專利名稱：蛋白質性電子介質的制作方法
蛋白質性電子介質本申請是2010年4月30日提交的201080018692. 2號發(fā)明專利申請“蛋白質性電子介質”的分案申請。
技術領域：
本發(fā)明涉及酶傳感器及生物電池等中使用的葡萄糖氧化還原酶用電子介質等。背景技術：
電子介質也稱為電子傳遞物質，這是指有從電子提供體接受電子的功能及/或向電子受體供給電子的功能的物質，已知在氧化型或還原型的狀態(tài)下存在。該電子介質除了在酶活性的比色定量等中使用之外、在酶電極發(fā)揮將從酶接受的電子向電極供給的作用。酶電極，通過利用酶，在測定活體樣品中含的特定物質(成為目標的物質)的含有量的酶傳感器等中使用。已經有各種各樣的酶傳感器商品化，已知例如，血中葡萄糖濃度的測定中使用的葡萄糖傳感器等，在電極中，使用金電極、鉬電極、碳電極等的電極表面上固定化有酶的酶電極。在葡萄糖傳感器中，將通過樣品中的葡萄糖和酶的反應發(fā)生的物質用電化學檢測，定量。作為酶電極的使用例，已知以葡萄糖或乙醇作為底物，利用通過酶處理發(fā)生的電子的生物電池。作為生物電池的例，近年關注體內包埋型的電池，或環(huán)境負荷少的電池等。一般而言，酶由于難以在電極表面直接氧化還原，為了測定活體樣品中的葡萄糖濃度，實現從酶接受電子，向電極供給的作用，電子介質變得必要。電子介質而言，開發(fā)出蛋白質性的電子介質，使用蛋白質性的電子介質的電極而言，已知使用細胞色素C、細胞色素13562及細胞色素C551等的酶電極(專利文獻1)。再者，開發(fā)出將作為蛋白質性的電子介質的睪丸酮叢毛平胞菌(Comamonas testosteroni)來源的喹諾血紅素蛋白乙醇脫氫酶的細胞色素C結構域與吡咯并喹啉醌葡萄糖脫氫酶融合的融合蛋白質(專利文獻2)等。另一方面，開發(fā)出使用洋蔥伯霍爾德桿菌(Burid10Ideria cepacia)來源的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴型葡萄糖脫氫酶的葡萄糖傳感器(專利文獻3及4)，也有關于含該洋蔥伯霍爾德桿菌(Burldiolderia cepacia)來源酶的酶電極及其制備方法的報告(專利文獻5)。專利文獻1所述的細胞色素C及細胞色素1^562均是細胞膜或周質等細胞內存在的電子傳遞蛋白質。此電子傳遞蛋白質，由于在不存在其他電子介質的情況下進行向電極的電子授受之時、相對于葡萄糖氧化還原酶，以摩爾比必要100倍的量，與葡萄糖脫氫酶及葡萄糖氧化酶的親和性極其低。專利文獻2所述的融合蛋白質，在進行葡萄糖測定之時必要1000單位的莫大的量。而且，由該融合蛋白質的葡萄糖測定的可測定的葡萄糖濃度范圍是5mM以下，但這，一般而言，與血糖測定中求出的葡萄糖濃度的上限是20 40mM比較，則極其窄。專利文獻3、4及5所述的傳感器使用包括原本的野生型酶是催化劑活性亞基的α 亞基、作為電子傳遞亞基的β亞基、及Y亞基的3種的亞基的酶，是固定了 α β γ亞基的 3聚體或α β亞基的2聚體的傳感器。該酶，由于作為野生型，有原本與細胞色素C相當的電子傳遞亞基(β亞基)，是可向電極直接電子移動的酶。但是，β亞基是膜結合性細胞色素，由于該酶是洋蔥伯霍爾德桿菌(Burldiolderia cepacia)來源的膜結合性酶，為了得該酶的亞基或該酶，必要可溶化的處理等、煩瑣的處理。而且、進行可溶化處理的物不穩(wěn)定， 進行使干燥的等的處理，則難以維持該酶或其亞基結構。而且，根據日本生物工學會大會 (2002年10月觀天-30天)的發(fā)表，該酶是，將對葡萄糖活性作為100 %之時的對麥芽糖活性及對半乳糖活性中，在洋蔥伯霍爾德桿菌(Burlcholderia cepacia)的各株中，SM4株是 40% 及 105%、JCM5506 株是 43% 及 132%、JCM550 株是 57% 及 123%、JCM2800 株是 83% 及 108%、JCM2801 株是 74%及 117%、IF014595 株是 38%及 104%、IF015124 株是 74%及 148%，底物特異性差，根據演說者的發(fā)表，由于向麥芽糖及半乳糖的作用性高，在自己血糖測定器中使用之時有問題。專利文獻3、4及5中公開了使用FAD依賴型酶及電極的葡萄糖傳感器，其中，酶固定到與電極不同的粉末狀的導體、或者碳粒子。另外，在作為第2電極的對電極使用鉬等， 第2電極不具有氧化還原性。而且在酶的向電極的荷載中不使用高分子。作為其他細胞色素，已知黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)來源的細胞外分泌型細胞色素1^562，已知對于將該細胞色素用酵母生產的重組細胞色素，纖維素或殼多糖有吸附性(非專利文獻1)。