專利名稱：一種檢測埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙熱病毒和裂谷熱病毒的多重pcr試劑盒及其引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病原分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種同時檢測四種烈性傳染病病毒，包括埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙熱病毒和裂谷熱病毒的多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒及其引物。
背景技術(shù)：
埃博拉出血熱(Ebolahemorrhagic fever,EHF)是由埃博拉病毒(Ebola virus,EBV)引起的ー種急性出血性傳染病。主要通過接觸病人或感染動物的體液、排泄物、分泌物等感染，臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、出血和多臟器損害。埃博拉出血熱的病死率高，可達(dá) 50% -90%。埃博拉病毒源于非洲的剛果，在生物安全等級上和天花病毒同為最危險(xiǎn)的第四級，1976年首度在非洲扎伊爾北部和蘇丹南部出現(xiàn)。世界衛(wèi)生組織已將埃博拉病毒列為對人類危害最嚴(yán)重的病毒之一。埃博拉病毒屬絲狀病毒科絲狀病毒屬，可分為四種不同亞型扎伊爾埃博拉(EBO-Z)，蘇丹埃博拉(EBO-S)，科特迪瓦埃博拉(EBO-C)和萊斯頓埃博拉(EBO-R)。前3種亞型可使人和靈長類動物發(fā)病，其中扎伊爾埃博拉的致死率為88. 8% ;蘇丹埃博拉則為53. 2%。而瑞斯頓埃博拉只會使靈長類動物發(fā)病，但人類也可能感染這種病毒亞型從而成為無癥狀的病毒攜帯者，在西太平洋就有這種病例出現(xiàn)。埃博拉出血熱有4個傳播途徑直接接觸病人的血液、分泌物等體液傳播；通過直接接觸病人尸體傳播；處理發(fā)病或病死的猩猩、獼猴等動物引起傳播；醫(yī)務(wù)人員在護(hù)理病人時不采取有效的個人防護(hù)也會引起傳播。此病目前沒有有效藥物可以治療。馬爾堡出血熱(Marburghemorrhagic fever, MHF)是由馬爾堡病毒(MarburgVirus)引起的以急性發(fā)熱伴有嚴(yán)重出血為主要臨床表現(xiàn)的傳染性疾病，經(jīng)密切接觸傳播，傳染性強(qiáng)，病死率高。由于馬爾堡病毒來自于非洲綠猴并主要在非洲流行，因此馬爾堡出血熱又被稱為青猴病和非洲出血熱。歷史上最大的馬爾堡出血熱暴發(fā)是于2004年10月始于安哥拉國威熱省。截止2005年7月最后一例實(shí)驗(yàn)室確診病例，安哥拉衛(wèi)生部報(bào)告全國累計(jì)病例總數(shù)為374例，其中有329例死亡(病死率為88% )。拉沙熱是ー種名為拉沙病毒所引致的急性病毒感染，流行于西非洲的國家?guī)變?nèi)亞、利比里亞、塞拉利昂和尼日利亞。病毒的宿主是西非洲的野鼠。拉沙熱是經(jīng)由氣霧或直接接觸染病的嚙齒類動物排泄物而受感染，也可以直接經(jīng)由病人在發(fā)熱期傳播。人類感染病毒后可以沒有病徴，但亦可能病況嚴(yán)重，導(dǎo)至死亡。裂谷熱(RiftValley fever,RVF)是由裂谷熱病毒(Rift Valley fever Virus,RVFV)引起的、是ー種病毒性人畜共患病，主要影響的是動物，但也能傳染人。傳染可導(dǎo)致人畜患染嚴(yán)重疾病，發(fā)病率和死亡率極高。該疾病因裂谷熱感染的牲畜死亡和流產(chǎn)，也會造成重大經(jīng)濟(jì)損失。裂谷熱病毒是ー種屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬、基因組為單股負(fù)鏈RNA的病毒，有包膜，直徑約為90 lOOnm。絕大多數(shù)人感染裂谷熱病毒是與受感染動物的血液或器官直接或間接接觸所造成的，受感染蚊子叮咬也會導(dǎo)致人間感染，通常是伊蚊叮咬，嗜血(食血)蒼蠅也有可能傳播裂谷熱病毒。境外一些來自疫區(qū)的感染者或媒介昆蟲通過國境ロ岸的帶入，均可引起裂谷熱病毒在我國的擴(kuò)散。隨著與世界各國交通往來的日益頻繁，境外ー些來自疫區(qū)的人員可通過國境ロ岸進(jìn)入我國，存在著將上述四種疾病輸入我國的危險(xiǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)沒有涉及到對上述四種病毒進(jìn)行分子生物學(xué)快速檢測鑒定。因此，有必要在國境ロ岸建立ー套上述四種病毒的分子生物學(xué)快速檢驗(yàn)鑒定方法
