專(zhuān)利名稱(chēng)：利用豬皮制備膠原蛋白抗氧化肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗氧化肽的制備方法，具體的說(shuō)是一種利用豬皮制備膠原蛋白抗氧化肽的方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)是一個(gè)養(yǎng)豬大國(guó)，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，養(yǎng)豬業(yè)也得到了飛速的發(fā)展，據(jù)資料顯示，我國(guó)豬的存欄數(shù)、出欄數(shù)、豬肉產(chǎn)量多年來(lái)均位居世界第一位，中國(guó)豬肉產(chǎn)量約占世界產(chǎn)量的一半之多，豬肉的產(chǎn)量占我國(guó)肉類(lèi)總產(chǎn)量的69. 4%。在生產(chǎn)豬肉的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，豬皮就是其中之一。動(dòng)物皮膚最重要的一個(gè)應(yīng)用就是制革，但由于豬皮本身質(zhì)地不佳，目前在皮革工業(yè)中已經(jīng)很少采用豬皮，另外，由于豬皮有令人難以接受的特有異味、不良的口感、消化率低、加工不方便等原因常將其扔棄，很少直接使用，造成了豬皮的大量積壓，豬皮的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功用沒(méi)有得到充分的發(fā)揮。
據(jù)報(bào)道，豬皮中蛋白質(zhì)的含量高達(dá)33%以上，其中膠原蛋白含量為88%左右，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值十分可觀。膠原蛋白由于特殊復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，其分子量高達(dá)300KD，相對(duì)于膠原蛋白肽而言很難被人體吸收，因此，通過(guò)生物手段把膠原蛋白水解為具有抗氧化、免疫等多種生理調(diào)節(jié)功能小分子的多肽物質(zhì)，是極具發(fā)展前景的功能因子。
目前國(guó)內(nèi)外研究者多采用酶法水解膠原蛋白，利用蛋白酶催化活性肽的合成，最明顯的副作用是蛋白酶本身的水解作用，會(huì)造成許多不必要的產(chǎn)物生成，此外缺乏適合使用的蛋白酶、產(chǎn)率低等技術(shù)問(wèn)題也限制酶法的廣泛應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述問(wèn)題的不足，提供利用豬皮制備膠原蛋白抗氧化肽的方法，其工藝簡(jiǎn)單，便于操作，提高豬皮的利用價(jià)值，增加經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明中所用的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，為一般市售產(chǎn)品，而本發(fā)明中所用的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌均購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，枯草芽孢桿菌的保藏編號(hào)為(CICC10063)，地衣芽孢桿菌的保藏編號(hào)為(CICC20197)。
本發(fā)明為解決上述問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是利用豬皮制備膠原蛋白抗氧化肽的方法，所述的制備方法為步驟一、按重量百分比取3—6%的濃度大于90%的豬皮膠原蛋白和94一97%的水，混合均勻，形成豬皮膠原蛋白溶液，利用0. 45ΜΠ1的微孔率膜對(duì)豬皮膠原蛋白溶液進(jìn)行過(guò)濾，滅菌，備用；步驟二、按重量份數(shù)比取2份的枯草芽孢桿菌菌液和1份的地衣芽孢桿菌菌液，混合均勻，形成混合菌液，備用；步驟三、按重量百分比將3—6%的混合菌液接種到94一97%的步驟一中經(jīng)過(guò)滅菌后的豬皮膠原蛋白溶液中，在32—37°C條件下，發(fā)酵培養(yǎng)24—72小時(shí)，形成發(fā)酵液，備用；步驟四、將步驟三中得到的發(fā)酵液送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，取離心后的上清液并經(jīng)過(guò)0. 45ΜΠ1的微孔率膜過(guò)濾，得到濾液，備用；步驟五、將步驟四中得到的濾液通過(guò)截流分子量為1000—5000的超濾膜過(guò)濾，得到產(chǎn)PΡΠ O