但是，不知對于該細胞色素，作為葡萄糖氧化還原酶用介質的功能。再者，由于該重組細胞色素以酵母作為宿主，糖鏈過量地附加而分子量大， 所以每摩爾的固體分多，在有必要用少量的血液溶解試劑的傳感器用試劑中，需求糖鏈附加更少，分子量小的重組蛋白質。發(fā)明要解決的技術課題如上述一樣，專利文獻1、2、3、4及5中記載的電子傳遞蛋白質或融合蛋白質在實用上得不到可稱之為充分量的程度的應答電流值。從而，本發(fā)明的目的是解決上述的課題，提供與酶親和性高的蛋白質性的電子介質及對底物的特異性高的酶和該電子介質的融合體、而且，含它們的組合物、使用它們的底物的測定方法、對底物的傳感器、以及含它們的生物電池等。解決課題的技術方案本發(fā)明人代替以往使用的電子介質，在自然界廣泛探索實用上可得到可稱之為充分量的應答電流值的電子介質的結果，發(fā)現可溶性的細胞外分泌型細胞色素作為葡萄糖氧化還原酶的電子介質，發(fā)揮極其優(yōu)良的性能，從而完成本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及以下的實施方式。[實施方式1]葡萄糖氧化還原酶用電子介質，其包括細胞外分泌型細胞色素。[實施方式2]實施方式1所述的電子介質，其可相對于葡萄糖氧化還原酶的摩爾數，以不足100倍量的摩爾數測定葡萄糖濃度。[實施方式3]實施方式1所述的電子介質，其中細胞外分泌型細胞色素是屬于絲狀菌的菌來源的。[實施方式4]實施方式3所述的電子介質，其中絲狀菌是曲霉屬的菌。[實施方式5]實施方式4所述的電子介質，其中曲霉屬的菌是土曲霉 (Aspergillus terreus)或米曲霉(Aspergillus oryzae)。[實施方式6]葡萄糖氧化還原酶用電子介質，其包括以下的(a)、(b)或(C)的多肽(a)包括SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的多肽、(b)包括SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4的氨基酸序列中，1個或數個的氨基酸被取代、缺失、插入或附加的氨基酸序列，且有電子介質功能的多肽、(c)包括與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列，且有電子介質功能的多肽。[實施方式7]以下的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸(a)編碼包括SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸、(b)編碼包括SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4的氨基酸序列中1個或數個的氨基酸被取代、缺失、插入或附加的氨基酸序列，且有電子介質功能的多肽的多核苷酸、(c)編碼包括與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列，且有電子介質功能的多肽的多核苷酸、(d)編碼含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3所示的堿基序列，且有電子介質功能的多肽的多核苷酸、(e)編碼與含與包括(d)的多核苷酸互補的堿基序列的多核苷酸，在嚴格的條件下雜交，并且有電子介質功能的多肽的多核苷酸、(f)編碼含與包括(d)的多核苷酸有70%以上的同一性的堿基序列，并且有電子介質功能的多肽的多核苷酸。[實施方式8]重組載體，其含實施方式7所述的基因。[實施方式9]轉化體，其由實施方式8所述的重組載體轉化。[實施方式10]實施方式9所述的轉化體，其中宿主是絲狀菌。[實施方式11]有電子介質功能的細胞外分泌型細胞色素的制備方法，其特征在于，將由含編碼細胞外分泌型細胞色素的基因的重組載體轉化的轉化體用營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，并采集細胞外分泌型細胞色素。[實施方式12]細胞外分泌型細胞色素，其由實施方式11所述的制備方法得到。[實施方式13]融合體，其融合了細胞外分泌型細胞色素和葡萄糖氧化還原酶。[實施方式14]實施方式13所述的融合體，其在不存在其他電子介質的情況下，即便葡萄糖的測定范圍是大于5mM的范圍，也能測定。[實施方式15]實施方式13所述的融合體，其中葡萄糖氧化還原酶是葡萄糖脫氫酶。[實施方式16]實施方式13所述的融合體，其中葡萄糖氧化還原酶是葡萄糖氧化酶。[實施方式17]融合體，其是在單一分子內有電子介質功能和底物的氧化功能的兩功能的融合體，其特征在于，在下述(a)、(b)及(C)之中有(a)及(b)、或者有(a)及(b)，并且在(a)和(b)之間有(c)(a)細胞外分泌型細胞色素的氨基酸序列、(b)葡萄糖氧化還原酶的氨基酸序列、(c)將(a)的氨基酸序列和(b)的氨基酸序列結合的接頭序列。[實施方式18]實施方式17所述的融合體，其特征在于，接頭序列是 ⑶CS⑶GGGGSGPEPVPVPDG。[實施方式19]以下的(a)、(b)或(c)的多肽(a)包括 SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO 27 或 SEQ ID NO 29 所示的