發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了ー種同時檢測四種國外烈性傳染病埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙熱病毒和裂谷熱病毒的多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒及其引物。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明提供的埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙熱病毒和裂谷熱病毒的多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，包括主反應(yīng)液(QuantiFast Multiplex Master Mix)、RT反應(yīng)液(QuantiFastRT Mix)等試劑外，還包括四種病毒的引物和探針，如SEQ ID NO : 1_13所示的引物，以及序列如SEQID NO 14-18所示的探針。引物的具體序列如下EfCGGACACACAAAAAGAAAGAAErlATCAGTGTCAATGAGAGGAAAATEr2 ATTAGTTTGAGTTTGAGGAAAATGMf CATCTGATGGGATTCACACTGAGMr TGGGAGGTACACCTGTCCTGAALflCTCATGGGATTGATGTCACAGALrlCGAGGGAGTGCTTCTATAACTGCLf2-1 AAGGACCTATGCCACATGCACACLr2-1 AGGAGTTATCTCTTCTTTGCCACCLf2-2 CAAGGATTTGTGTCACATGCACACLr2-2 AGGGGTTATTTCCTCTTTGCCRf ATTCCTGAGACACATGGCATRr CACTTCCTTGCATCATCTGA探針的具體序列如下EP :FAM-aatcttcct+Cg+Tagttat+Tcg+Cacacaa_BHQl (TaqMan-LNA 探針)MP R0X-aaa+Gtt+Gct+Gat+Tc+Ccct-BHQ2 (TaqMan-LNA 探針)LPl :TET-acctggc+Tgtgc+Agcaaac_BHQl (TaqMan-LNA 探針)LP2 TET-ttcttct+Tc+Tcaa+Caa+Cg+Acacc-BHQl (TaqMan-LNA 探針)RP Cy5-cacaagtccacacaggccccttacatt-BHQ2 (TaqMan 探針)*EP、Mp、LPl和LP2為Taqman-LNA探針，堿基前含“ + ”表示該堿基為LNA修飾。運(yùn)用上述試劑盒進(jìn)行四種病毒的實(shí)時熒光RT-PCR檢測，反應(yīng)體系為20 μ L，分別為四重?zé)晒釸T-PCR，每種探針濃度為O. 2μΜ、每種引物濃度為O. 2μΜ，QuantiFastMultiplex MasterMix 2 μ M、QuantiFast RT Mix O. 2 μ Μ，陽性對照 5 μ Μ，用 DEPC Η20補(bǔ)齊；反應(yīng)條件(在ABI 7500儀器上)50°C 20min (逆轉(zhuǎn)錄)；95°C 15min (熱啟動)；94 0C 45s (變性)，60°C 75s (退火/延伸，采集熒光信號)，45循環(huán)。結(jié)果判斷無Ct 值或Ct > 40，且無明顯擴(kuò)增曲線，判斷為熒光RT-PCR檢測陰性；Ct值彡40，并有明顯擴(kuò)增曲線，初步判斷為病毒熒光RT-PCR檢測陽性；40 < Ct值彡45的標(biāo)本應(yīng)重做。若重做結(jié)果仍然有明顯擴(kuò)增曲線，則初歩判斷為病毒熒光RT-PCR檢測陽性，否則為陰性；熒光RT-PCR結(jié)果陽性的標(biāo)本應(yīng)進(jìn)ー步進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增片斷測序和序列比對后，確診是否為病毒核酸陽性。上述引物探針是用Lasergene軟件包中的SeqMan和MegAl ign程序分析從Genbank上獲得的病毒核苷酸序列，分析病毒基因組的保守性，選擇有核苷酸高度保守的區(qū)域，用PrimerEXpresS3. O軟件設(shè)計(jì)實(shí)時熒光RT-PCR檢測所需的特異性引物和熒光探針。本發(fā)明的試劑盒和引物探針能快速準(zhǔn)確檢測埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙熱病毒和裂谷熱病毒，能有效控制該類傳染病在國境ロ岸的傳入和輸出，準(zhǔn)確有效、可操作性強(qiáng)，并應(yīng)用于該傳染病的監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)可疑病例，提高防止該病傳入我國的能力。