有益效果本發(fā)明通過(guò)豬皮制備豬皮膠原蛋白抗氧化肽的方法，其得到的豬皮膠原蛋白抗氧化肽的分子量為IOOODa—5000Da，具有較高的抗脂質(zhì)氧化活性、清除自由基的能力和螯合金屬離子能力。
本發(fā)明的制備方法，工藝簡(jiǎn)單，便于操作，制得的抗氧化肽分子量小，更易被消化道直接吸收，且不含有害成分及毒副作用，適合大規(guī)模生產(chǎn)，能夠有效提高豬皮中膠原蛋白資源的利用率，提高豬皮資源的附加值。
豬皮中蛋白質(zhì)的含量高達(dá)33%以上，其中膠原蛋白含量為88%左右，膠原蛋白由于特殊復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，其分子量高達(dá)300KD，很難被人體吸收，通過(guò)微生物發(fā)酵把膠原蛋白水解為具有抗氧化、免疫等多種生理調(diào)節(jié)功能小分子的多肽物質(zhì)，是極具發(fā)展前景的功能因子，本發(fā)明利用微生物發(fā)酵豬皮膠原蛋白生產(chǎn)膠原蛋白多肽，以產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵菌株代替昂貴的商品酶制劑，降低成本，另外利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)多肽時(shí)，微生物可對(duì)肽的基團(tuán)進(jìn)行修飾、重組，制得的肽無(wú)異味，可廣泛用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。
本發(fā)明的制備方法，提高經(jīng)濟(jì)效益，降低生產(chǎn)成本，減少資源浪費(fèi)。
具體實(shí)施方式
利用豬皮制備膠原蛋白抗氧化肽的方法，所述的制備方法為步驟一、按重量百分比取3—6%的濃度大于90%的豬皮膠原蛋白和94一97%的水，混合均勻，形成豬皮膠原蛋白溶液，利用0. 45ΜΠ1的微孔率膜對(duì)豬皮膠原蛋白溶液進(jìn)行過(guò)濾，滅菌，備用；步驟二、按重量份數(shù)比取2份的枯草芽孢桿菌菌液和1份的地衣芽孢桿菌菌液，混合均勻，形成混合菌液，備用；步驟三、按重量百分比將3—6%的混合菌液接種到94一97%的步驟一中經(jīng)過(guò)滅菌后的豬皮膠原蛋白溶液中，在32—37°C條件下，發(fā)酵培養(yǎng)24—72小時(shí)，形成發(fā)酵液，備用；步驟四、將步驟三中得到的發(fā)酵液送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，取離心后的上清液并經(jīng)過(guò)0. 45ΜΠ1的微孔率膜過(guò)濾，得到濾液，備用；步驟五、將步驟四中得到的濾液通過(guò)截流分子量為1000—5000的超濾膜過(guò)濾，得到產(chǎn)PΡΠ O
實(shí)施例一利用豬皮制備膠原蛋白抗氧化肽的方法，所述的制備方法為步驟一、按重量百分比取3%的濃度為90%的豬皮膠原蛋白和97%的水，混合均勻，形成豬皮膠原蛋白溶液，利用0. 45Mffl的微孔率膜對(duì)豬皮膠原蛋白溶液進(jìn)行過(guò)濾，滅菌，備用；步驟二、按重量份數(shù)比取2份的枯草芽孢桿菌菌液和1份的地衣芽孢桿菌菌液，混合均勻，形成混合菌液，備用；步驟三、按重量百分比將3%的混合菌液接種到97%的步驟一中經(jīng)過(guò)滅菌后的豬皮膠原蛋白溶液中，在32°C條件下，發(fā)酵培養(yǎng)M小時(shí)，形成發(fā)酵液，備用；步驟四、將步驟三中得到的發(fā)酵液送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，取離心后的上清液并經(jīng)過(guò)0. 45ΜΠ1的微孔率膜過(guò)濾，得到濾液，備用；步驟五、將步驟四中得到的濾液通過(guò)截流分子量為1000的超濾膜過(guò)濾，得到分子量為 IOOODa的膠原蛋白抗氧化肽。