氨基酸序列的多肽、(b)包括 SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO 27 或 SEQ ID NO 29 中，1 個
或數個的氨基酸被取代、缺失、插入或附加的氨基酸序列，且有電子介質功能及葡萄糖氧化功能的多肽、(c)包括與 SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID N0:27 或 SEQ ID N0:29 的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列，且有電子介質功能及葡萄糖氧化功能的多肽。[實施方式20]基因，其編碼實施方式13所述的融合體。[實施方式21]重組載體，其含實施方式20所述的基因。[實施方式22]轉化體，其由實施方式21所述的重組載體轉化。[實施方式23]實施方式13所述的融合體的制備方法，其特征在于，將實施方式 22所述的轉化體用營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，并采集融合了細胞外分泌型細胞色素和葡萄糖氧化還原酶的融合體。[實施方式24]葡萄糖測定用組合物，其含下列之任何實施方式1所述的電子介質及葡萄糖氧化還原酶、或者，實施方式13所述的融合體。[實施方式25]生物電池，其含下列之任何實施方式1所述的電子介質及葡萄糖氧化還原酶、或者，實施方式13所述的融合體。[實施方式26]酶活性的測定方法，其使用實施方式1 6之任一項所述的電子介質、或者包括實施方式12所述的細胞外分泌型細胞色素的葡萄糖氧化還原酶用電子介質。[實施方式27]使用細胞外分泌型細胞色素、底物及酶的，測定酶的活性的測定方法，所述方法包括(I)通過上述酶氧化上述底物的步驟、(II)由上述細胞外分泌型細胞色素接受上述步驟I中上述酶內發(fā)生的電子的步驟、(III)檢測由上述步驟II發(fā)生的上述細胞外分泌型細胞色素中的變化的步驟、(IV)將上述步驟III中檢測到的上述細胞外分泌型細胞色素中的每單位時間的變化的量與上述酶的活性關聯的步驟。[實施方式28]使用細胞外分泌型細胞色素、底物、酶及電子受體測定酶的活性的測定方法，所述方法包括(I)通過上述酶氧化上述底物的步驟、(II)由上述細胞外分泌型細胞色素接受上述步驟I中上述酶內發(fā)生的電子的步驟、(III)由上述電子受體接受由上述步驟II發(fā)生的上述細胞外分泌型細胞色素中的電子的步驟、(IV)檢測由上述步驟III發(fā)生的上述電子受體中的變化的步驟、(V)將上述步驟IV中檢測到的上述電子受體中的每單位時間的變化的量與上述酶的活性關聯的步驟。[實施方式29]使用細胞外分泌型細胞色素、酶、及電子受體的，測定對象物的測定方法，所述方法包括(A)由上述酶氧化上述測定對象物的步驟、(B)將上述步驟A中上述酶內發(fā)生的電子由上述細胞外分泌型細胞色素接受的步驟、(C)將由上述步驟B發(fā)生的上述細胞外分泌型細胞色素中的電子由上述電子受體接受的步驟、(D)檢測由上述步驟C發(fā)生的上述電子受體中的變化的步驟、(E)將上述步驟D中檢測到的上述電子受體中的變化的量與上述測定對象物的量或濃度關聯的步驟。[實施方式30]實施方式四所述的測定方法，其中測定中使用的，相對于上述酶的上述細胞外分泌型細胞色素的量小于100倍。[實施方式31]實施方式四所述的測定方法，其中上述細胞外分泌型細胞色素是屬于絲狀菌的菌來源的。[實施方式32]實施方式31所述的測定方法，其中上述絲狀菌是曲霉屬的菌。[實施方式33]實施方式32所述的測定方法，其中上述曲霉屬的菌是土曲霉 (Aspergillus terreus)、或者米曲霉(Aspergillus oryzae)。[實施方式34]實施方式四所述的測定方法，其中上述細胞外分泌型細胞色素是上述實施方式6所述的電子介質。[實施方式35]實施方式四所述的測定方法，其中上述酶是氧化還原酶或脫氫酶。[實施方式36]實施方式四所述的測定方法，其中上述酶是作用于葡萄糖的酶。[實施方式37]實施方式四所述的測定方法，其中上述酶是黃素腺嘌呤二核苷酸依賴型。[實施方式38]實施方式四所述的測定方法，其中上述酶是黃素腺嘌呤二核苷酸依賴型葡萄糖脫氫酶。