專利名稱：適合于電場(chǎng)條件下的石油烴降解菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種適合于電場(chǎng)條件下的石油烴降解菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著人類對(duì)石油的需求增大，石油泄漏的途徑與機(jī)會(huì)增多，石油已經(jīng)成為土壤中的大宗污染物之一。石油成分復(fù)雜，含有飽和烴、芳香烴等有機(jī)物，這些物質(zhì)進(jìn)入土壤后，先吸附在土壤大孔隙以及各種有機(jī)顆粒和無(wú)機(jī)顆粒的表面，然后逐漸擴(kuò)散進(jìn)入土壤微孔中，或者分配進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)內(nèi)，也有少部分以純固體或非水相物質(zhì)存在。當(dāng)石油滲入量超過(guò)土壤的自凈容量后，積累的油類物質(zhì)將長(zhǎng)期殘留，破壞土壤結(jié)構(gòu)，對(duì)土壤植物和土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)甚至地下水都產(chǎn)生嚴(yán)重影響，對(duì)人類造成危害。石油污染土壤修復(fù)已經(jīng)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視，目前生物修復(fù)方法因其治理成本低廉和環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。該技術(shù)是借助于大量微生物利用石油烴作為碳源和能源而生長(zhǎng)，通過(guò)新陳代謝作用將石油污染物降解成二氧化碳和水等無(wú)害物質(zhì)。自然界中廣泛存在能降解石油烴的微生物，據(jù)報(bào)道有200多種，分別屬于細(xì)菌、酵母菌和霉菌等不同類別。但是生物修復(fù)受污染物的組成、土壤性質(zhì)和外界環(huán)境等一系列因素影響，在實(shí)際應(yīng)用中常常導(dǎo)致生物降解效率降低，限制了生物降解的作用。因此，如何強(qiáng)化微生物的環(huán)境條件，加快微生物對(duì)石油污染物的降解效率成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。電動(dòng)-微生物修復(fù)技術(shù)是近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種環(huán)境友好的有機(jī)污染土壤修復(fù)方法，目前已經(jīng)成功的應(yīng)用于石油烴、PAHs等污染土壤的修復(fù)。電動(dòng)-微生物修復(fù)技術(shù)主要是利用直流電場(chǎng)產(chǎn)生的各種電動(dòng)力學(xué)效應(yīng)增強(qiáng)微生物的降解性能，但在實(shí)際應(yīng)用中微生物的運(yùn)動(dòng)、活性和多樣性等受外界環(huán)境因素的影響很大，土著微生物或接種微生物的數(shù)量和活性迅速降低，無(wú)法達(dá)到預(yù)期效果。因此，為了建立高效的電動(dòng)-微生物修復(fù)技術(shù)，就必須篩選適合于電場(chǎng)條件下 的高效石油降解菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對(duì)石油污染土壤電動(dòng)-微生物修復(fù)技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種適合于電場(chǎng)條件下的石油烴降解菌及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:一種適合于電場(chǎng)條件下的石油烴降解菌，石油烴降解菌為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5，已于2011年7月19日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏登記號(hào)為CCTCC No:M 2011261。適合于電場(chǎng)條件下的石油烴降解菌的應(yīng)用，所述地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PS5用于污染土壤的修復(fù)。所述地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5用于石油烴污染土壤的修復(fù)。在污染土壤施加單向和切換電場(chǎng)，并將所述地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5施入污染土壤，在0.5-2.0V/cm的電場(chǎng)條件存在下進(jìn)行污染土壤的修復(fù)。本發(fā)明地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 可在不同電場(chǎng)條件下生長(zhǎng)。所述的電場(chǎng)條件具體可指0.5V/cm、lV/cm、2V/cm單向電場(chǎng)和切換電場(chǎng)中的至少一種。本發(fā)明地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 可用于降解石油烴化合物。所述的石油烴化合物可為石油組分烷烴、芳烴和膠質(zhì)及混合石油烴中的至少一種。本發(fā)明地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 可用于環(huán)境污染修復(fù)。所述環(huán)境污染可為石油烴污染。所述的石油烴化合物具體可為烷烴、芳烴和膠質(zhì)及混合石油烴的一種。所述環(huán)境為土壤。