實(shí)施例二利用豬皮制備膠原蛋白抗氧化肽的方法，所述的制備方法為步驟一、按重量百分比取4%的濃度為95%的豬皮膠原蛋白和96%的水，混合均勻，形成豬皮膠原蛋白溶液，利用0. 45Mffl的微孔率膜對(duì)豬皮膠原蛋白溶液進(jìn)行過(guò)濾，滅菌，備用；步驟二、按重量份數(shù)比取2份的枯草芽孢桿菌菌液和1份的地衣芽孢桿菌菌液，混合均勻，形成混合菌液，備用；步驟三、按重量百分比將5%的混合菌液接種到95%的步驟一中經(jīng)過(guò)滅菌后的豬皮膠原蛋白溶液中，在34°C條件下，發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)，形成發(fā)酵液，備用；步驟四、將步驟三中得到的發(fā)酵液送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，取離心后的上清液并經(jīng)過(guò)0. 45ΜΠ1的微孔率膜過(guò)濾，得到濾液，備用；步驟五、將步驟四中得到的濾液通過(guò)截流分子量為3000的超濾膜過(guò)濾，得到分子量為 3000Da的膠原蛋白抗氧化肽。
實(shí)施例三利用豬皮制備膠原蛋白抗氧化肽的方法，所述的制備方法為步驟一、按重量百分比取6%的濃度為98%的豬皮膠原蛋白和94%的水，混合均勻，形成豬皮膠原蛋白溶液，利用0. 45Mffl的微孔率膜對(duì)豬皮膠原蛋白溶液進(jìn)行過(guò)濾，滅菌，備用；步驟二、按重量份數(shù)比取2份的枯草芽孢桿菌菌液和1份的地衣芽孢桿菌菌液，混合均勻，形成混合菌液，備用；步驟三、按重量百分比將6%的混合菌液接種到94%的步驟一中經(jīng)過(guò)滅菌后的豬皮膠原蛋白溶液中，在37°C條件下，發(fā)酵培養(yǎng)72小時(shí)，形成發(fā)酵液，備用；步驟四、將步驟三中得到的發(fā)酵液送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，取離心后的上清液并經(jīng)過(guò)0. 45ΜΠ1的微孔率膜過(guò)濾，得到濾液，備用；步驟五、將步驟四中得到的濾液通過(guò)截流分子量為5000的超濾膜過(guò)濾，得到分子量為 5000Da的膠原蛋白抗氧化肽。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)1)抗氧化活性試驗(yàn)將ang的膠原蛋白抗氧化肽加到2. 5mL濃度為50mM、pH為7. 0的PBS溶液中，后加入 5mL亞油酸乙醇混合液，混合均勻，形成反應(yīng)液，后將反應(yīng)液密封，并置于40°C的恒溫箱內(nèi)， 放置M小時(shí)，每隔8小時(shí)，利用硫氰酸銨法檢測(cè)膠原蛋白抗氧化肽的氧化程度，檢測(cè)方法為分別在4. 7mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的乙醇中加入100 μ L反應(yīng)液，在100 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30% 的硫氰酸銨中加入100 μ L反應(yīng)液，在IOOyL的FeCl2溶液中加入100 μ L反應(yīng)液，在溫度為21°C條件下，放置3分鐘，后分別送入紫外分光光度計(jì)內(nèi)，在500nm處測(cè)定OD值；檢測(cè)結(jié)果通過(guò)硫氰酸銨法對(duì)膠原蛋白抗氧化肽與未發(fā)酵的豬皮中膠原蛋白進(jìn)行比對(duì)，其膠原蛋白抗氧化肽的抗脂質(zhì)氧化能力提高40. 33%。