[實施方式39]實施方式四所述的測定方法，其中上述測定對象物是葡萄糖。[實施方式40]實施方式四所述的測定方法，其中上述電子受體是電極。[實施方式41]實施方式四所述的測定方法，其中上述電子受體是氧化還原化合物。[實施方式42]實施方式四所述的測定方法，其中上述步驟D中的檢測通過電流、 通電電荷量、或者分光學量進行。[實施方式43]實施方式四所述的測定方法，其中上述步驟D中檢測到的變化經一個以上的氧化還原物質的反應得到。[實施方式44]實施方式四所述的測定方法，其中可測定的上述測定對象物的濃度大于5mM。[實施方式45]實施方式四所述的測定方法，其中上述細胞外分泌型細胞色素與上述酶融合。[實施方式46]實施方式45所述的測定方法，其中上述酶是葡萄糖脫氫酶、或者葡萄糖氧化酶。[實施方式47]實施方式45所述的測定方法，其中上述細胞外分泌型細胞色素與上述酶的融合體是實施方式17所述的融合體。[實施方式48]實施方式45所述的測定方法，其中上述細胞外分泌型細胞色素與上述酶的融合體是實施方式19所述的多肽。[實施方式49]使用細胞外分泌型細胞色素、酶、第1電極、及第2電極的，測定對象物的測定方法，所述方法包括(F)由上述酶氧化上述測定對象物的步驟、(G)將上述步驟F中上述酶內發(fā)生的電子由荷載到上述第1電極的上述細胞外分泌型細胞色素接受的步驟、(H)將由上述步驟G發(fā)生的上述細胞外分泌型細胞色素中的電子由上述第1電極接受的步驟、(I)通過上述步驟H檢測流經上述第1電極和上述第2電極之間的電流或通電電荷量的步驟、(J)將上述步驟I中檢測到的電流或通電電荷量與上述測定對象物的量或濃度關聯的步驟。[實施方式50]實施方式49所述的測定方法，其中上述酶荷載到上述第1電極。[實施方式51]實施方式49所述的測定方法，其中上述酶與上述細胞外分泌型細胞色素融合。[實施方式52]實施方式49所述的測定方法，其中上述酶、上述細胞外分泌型細胞色素、或者它們的融合體通過高分子荷載到上述第1電極。[實施方式53]實施方式49所述的測定方法，其中上述步驟H通過向上述第1電極的電位的施加誘發(fā)。
[實施方式54]實施方式53所述的測定方法，其中向上述第1電極的電位的施加對于上述第2電極進行。[實施方式55]實施方式討所述的測定方法，其中上述第2電極是氧化還原性的。[實施方式56]實施方式55所述的測定方法，其中上述第2電極是Ag/AgCl。[實施方式57]實施方式53所述的測定方法，其中還使用氧化還原性的第3電極， 向上述第1電極的電位的施加對于上述第3電極進行。[實施方式58]實施方式57所述的測定方法，其中上述第3電極是Ag/AgCl。[實施方式59]實施方式49所述的測定方法，其中上述步驟F、及上述步驟G并行實施。[實施方式60]實施方式49所述的測定方法，其中向上述第1電極的電位的施加先于上述步驟F進行。[實施方式61]使用細胞外分泌型細胞色素、及酶的，測定對象物的測定方法，所述方法包括(K)由上述酶氧化上述測定對象物的步驟、(L)將上述步驟K中上述酶內發(fā)生的電子由上述細胞外分泌型細胞色素接受的步驟、(M)檢測由上述步驟L發(fā)生的上述細胞外分泌型細胞色素的分光學特性的變化的步驟、(N)將上述步驟M中檢測到的特性變化與上述測定對象物的量或濃度關聯的步
馬聚ο[實施方式62]用于測定測定對象物的濃度或量的電極，其為荷載細胞外分泌型細胞色素及酶的電極。[實施方式63]實施方式62所述的電極，其中上述細胞外分泌型細胞色素及上述酶通過高分子荷載。[實施方式64]實施方式62所述的電極，其中上述細胞外分泌型細胞色素與上述
酶融合。[實施方式65]上述電極含碳、金、鉬、或者鈀之任何的，實施方式62所述的電極， 其中。[實施方式66]用于進行樣品液中含的測定對象物的測定的傳感器，上述傳感器至少包括(i)絕緣性的第1基板、(ii)上述第1基板上配置的第1及第2電極、(iii)上述第1電極上配置的試劑層、(iv)與上述第1電極或上述試劑層、及上述第2電極接觸的樣品液保持部上述試劑層含細胞外分泌型細胞色素，上述試劑層或上述樣品液保持部之任何配置有酶。[實施方式67]實施方式66所述的傳感器，其中上述第1及第2電極之任何含碳、 金、鉬、或者鈀之任何。[實施方式68]實施方式66所述的傳感器，其中上述第2電極是氧化還原性的電極。
