì)粒和pDS-ex質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶酶切體系(以EcoR I和Bgl II為例)如下所示:

權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，所述融合蛋白的氣基酸序列從N端到C端依次含有SEQ ID N0.:7所示的氨基酸序列和SEQ ID N0.:5所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的氨基酸序列為SEQID N0.:I所示的氨基酸序列。
3.一種用于編碼根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白的DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列為SEQID N0.:2所示的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白在制備用于預(yù)防和/或治療瘧疾的藥物中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中，所述的藥物為抗瘧疾疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中，所述的抗瘧疾疫苗為抗紅內(nèi)期瘧疾疫苗。
8.一種抗瘧疾疫苗，該抗瘧疾疫苗含有權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗瘧疾疫苗，其中，所述抗瘧疾疫苗還含有佐劑，所述佐劑為選自油包水型佐劑MontnidelSA720、MontnidelSA51、弗氏佐劑或氫氧化鋁佐劑中的一種或幾種。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗瘧疾疫苗，其中，所述融合蛋白的含量為10 IOOyg/ml ο
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗瘧疾疫苗，其中，所述佐劑的含量為10 lOOyg/ml。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗瘧疾疫苗，其中，所述的抗瘧疾疫苗為抗紅內(nèi)期瘧疾疫苗。
13.一種抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清,所述的抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清是以根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的融合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求8-12中任一項(xiàng)所述的疫苗為免疫原而制備得到的。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗體或雜交瘤細(xì)胞或抗血清在制備用于預(yù)防和/或治療瘧疾的免疫制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種融合蛋白的用途、其抗瘧疾疫苗和抗體。本發(fā)明的融合蛋白的氨基酸序列從N端到C端依次含有SEQ ID No.7所示的氨基酸序列和SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。本發(fā)明的融合蛋白及疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果重組蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，理化性質(zhì)穩(wěn)定，能激發(fā)可持續(xù)、高滴度特異性抗體，小鼠免疫血清能識(shí)別惡性瘧原蟲天然抗原，能誘發(fā)顯著的T細(xì)胞應(yīng)答，并能較好抑制惡性瘧原蟲體外生長(zhǎng)，是極具潛力的候選疫苗，具有較好的開發(fā)前景。
文檔編號(hào)C12N15/62GK103159855SQ20111041544
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者王健, 張振龍 申請(qǐng)人:北京生物制品研究所有限責(zé)任公司