圖I是本發(fā)明的ー個優(yōu)選實(shí)施例的試劑盒檢測四種病毒的熒光PCR結(jié)果圖；圖2是埃博拉病毒合成陽性對照的實(shí)時熒光PCR檢測，陽性對照為重組質(zhì)粒，即將埃博拉病毒上下游引物間的DNA序列連接到pUC57載體上構(gòu)成，插入位點(diǎn)為SmaI ；圖3是馬爾堡病毒合成陽性對照的實(shí)時熒光PCR檢測，陽性對照為重組質(zhì)粒，即將馬爾堡病毒上下游引物間的DNA序列連接到pUC57載體上構(gòu)成，插入位點(diǎn)為SmaI ；圖4是裂谷熱病毒合成陽性對照的實(shí)時熒光PCR檢測，陽性對照為重組質(zhì)粒，即將裂谷熱病毒上下游引物間的DNA序列連接到pUC57載體上構(gòu)成，插入位點(diǎn)為SmaI ；圖5是拉沙熱病毒合成陽性對照的實(shí)時熒光PCR檢測，陽性對照為重組質(zhì)粒，即將拉沙熱病毒上下游引物間的DNA序列連接到pUC57載體上構(gòu)成，插入位點(diǎn)為Smal。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例舉例了發(fā)明人的優(yōu)選實(shí)施例，用于示例本發(fā)明的模式，而不應(yīng)將本發(fā)明理解為限定于這些實(shí)施例的范圍。這些實(shí)施例，根據(jù)本文公開和本領(lǐng)域技術(shù)人員的普遍水平，技術(shù)人員將理解下列僅用于示例，可以在不超過本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行各種變動、修飾和改造。其中所涉及的技術(shù)，除非特別說明，均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等各個領(lǐng)域的常規(guī)技木。為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)ー步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。 實(shí)施例I :本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例的試劑盒組成本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例的試劑盒包括RT-PCR緩沖液、RT-PCR酶混合液等常規(guī)試劑外，還包括四種病毒的引物和探針，引物序列如SEQ ID NO 1-13所示，探針序列如SEQID NO 14-18 所示。引物的具體序列如下Ef CGGACACACAAAAAGAAAGAAErlATCAGTGTCAATGAGAGGAAAAT
Er2 ATTAGTTTGAGTTTGAGGAAAATGMf CATCTGATGGGATTCACACTGAGMr TGGGAGGTACACCTGTCCTGAALfl CTCATGGGATTGATGTCACAGALrlCGAGGGAGTGCTTCTATAACTGC
Lf2-1 AAGGACCTATGCCACATGCACACLr2-1 AGGAGTTATCTCTTCTTTGCCACCLf2-2 CAAGGATTTGTGTCACATGCACACLr2-2 AGGGGTTATTTCCTCTTTGCCRf ATTCCTGAGACACATGGCATRr CACTTCCTTGCATCATCTGA探針的具體序列如下EP :FAM-aatcttcct+Cg+Tagttat+Tcg+Cacacaa_BHQl (TaqMan-LNA 探針)MP R0X-aaa+Gtt+Gct+Gat+Tc+Ccct-BHQ2 (TaqMan-LNA 探針)LPl :TET-acctggc+Tgtgc+Agcaaac_BHQl (TaqMan-LNA 探針)LP2 TET-ttcttct+Tc+Tcaa+Caa+Cg+Acacc-BHQl (TaqMan-LNA 探針)RP Cy5-cacaagtccacacaggccccttacatt-BHQ2 (TaqMan 探針)*EP、Mp、LPl和LP2為Taqman-LNA探針，堿基前含“ + ”表示該堿基為LNA修飾。實(shí)施例2 :用本發(fā)明的試劑盒的ー個優(yōu)選實(shí)施例對樣本進(jìn)行檢測用美國Qiagen公司QIAamp Viral RNA Kit提取病毒核酸。使用本發(fā)明的ー個優(yōu)選實(shí)施例的試劑盒，四重?zé)晒釸T-PCR每種探針濃度為