2)清除1，1_ 二苯基-2-三硝基苯胼基自由基能力的檢測(cè)取ImL濃度為0. 2mg/mL的膠原蛋白抗氧化肽和0. 2mL的去離子水，混合均勻，后加入 3. OmL的1，1- 二苯基-2-三硝基苯胼基溶液，混合均勻，在溫度為21°C條件下，反應(yīng)30分鐘，后送入紫外分光光度計(jì)內(nèi)，在519nm處測(cè)定其OD值，后通過(guò)OD值檢測(cè)膠原蛋白抗氧化肽中清除1，1- 二苯基-2-三硝基苯胼的能力，S卩1，1- 二苯基-2-三硝基苯胼基自由基抑制率；1，1- 二苯基-2-三硝基苯胼基自由基抑制率為(Ao - Ae) /Ao X 100% 其中Ao為沒(méi)有肽段的OD值，Ae是含有肽段的OD值；檢測(cè)結(jié)果膠原蛋白抗氧化肽的1，1_ 二苯基-2-三硝基苯胼基自由基抑制率為 63. 54% ；3)金屬離子螯合活力的測(cè)定銅離子絡(luò)合法的工作原理鄰苯二酚紫與CuSO4反應(yīng)生產(chǎn)藍(lán)色沉淀，當(dāng)有抗氧化肽存在時(shí)，鄰苯二酚紫與CuSO4中的Cu2+離子分離，藍(lán)色消失，銅離子絡(luò)合法為取Iml濃度為 2mmol/L的CuSO4溶液、Iml濃度為10%的吡啶和20ul濃度為10%的鄰苯二酚紫混合液，混合均勻，后加入Iml的膠原蛋白抗氧化肽，混合均勻，后送入紫外分光光度計(jì)內(nèi)，在632nm處測(cè)定膠原蛋白抗氧化肽的OD值，并用去離子水做對(duì)照，在632nm處檢測(cè)去離子水的OD值， 計(jì)算螯合能力(％):螯合能力(％) = [1_(膠原蛋白抗氧化肽的OD值/去離子水的OD值)]X 100% 檢測(cè)結(jié)果膠原蛋白抗氧化肽對(duì)銅離子鰲合率為70. 20% ； 由此可知，本發(fā)明的膠原蛋白抗氧化肽在這三種體系中均具有很高的抗氧化性； 所述的PBS溶液的組成成分，每升PBS溶液中含有8g的氯化鈉、0. 2g的氯化鉀、1. 44g 的磷酸氫二鉀、0. 24g的磷酸二氫鉀，余量為水；所述的亞油酸乙醇混合液的組成成分，每升亞油酸乙醇混合液中含有50mM的亞油酸和濃度為99. 5%的乙醇；所述的FeCl2溶液的組成成分，每升FeCl2溶液中含有濃度為20 μ M的FeCl2和濃度為 3. 5%的鹽酸；所述的1，I" 二苯基-2-三硝基苯胼基溶液的組成成分，按重量百分比1，1- 二苯基-2-三硝基苯胼基溶液中含有5%的1，1- 二苯基-2-三硝基苯胼基溶液和95%的乙醇。
權(quán)利要求
1.利用豬皮制備膠原蛋白抗氧化肽的方法，其特征在于所述的制備方法為 步驟一、按重量百分比取3—6%的濃度大于90%的豬皮膠原蛋白和94一97%的水，混合均勻，形成豬皮膠原蛋白溶液，利用0. 45ΜΠ1的微孔率膜對(duì)豬皮膠原蛋白溶液進(jìn)行過(guò)濾，滅菌，備用；步驟二、按重量份數(shù)比取2份的枯草芽孢桿菌菌液和1份的地衣芽孢桿菌菌液，混合均勻，形成混合菌液，備用；步驟三、按重量百分比將3—6%的混合菌液接種到94一97%的步驟一中經(jīng)過(guò)滅菌后的豬皮膠原蛋白溶液中，在32—37°C條件下，發(fā)酵培養(yǎng)24—72小時(shí)，形成發(fā)酵液，備用；步驟四、將步驟三中得到的發(fā)酵液送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，取離心后的上清液并經(jīng)過(guò)0.45Mm的微孔率膜過(guò)濾，得到濾液，備用；步驟五、將步驟四中得到的濾液通過(guò)截流分子量為1000—5000的超濾膜過(guò)濾，得到產(chǎn)PΡΠ O
全文摘要
利用豬皮制備膠原蛋白抗氧化肽的方法，將3-6%的混合菌液接種到94-97%的豬皮膠原蛋白溶液中，在32-37℃條件下，發(fā)酵培養(yǎng)24-72小時(shí)，形成發(fā)酵液，后將發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，取離心后的上清液過(guò)濾，得到濾液，再將濾液通過(guò)截流分子量為1000-5000的超濾膜過(guò)濾，得到產(chǎn)品。本發(fā)明利用豬皮制備膠原蛋白抗氧化肽的方法，其工藝簡(jiǎn)單，便于操作，提高豬皮的利用價(jià)值，增加經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12R1/125GK102517367SQ20111042045
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者劉麗莉, 莊軍輝, 康懷彬, 張慧蕓, 朱文學(xué), 楊芳寧 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)