本發(fā)明所提供的適合于電場(chǎng)條件下的石油烴降解菌是從遼河油田石油污染土壤中篩選得到的。根據(jù)其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性和16SrRNA基因序列分析證實(shí)屬于芽孢桿菌屬，將其命名為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5。地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5已于2011年7月19日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，地址為:武漢市武昌珞珈山，武漢大學(xué))，保藏登記號(hào)為CCTCC No:M 2011261。本發(fā)明地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 為革蘭氏染色陽(yáng)性，細(xì)胞為直的桿狀，大小為0.6-0.8X1.2-2.5 μ m,單個(gè)或短鏈排列，具圓端，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)；芽孢中生或端生、橢圓形；為好氧細(xì)菌，可生長(zhǎng)PH范圍為5.7-8.5，最適生長(zhǎng)pH值為7.2 ;可生長(zhǎng)溫度范圍為15-50°C，最適生長(zhǎng)溫度是30°C ;能利用葡萄糖，接觸酶陽(yáng)性。在肉汁培養(yǎng)基上的菌落為扁平、邊緣不整齊、白色、表面粗糙皺褶。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):1.本發(fā)明地衣芽孢桿菌(B acillus licheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 可在電場(chǎng)條件下以石油烴作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)將其降解。本發(fā)明為電動(dòng)-微生物修復(fù)石油污染土壤提供了新的微生物資源，對(duì)于石油污染的治理具有重大價(jià)值，具有客觀的經(jīng)濟(jì)效益和良好的社會(huì)效益。2.本發(fā)明分離得到菌株在電場(chǎng)條件作用下具有較高的活性，能提高電場(chǎng)條件下烷烴、芳烴、膠質(zhì)和混合石油烴的降解率。在施加0.5V/cm、l.0V/cm,2.0V/cm電場(chǎng)后，地衣芽孢桿菌的降解活性增強(qiáng)，28天后烷烴、芳烴和膠質(zhì)及混合石油烴的去除率分別增加了
4.19-21.91%和7.64-23.32%。本發(fā)明可用于石油污染土壤的原位修復(fù)，具有快速、方便、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。


圖1 是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 在顯微鏡下的形態(tài)照片(100X)。圖 2 是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) PS5 CCTCC No:M2011261 在不同電場(chǎng)條件下的細(xì)菌數(shù)量隨時(shí)間變化曲線。圖 3 是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) PS5 CCTCC No:M2011261 在不同電場(chǎng)條件下對(duì)烷烴、芳烴和膠質(zhì)的降解率。圖 4 是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) PS5 CCTCC No:M2011261 在不同電場(chǎng)條件下對(duì)混合石油烴的降解率。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 的分離及篩選樣品來(lái)自于遼河油田周邊石油烴污染土壤，稱取5g 土壤，加入50ml無(wú)菌水振蕩30min后吸取上清液至含1000mg/L石油烴的富集培養(yǎng)基即無(wú)機(jī)鹽加石油烴培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基的組成:MgS04.7H20 2.6g ；CaCl2.H2O 0.16g ；K2HP046.0g ；KH2P046.0g ； (NH4)2S046.0g ；NaCl 12.0g ;蒸餾水1000ml ；pH 7.2-7.4，121°C滅菌30min)，培養(yǎng)3d后，在含石油烴的固體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上劃線分離，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落劃線分離純化三次后，將菌株保存在斜面培養(yǎng)基上。將得到的純菌株接種于含有烷烴(550mg/L)、芳烴(350mg/L)和膠質(zhì)(200mg/L)三種石油烴組分的液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，28°C，150rpm/min培養(yǎng)30天后，測(cè)定烷烴、芳烴和膠質(zhì)的剩余含量。分離得到一株對(duì)烷烴、芳烴和膠質(zhì)均具有較高降解率的菌株，即地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PS5已于2011年7月19日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏登記號(hào)為CCTCC No:M 2011261。