[實施方式69]實施方式68所述的傳感器，其中上述第2電極是Ag/AgCl。[實施方式70]實施方式66所述的傳感器，其中上述試劑層僅配置在上述第1電極上。[實施方式71]實施方式66所述的傳感器，其中上述細胞外分泌型細胞色素與上述酶融合。[實施方式72]實施方式66所述的傳感器，其中測定中使用的，相對于上述酶的上述細胞外分泌型細胞色素的量小于100倍。[實施方式73]實施方式66所述的傳感器，其中上述細胞外分泌型細胞色素是屬于絲狀菌的菌、曲霉屬的菌、土曲霉(Aspergillus terreus)、或者米曲霉(Aspergillus oryzae)之任何來源的。[實施方式74]實施方式66所述的傳感器，其中上述細胞外分泌型細胞色素是上述實施方式6所述的電子介質。[實施方式75]實施方式71所述的傳感器，其中上述細胞外分泌型細胞色素與上述酶的融合體是實施方式17所述的融合體。[實施方式76]實施方式71所述的傳感器，其中上述細胞外分泌型細胞色素與上述酶的融合體是實施方式19所述的多肽。[實施方式77]實施方式66所述的傳感器，其中上述酶是氧化還原酶或脫氫酶。[實施方式78]實施方式66所述的傳感器，其中上述酶是作用于葡萄糖的酶。[實施方式79]實施方式66所述的傳感器，其中上述酶是黃素腺嘌呤二核苷酸依賴型。[實施方式80]實施方式66所述的傳感器，其中上述酶是黃素腺嘌呤二核苷酸依賴型葡萄糖脫氫酶。[實施方式81]實施方式66所述的傳感器，其中上述測定對象物是葡萄糖。[實施方式82]實施方式66所述的傳感器，其還包括(ν)有切口部的第2基板，上述第2基板形成上述樣品液保持部的至少一部分。[實施方式83]實施方式82所述的傳感器，其中上述切口部的形狀是矩形、或者U字型。[實施方式84]實施方式82所述的傳感器，其還包括(vi)第3基板，上述第3基板形成上述樣品液保持部的至少一部分。[實施方式85]實施方式66所述的傳感器，其中可測定的上述測定對象物的濃度大于5mMo發(fā)明效果
通過將本發(fā)明的可溶性細胞外分泌型細胞色素用作葡萄糖氧化還原酶用， 得到與酶親和性高的電子介質，向電極的直接的電子傳遞變得可能。再者，細胞外分泌型細胞色素由于是可溶性蛋白質，有容易回收，并且純化途中不發(fā)生不溶化，穩(wěn)定性高的等、作為以往的葡萄糖氧化還原酶用電子介質已知的膜結合性細胞色素中沒有的優(yōu)良的性質。而且、細胞外分泌型細胞色素由于對葡萄糖氧化還原酶的親和性高，使得抑制作為電子介質在葡萄糖測定中使用時的該細胞色素使用量變得可能。
圖1是示由本發(fā)明的使用細胞外分泌型細胞色素的酶電極的，對葡萄糖的應答電流值測定的結果的坐標圖。圖2是示由本發(fā)明的使用細胞外分泌型細胞色素的酶電極的，對葡萄糖的應答電流值測定的結果的坐標圖。圖3是示對本發(fā)明的融合體，對細胞色素C的電子提供能的測定的結果的坐標圖。上部曲線示AoCytb-AtGLD，下部曲線示AtGLD。圖4是示是本發(fā)明之一實施方式的傳感器的概略的分解斜視圖。圖5是示測定系統的概略構成的斜視圖。圖6是示測定系統的概略構成的阻斷圖。圖7使用是本發(fā)明之一實施方式的傳感器之時的，示葡萄糖濃度與應答電流的關系的坐標圖。實施方式本發(fā)明以將細胞外分泌型細胞色素作為葡萄糖氧化還原酶等的酶用電子介質使用為特征。本次、本發(fā)明人等發(fā)現，細胞外分泌型細胞色素作為葡萄糖氧化還原酶用的電子介質發(fā)揮極其優(yōu)良的功能。本發(fā)明的細胞外分泌型細胞色素由于是生物生產的蛋白質性的天然物質而在安全性中也優(yōu)良。本發(fā)明中涉及的葡萄糖氧化還原酶是催化葡萄糖和電子受體的氧化還原反應的酶。該葡萄糖氧化還原酶是葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶即可，優(yōu)選是以對葡萄糖的作用性作為100%之時，對麥芽糖及半乳糖的各自的作用性至多是10%的葡萄糖氧化還原酶， 更優(yōu)選是以對葡萄糖的作用性作為100%之時，對麥芽糖及半乳糖的各自的作用性至多是 8 %的葡萄糖氧化還原酶，再優(yōu)選是各自的作用性至多是5 %的葡萄糖氧化還原酶。作為可使用的該葡萄糖氧化還原酶的例而言，有以黃素腺嘌呤二核苷酸作為輔酶的葡萄糖氧化酶、以煙堿腺嘌呤二核苷酸作為輔酶的葡萄糖脫氫酶或以黃素腺嘌呤二核苷酸作為輔酶的 (黃素腺嘌呤二核苷酸依賴型)葡萄糖脫氫酶。以黃素腺嘌呤二核苷酸作為輔酶的葡萄糖脫氫酶的情況中，如果以對葡萄糖的作用性作為100%之時，對麥芽糖及半乳糖的各自的作用性是10%以下，則無關于其種類及來源等的特別限制，國際公開第2004/058958號、國際公開第2006/101239號及國際公開第 2008/001903號的各單行本中記載的曲霉屬、青霉屬或靈芝屬等的屬于絲狀菌的菌來源的葡萄糖脫氫酶、或者 Proc. Natl. Acad. ki. USA Vol. 80，pp. 6286-6288 (1983)中記載的果蠅屬來源的葡萄糖脫氫酶是優(yōu)選的，更優(yōu)選為國際公開第2004/058958號單行本中記載的土曲霉(Aspergillus terreus)FERM BP-08578 株或國際公開第 2008/001903 號單行本中記載的米曲霉(Aspergillus oryzae)株的各種各樣的菌株(除RIB40)來源的葡萄糖脫氫酶。