O.2 μ Μ、每種引物濃度為O. 2 μ Μ，進(jìn)行四種烈性病毒實(shí)時熒光RT-PCR檢測，反應(yīng)體系設(shè)為2OyL;反應(yīng)條件(在ABI 75OO儀器上)50°C 2Omin (逆轉(zhuǎn)錄)；％°C I5Inin (熱啟動)；94 0C 45s (變性)，60°C 75s (退火/延伸，采集熒光信號)，45循環(huán)。結(jié)果見圖1，由圖I可見，在該反應(yīng)體系中檢測到四種病毒均為陽性。實(shí)施例3 :用本發(fā)明的試劑盒的ー個優(yōu)選實(shí)施例對樣本進(jìn)行檢測本實(shí)施例使用埃博拉病毒合成陽性對照樣本，陽性對照為重組質(zhì)粒，即將埃博拉病毒上下游引物間的DNA序列連接到pUC57載體上構(gòu)成，插入位點(diǎn)為Smal。四重?zé)晒釸T-PCR每種探針濃度為O. 2 μ Μ、每種引物濃度為O. 2 μ Μ，進(jìn)行實(shí)時熒光RT-PCR檢測，反應(yīng)體系設(shè)為20 μ L ;反應(yīng)條件(在ABI 7500儀器上)50°C 20min (逆轉(zhuǎn)錄)；95°C 15min (熱啟動)；94°C 45s (變性)，60°C 75s (退火/延伸，采集熒光信號)，45循環(huán)。結(jié)果見圖2，由圖2可見，在該反應(yīng)體系中檢測到埃博拉病毒為陽性。實(shí)施例4 :用本發(fā)明的試劑盒的ー個優(yōu)選實(shí)施例對樣本進(jìn)行檢測本實(shí)施例使用馬爾堡病毒合成陽性對照樣本，陽性對照為重組質(zhì)粒，即將馬爾堡病毒上下游引物間的DNA序列連接到pUC57載體上構(gòu)成，插入位點(diǎn)為Smal。四重?zé)晒釸T-PCR每種探針濃度為O. 2 μ Μ、每種引物濃度為O. 2 μ Μ，進(jìn)行實(shí)時熒光RT-PCR檢測，反應(yīng)體系設(shè)為20yL;反應(yīng)條件(在ABI 7500儀器上)50°C 20min (逆轉(zhuǎn)錄)；95°C15min (熱啟動)；94°C 45s (變性)，60°C 75s (退火/延伸，采集熒光信號)，45循環(huán)。結(jié)果見圖3，由圖3可見，在該反應(yīng)體系中檢測到馬爾堡病毒為陽性。
實(shí)施例5 :用本發(fā)明的試劑盒的ー個優(yōu)選實(shí)施例對樣本進(jìn)行檢測本實(shí)施例使用裂谷熱病毒合成陽性對照樣本，陽性對照為重組質(zhì)粒，即將裂谷熱病毒上下游引物間的DNA序列連接到pUC57載體上構(gòu)成，插入位點(diǎn)為SmaI ;四重?zé)晒釸T-PCR每種探針濃度為O. 2 μ Μ、每種引物濃度為O. 2 μ Μ，進(jìn)行實(shí)時熒光RT-PCR檢測，反應(yīng)體系設(shè)為20 μ L ;反應(yīng)條件(在ABI 7500儀器上)50°C 20min (逆轉(zhuǎn)錄)；95°C 15min (熱啟動)；94°C 45s (變性)，60°C 75s (退火/延伸，采集熒光信號)，45循環(huán)。結(jié)果見圖4，由圖4可見，在該反應(yīng)體系中檢測到裂谷熱病毒為陽性。實(shí)施例6 :用本發(fā)明的試劑盒的ー個優(yōu)選實(shí)施例對樣本進(jìn)行檢測本實(shí)施例使用拉沙熱病毒合成陽性對照樣本，陽性對照為重組質(zhì)粒，即將拉沙熱病毒上下游引物間的DNA序列連接到pUC57載體上構(gòu)成，插入位點(diǎn)為Smal。四重?zé)晒釸T-PCR每種探針濃度為O. 2 μ Μ、每種引物濃度為O. 2 μ Μ，進(jìn)行實(shí)時熒光RT-PCR檢測，反應(yīng)體系設(shè)為20 μ L ;反應(yīng)條件(在ABI 7500儀器上)50°C 20min (逆轉(zhuǎn)錄)；95°C 15min (熱 啟動)；94°C 45s (變性)，60°C 75s (退火/延伸，采集熒光信號)，45循環(huán)。結(jié)果見圖5，由圖5可見，在該反應(yīng)體系中檢測到拉沙熱病毒為陽性。最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。序列表〈120〉ー種埃博拉、馬爾堡、拉沙熱和裂谷熱的多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒及其引物<160>18<170>PatentIn version 3. 2〈210〉I<211>21<212>DNA<213>Ef〈400〉Icggacacaca aaaagaaaga a 2丄<210>1<211>23<212>DNA<213>Erl<400>2atcagtgtca atgagaggaa aat 23<210>1<211>24<212>DNA<213>Er2<400>3