地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5形態(tài)及生理生化特性:革蘭氏染色陽(yáng)性，細(xì)胞為直的桿狀，大小為0.6-0.8X1.2-2.5 μ m,單個(gè)或短鏈排列，具圓端，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)；芽孢中生或端生、橢圓形；為好氧細(xì)菌，可生長(zhǎng)PH范圍為5.7-8.5，最適生長(zhǎng)pH值為7.2 ;可生長(zhǎng)溫度范圍為15-50°C，最適生長(zhǎng)溫度是30°C;能利用葡萄糖，接觸酶陽(yáng)性。在肉汁培養(yǎng)基上的菌落為扁平、邊緣不整齊、白色、表面粗糙皺褶。實(shí)施例2:地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 在電場(chǎng)條件下的生物活性將上述地衣芽孢 桿菌(Bacillus licheniformis)PS5接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，然后在30°C、160r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)3天；室溫下8000r/min離心收集菌體，再用磷酸鹽緩沖液稀釋液(儲(chǔ)存液KH2P0434.0g ；lmol/LNa0H溶液175ml ;蒸餾水825ml ；pH7.2 ;稀釋液:取儲(chǔ)存液1.25ml，用蒸餾水稀釋至1000ml，121°C高壓滅菌30min)將菌體制備成菌懸液。將制備好的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5的菌懸液加入到經(jīng)滅菌的清潔草甸棕壤(中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)生態(tài)站土壤)，土壤中地衣芽孢桿菌的濃度為6.8 X 107CFU/g干土。同時(shí)在供試土壤中施加單向和切換電場(chǎng)，電壓分別為0.5V/cm、
1.0V/cm、2.0V/cm,電極間距為24cm, 土壤濕度為25%,實(shí)驗(yàn)運(yùn)行28天。以不施加電場(chǎng)單獨(dú)添加微生物的反應(yīng)系統(tǒng)作為對(duì)照。每7d采樣I次，測(cè)定土壤中地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PS5活細(xì)菌數(shù)量，土壤中細(xì)菌數(shù)量采用平板計(jì)數(shù)法。從圖2中可以看出，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的處理，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PS5數(shù)量都有所增加，但施加電場(chǎng)處理中地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5數(shù)量明顯高于空白對(duì)照，說(shuō)明外加電場(chǎng)有利于土壤中地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) PS5的生長(zhǎng)。比較7d、14d、21d和28d時(shí)各處理土壤中地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PS5數(shù)量,發(fā)現(xiàn)電場(chǎng)強(qiáng)度大小會(huì)對(duì)土壤中微生物的數(shù)量產(chǎn)生一定影響，2.0V/cm電場(chǎng)強(qiáng)度更利于地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PS5的生長(zhǎng)，數(shù)量大小順序?yàn)?2.0V/cm > 1.0V/cm > 0.5V/cm ;同時(shí)，從圖中也可以看出切換電場(chǎng)處理土壤中地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PS5數(shù)量高于未切換電場(chǎng)處理。從以上結(jié)果來(lái)看，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5能夠在適宜的電場(chǎng)條件下生長(zhǎng)，2.0V/cm的電場(chǎng)條件最適宜，切換電場(chǎng)處理的效果要高于不進(jìn)行切換電場(chǎng)處理效
果O實(shí)施例3:地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 在不同電場(chǎng)條件下對(duì)烷烴、芳烴和膠質(zhì)的降解作用將地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) PS5接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，然后在30°C、160r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)3天；室溫下8000r/min離心收集菌體，再用磷酸鹽緩沖液將菌體制備成菌懸液。將制備好的菌懸液分別接種于含烷烴(550mg/kg)、芳烴(350mg/kg)、膠質(zhì)(200mg/kg)的污染土壤中，土壤中地衣芽孢桿菌的濃度為6.8X107CFU/g干土。同時(shí)在供試土壤中施加單向和切換電場(chǎng)，電壓分別為0.5V/cm、l.0V/cm、2.0V/cm,電極間距為24cm,土壤濕度為25%,實(shí)驗(yàn)運(yùn)行28天。以不施加電場(chǎng)但添加微生物的反應(yīng)系統(tǒng)作為對(duì)照。每7d采樣I次，樣品為中間、兩端土壤的混合樣，采用重量法測(cè)定土壤中各污染物的濃度，計(jì)算各污染物的去除率。