這樣的屬于絲狀菌的菌來源的以黃素腺嘌呤二核苷酸作為輔酶的葡萄糖脫氫酶共有催化氧化葡萄糖的1位的羥基的反應的物理化學性質、及對麥芽糖或半乳糖的作用性低的等的性質，有同樣的酶活性。再者，作為以黃素腺嘌呤二核苷酸作為輔酶的葡萄糖脫氫酶，可使用例如，通過氨基酸序列之一部分的基因工程學的改變，如對野生型葡萄糖脫氫酶的木糖作用性/葡萄糖作用性的降低、及在低溫域的作用性升高或穩(wěn)定性等的諸性質改良的各種的改變型葡萄糖脫氫酶。上述的氨基酸序列之一部分的基因工程學的改變的例而言，可舉土曲霉 (Aspergillus terreus)FERM BP-08578株來源的葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列中，選自 D72A、G73D、G73A、G73S、G73C、G73Q、G73W、G73Y、G73E、G73H、R102H、Y228H、V356A、及 P527L
的氨基酸取代。本發(fā)明中使用的葡萄糖氧化還原酶，可例如，基于上述中引用的各專利文獻的公開，用本領域技術人員公知之任意的方法容易地制備-取得。再有，在本發(fā)明的葡萄糖氧化還原酶也包括，在N末端含信號序列或其一部分的，及，信號序列從N末端切斷的。本發(fā)明的細胞外分泌型細胞色素是含有血紅素鐵的血紅素蛋白之一種。細胞外分泌型細胞色素是指，野生株向細胞外作為可溶性蛋白質分泌生產的細胞色素，具體而言，是構成該細胞色素的氨基酸序列的N末端有信號序列的細胞色素。該細胞色素只要是向細胞外分泌的細胞色素就不特別限定，但細胞色素b是優(yōu)選的，特別是細胞色素1^562是優(yōu)選的。 也包括通過合并了編碼該細胞色素的基因的革蘭氏陰性菌生產或通過編碼該細胞色素的基因內合并了除去信號序列部分的基因的重組體在細胞內生產的蛋白質。再有，在本發(fā)明的細胞外分泌型細胞色素中也包括，N末端含信號序列或其一部分的，及，信號序列從N末端切斷的。作為上述的電子介質有用的細胞外分泌型細胞色素的例而言，可舉屬于絲狀菌的菌來源的細胞外分泌型細胞色素。只要是細胞外分泌型細胞色素，就無關于來源的特別限制，但可使用非專利文獻1的表3中公開的作為白色腐朽菌的平革菌屬、稻溫病菌屬或赤霉屬的菌來源的細胞外分泌型細胞色素。再者，可使用非專利文獻1的表3所述的由作為細胞外細胞色素基因的登錄號No.AB193288、XM_382527或XM_369170的多核苷酸編碼(包括登錄號No. BAD95668. 1、XP_382527或XP_369170的多肽)的細胞外分泌型細胞色素、或者非專利文獻1的表3所述的位于CDH(纖維二糖脫氫酶)的N末端的電子傳遞血紅素含有結構域。細胞外分泌型細胞色素優(yōu)選是屬于真菌的菌來源的細胞外分泌型細胞色素，更優(yōu)選是曲霉屬的菌來源的細胞外分泌型細胞色素，特別優(yōu)選是土曲霉(Aspergillus terreus) 或米曲霉(Aspergillus oryzae)來源的細胞外分泌型細胞色素。再者，作為構成本發(fā)明的葡萄糖氧化還原酶用電子介質的多肽，可舉以下的多肽(a)包括SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的多肽、(b)包括SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4的氨基酸序列中，1個或數個的氨基酸被取代、缺失、插入、附加的氨基酸序列，且有電子介質功能的多肽、或者(c)包括與SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4的氨基酸序列有70%以上、優(yōu)選為75% 以上、更優(yōu)選為80%以上、再優(yōu)選為90%以上、特別優(yōu)選為95%以上的同一性的氨基酸序列，且有電子介質功能的多肽。其中，包括SEQ ID NO :2及SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的多肽是各自、土曲霉(Aspergillus terreus)及米曲霉(Aspergillus oryzae)的菌株來源的細胞外分泌型細胞色素。本發(fā)明的多核苷酸，可舉以下的多核苷酸(a)編碼包括SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸、