attagtttga gtttgaggaa aatg 24<210>1<211>23<212>DNA<213>Mf<400>4catctgatgg gattcacact gag 23
<210>1<211>22<212>DNA<213>Mr<400>5tgggaggtac acctgtcctg aa 22<210>1
<211>22<212>DNA<213>Lfl<400>6ctcatgggat tgatgtcaca ga 22<210>1<211>23<212>DNA<213>Lrl<400>7cgagggagtg cttctataac tgc 23<210>1<211>23<212>DNA<213>Lf2-l<400>8aaggacctat gccacatgca cac 23<210>1<211>24<212>DNA<213>Lr2-l<400>9aggagttatc tcttctttgc cacc 24<210>1<211>24
<212>DNA<213>Lf2-2<400>10
caaggatttg tgtcacatgc acac 24<210>1<211>21<212>DNA<213>Lr2-2〈400〉11aggggttatt tcctctttgc c 21<210>1<211>20<212>DNA<213>Rf<400>12attcctgaga cacatggcat 20<210>1<211>20<212>DNA<213>Rr<400>13cacttccttg catcatctga 20<210>1<211>28<212>DNA<213>EP<400>14aatcttcctc gtagttattc gcacacaa 28<210>1<211>18<212>DNA<213>MP<400>15aaagttgctg attcccct 18<210>1<211>19<212>DNA<213>LP1<400>1權(quán)利要求
1.一種檢測埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙熱病毒和裂谷熱病毒的多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，所述試劑盒包括聚合酶和反應(yīng)液，其特征在于，還包括序列如SEQ ID NO :1-13所示的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，還包括序列如SEQID NO :14-18所示的探針。
3.ー種用于檢測埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙熱病毒和裂谷熱病毒的多重?zé)晒釶CR引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO :1-13所示。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種同時檢測埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙熱病毒和裂谷熱病毒的多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒及其引物。本發(fā)明提供的試劑盒包括RT-PCR緩沖液、RT-PCR酶混合液等常規(guī)試劑外，還包括四種病毒的引物和探針，如SEQ ID NO1-13所示的引物，以及序列如SEQ ID NO14-18所示的探針。利用本發(fā)明的試劑盒和引物探針能快速準(zhǔn)確檢測埃博拉、馬爾堡、拉沙熱和裂谷熱的病原體，能有效控制該類傳染病在國境口岸的傳入和輸出，準(zhǔn)確有效、可操作性強(qiáng)，并應(yīng)用于該類傳染病的監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)可疑病例，提高防止該病傳入我國的能力。
文檔編號C12N15/11GK102719557SQ201110416348
公開日2012年10月10日 申請日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者師永霞, 幸蘆琴, 李小波, 洪燁, 相大鵬, 蘇錦坤, 鄭夔, 郭波旋, 鐘玉清, 黃吉城 申請人:廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心