從圖3中可以看出，各處理烷烴、芳烴和膠質(zhì)均有不同程度的去除，其中烷烴的去除率要高于芳烴和膠質(zhì) 。比較外加電場(chǎng)處理和單獨(dú)微生物處理，施加電場(chǎng)后烷烴、芳烴和膠質(zhì)的去除率都有所增加，烷烴的去除率增加較明顯，烷烴、芳烴和膠質(zhì)的最大去除率分別增加了 21.91%，12.51%和4.19 %，說(shuō)明在電場(chǎng)作用下地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PS5的生物活性增強(qiáng)，電場(chǎng)促進(jìn)了其對(duì)污染物的降解。同時(shí)，從圖中也可以看出電場(chǎng)強(qiáng)度和電場(chǎng)的作用方式影響地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PS5的活性，各處理去除率的大小順序?yàn)?2.0V/cm > 1.0V/cm > 0.5V/cm,切換電場(chǎng)處理土壤中各污染物的去除率要高于未切換電場(chǎng)處理。實(shí)施例4:地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5 CCTCC No:M2011261 在不同電場(chǎng)條件下對(duì)混合石油烴的降解作用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5菌懸液的制備參照實(shí)施例3。將制備好的菌懸液接種于石油污染土壤中，土壤中混合石油烴的總濃度為1200.00mg/kg，土壤中地衣芽孢桿菌的濃度為6.8X107CFU/g干土。同時(shí)在供試土壤中施加單向和切換電場(chǎng)，電壓分別為0.5V/cm、l.0V/cm、2.0V/cm,電極間距為24cm,土壤濕度為25%,實(shí)驗(yàn)運(yùn)行28天。以不施加電場(chǎng)但添加微生物的反應(yīng)系統(tǒng)作為對(duì)照。每7d采樣I次，樣品為中間、兩端土壤的混合樣，采用重量法測(cè)定土壤中石油烴的濃度，計(jì)算土壤中石油烴的去除率。從圖4中可以看出，外加電場(chǎng)處理中混合石油烴的去除率明顯高于單獨(dú)的微生物處理，說(shuō)明外加電場(chǎng)提高了地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PS5的生物活性，促進(jìn)了其對(duì)石油烴的降解作用，其去除率分別提高了 7.64%、10.02%,9.20%, 13.73%、17.00%和23.32%。同時(shí)，從圖中也可以看出電場(chǎng)強(qiáng)度和作用方式也影響了地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PS5的活性,各處理對(duì)石油烴去除率的大小順序?yàn)?2.0V/cm >
1.0V/cm > 0.5V/cm，切換電場(chǎng)處理土壤中石油烴的去除率要高于未切換電場(chǎng)處理。
權(quán)利要求
1.一種適合于電場(chǎng)條件下的石油烴降解菌，其特征在于:石油烴降解菌為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5,已于2011年7月19日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏登記號(hào)為CCTCC No:M 2011261。
2.—種權(quán)利要求1所述的適合于電場(chǎng)條件下的石油烴降解菌的應(yīng)用，其特征在于:所述地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5用于污染土壤的修復(fù)。
3.按權(quán)利要求2所述的適合于電場(chǎng)條件下的石油烴降解菌的應(yīng)用，其特征在于:所述地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5用于石油烴污染土壤的修復(fù)。
4.按權(quán)利要求2或3所述的適合于電場(chǎng)條件下的石油烴降解菌的應(yīng)用，其特征在于:在污染土壤施加單向和切換電場(chǎng)，并將所述地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5施入污染土壤，在0.5-2.0 V/cm的電場(chǎng)條件存在下進(jìn)行污染土壤的修復(fù)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株適合于電場(chǎng)條件下的石油烴降解菌及其應(yīng)用。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)PS5分離自石油污染土壤，能夠降解石油烴，已于2011年7月19日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏登記號(hào)為CCTCC NoM 2011261。所述地衣芽孢桿菌PS5用于污染土壤的修復(fù)。本發(fā)明分離得到的菌株在0.5-2.0V/cm電場(chǎng)條件作用下具有較高的活性，能提高烷烴、芳烴和膠質(zhì)及混合石油烴的去除率。在施加電場(chǎng)后，地衣芽孢桿菌PS5的降解活性增強(qiáng)，28天后對(duì)石油烴單一組分和混合石油烴的去除率分別增加了4.19-21.91％和7.64-23.32％。
文檔編號(hào)C12R1/10GK103160448SQ20111041563
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者郭書海, 李鳳梅, 張玲妍, 李剛, 李婷婷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所