(b)編碼包括SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4的氨基酸序列中，1個或數個的氨基酸被取代、缺失、插入、附加的氨基酸序列，且有電子介質功能的多肽的多核苷酸、(c)編碼包括與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列，且有電子介質功能的多肽的多核苷酸、(d)編碼含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3所示的堿基序列，且有電子介質功能的多肽的多核苷酸、(e)編碼與含與包括堿基序列(d)的多核苷酸互補的堿基序列的多核苷酸在嚴格的條件下雜交，并且，有電子介質功能的多肽的多核苷酸、或者(f)編碼含與包括堿基序列(d)的多核苷酸有70%以上、優(yōu)選為75%以上、更優(yōu)選為80%以上、再優(yōu)選為90%以上、特別優(yōu)選為95%以上的同一性的堿基序列，并且有電子介質功能的多肽的多核苷酸。再者本發(fā)明的多核苷酸是含內含子的序列也可。而且，編碼上述多肽的信號肽部分的多核苷酸，根據使用的宿主載體系統，是被各自適宜的取代或除去一部分或全部的多核苷酸也可。本發(fā)明中“電子介質”是指有從電子供體接受電子的功能及/或向電子受體供給電子的功能的物質，是例如，從葡萄糖氧化還原酶接受電子，將電子向電極或其他電子介質提供的物質。從而，有與由含包括SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的多肽的蛋白質構成的細胞外分泌型細胞色素實質上同程度的“電子介質”功能的多肽也可作為葡萄糖氧化還原酶用電子介質使用。本發(fā)明中，氨基酸序列或堿基序列中的同一性是指經成為比較對象的基準序列的全長，有指定的同一性的各序列。這樣的序列的同一性百分率可以基準序列作為查詢序列，使用具有比較的算法的公開或市售的軟件來計算。例如，可使用BLAST、FASTA、或者 GENEITX (軟件開發(fā)株式會社制)等，這些可以默認參數使用。本發(fā)明中，在多核苷酸間的雜交中，“在嚴格的條件下雜交”的具體性的條件可例示，例如，以50%甲酰胺、5XSSC(150mM氯化鈉、15mM檸檬酸三鈉、IOmM磷酸鈉、ImM乙二胺四醋酸、ρΗ7· 2)、5Χ登哈特(Denhardt' s)溶液、0. 1% SDS、10%葡聚糖硫酸及100 μ g/mL 的變性鮭魚精子DNA溫育42°C之后，將濾器在0. 2XSSC中，于42°C清洗。再有，本發(fā)明中，“多核苷酸”是指，嘌呤或嘧啶向糖β-N-糖苷鍵合的核苷的磷酸酯(ATP (腺苷三磷酸)、GTP (鳥苷三磷酸)、CTP (胞苷三磷酸)、UTP (尿苷三磷酸)；或者 dATP (脫氧腺苷三磷酸)、dGTP (脫氧鳥苷三磷酸)、dCTP (脫氧胞苷三磷酸)、dTTP (脫氧胸腺嘧啶三磷酸))結合100個以上的分子，具體而言，包括編碼葡萄糖氧化還原酶的染色體 DNA、由染色體DNA轉錄的mRNA、由mRNA合成的cDNA及，以它們作為模板而PCR擴增的多核苷酸?！肮押塑账帷笔侵负塑账徇B結2 99個的分子?！岸嚯摹笔侵赣山涻０锋I合(肽鍵合)或非天然的殘基連結互相鍵合的30個以上的氨基酸殘酯構成的分子，而且，也包括向這些附加糖鏈的，或人工進行化學修飾的等。本發(fā)明的細胞外分泌型細胞色素(多肽)及編碼其的多核苷酸可用本領域技術人員公知之任意的方法容易地制備-取得。例如，曲霉屬、平革菌屬、稻溫病菌屬或赤霉屬等的絲狀菌來源的細胞外分泌型細胞色素及編碼其的多核苷酸可根據本說明書的實施例所述的基因工程學方法制備。作為多核苷酸的取得方法，例如，通過以土曲霉(Aspergillus terreus)NIH2624 或米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40 的 cDNA 庫作為模板，使用 SEQID NO :5及6的引物組或SEQ ID NO :7及8的引物組的PCR法，或者通過以從土曲霉 (Aspergi 1 Ius terreus) NIH2624 ^^ ffi # (Aspergi 1 Ius oryzae) RIB40 ￠( ^ ^ RNA 或mRNA作為模板的RT-PCR法，通過任何的方法都可得到目的細胞外分泌型細胞色素基因。再者，從非專利文獻1的表3所述的作為細胞外細胞色素基因的登錄號NO.AB193288、 XM_382527或XM_369170的已知序列、或者非專利文獻1的表3所述的編碼位于⑶H(纖維二糖脫氫酶)的N末端的電子傳遞血紅素含有結構域的已知序列，制成包括正義鏈及反義鏈的1對的引物組，根據與上述方法同樣的方法可得到編碼目的細胞外分泌型細胞色素的多核苷酸。而且，可取得以下的編碼細胞外分泌型細胞色素的多核苷酸。即，構成細胞外分泌型細胞色素的多肽在氨基酸序列的N末端含信號序列，從N末端的Met第54 第110之任何的位置含作為血紅素配體的“Gly-Xaa-Met” (Xaa是任意的氨基酸)，并且從該序列的Met夾9個氨基酸含ftx)。再者，從N末端的Met第101 第160任何的位置含 "Asn-Xaa-Thr" (Xaa是任意的氨基酸)，并且，從該序列的Thr夾7個氨基酸含作為S-S結合結構域的“Cys-Xaa-Xaa-Cys” (Xaa是任意的氨基酸)。而且、從N末端序列的Met的第 158 第214位置含作為血紅素配體的“His”。編碼該多肽的多核苷酸，從已知序列，制成包括正義鏈及反義鏈的1對的引物組，根據與上述方法同樣的方法，可得到編碼目的細胞外分泌型細胞色素的多核苷酸。再有，在設計引物之時，引物的尺寸(堿基數)是考慮滿足與模板DNA之間的特異性的退火，15 60個堿基、優(yōu)選是20 50個堿基。使包括正義鏈(5’末端側)和反義鏈 (3’末端側)之一組或一對0條)的引物不互相退火，避免兩引物間的互補的序列。再者， 為了確保與模板DNA的穩(wěn)定的結合，使GC含量是約50%左右，引物內富含GC或富含AT不偏在是優(yōu)選的。由于退火溫度依賴于Tm值(解鏈溫度)，為了得特異性高的PCR產物，選定Tm值是55-65°C而互相近似的引物。而且，有必要留意使PCR中的引物使用的最終濃度成為約0. 1 約IyM而制備的等。在引物設計中，可使用引物設計用的市售的軟件、例如 OligoTM[National Bioscience Inc.(美國)制]、GENETYX (軟件開發(fā)社制)等。再有，上述的寡核苷酸引物組也可為例如將上述cDNA用適當的限制酶切斷而制成的，或者可根據如文獻(例如 Carruthers (198 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47 :411-418 ；Adams (1983)J. Am. Chem. Soc. 105 :661 ；Belousov(1997)Nucleic Acid Res. 25 :3440-3444 ；Frenkel(1995)Free Radic. Biol. Med. 19:373-380 ；Blommers(1994) Biochemistry 33 :7886-7896 ；Narang(1979)Meth. Enzymol. 68 :90 ；Brown (1979)Meth. Enzymo 1. 68 :109 ；Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22 :1859 ；美國專利第 4，458，066 號)中記載的周知的化學合成技術體外合成。本發(fā)明的重組載體是克隆載體或表達載體，根據作為插入子的多核苷酸的種類， 或其使用目的等而使用適宜必要的載體。本發(fā)明的轉化細胞(轉化體)，例如，在大量制備細胞外分泌型細胞色素或其類似蛋白質之時，可使用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等的原核細胞，或酵母、真菌、絲狀菌、昆蟲細胞或哺乳動物細胞等的真核細胞等，可根據糖鏈的需要、不需要或其他肽修飾的必要性來適宜選擇。轉化細胞不特別限定，但絲狀菌是優(yōu)選的，再者曲霉屬是優(yōu)選的，特別是米曲霉 (Aspergillus oryzae)是優(yōu)選的。這些的轉化細胞可通過根據電穿孔法、磷酸鈣法、脂質體法、DEAE葡聚糖法等公知的方法將重組載體導入細胞來制備。作為重組載體及轉化細胞的
17具體例，可舉下述實施例所示的重組載體和重組真菌。細胞外分泌型細胞色素可根據使用上述的細胞外分泌型細胞色素多核苷酸的重組DNA技術取得。例如通過從有上述的多核苷酸的載體體外轉錄來制備RNA，通過將其作為模板而進行體外翻譯，可在體外制成細胞外分泌型細胞色素。再者，根據使用非專利文獻1 的表3所述的作為細胞外細胞色素基因的登錄號No. AB193288、XM_382527或XM_369170的多核苷酸、或者非專利文獻1的表3所述的編碼位于CDH(纖維二糖脫氫酶)的N末端的電子傳遞血紅素含有結構域的多核苷酸的DNA技術，也可同樣地取得。在將細胞外分泌型細胞色素體外表達而生產之時，將上述的多核苷酸插入有可結合RNA聚合酶的啟動子的載體中而制成重組載體，將此載體添加到含對應于啟動子的RNA聚合酶的兔網狀紅細胞溶解物或小麥胚芽提取物等的體外翻譯系統，則可在體外生產細胞外分泌型細胞色素?？山Y合RNA 聚合酶的啟動子而言，可例示T3、T7、SP6等。含這些的啟動子的載體而言，可例示pKAl、 pCDM8、pT3/T718、pT7/319、pBluescriptll 等。在將細胞外分泌型細胞色素用大腸桿菌等的微生物表達DNA而生產之時，在微生物中，制成在有復制可能的原點、啟動子、核糖體結合部位、DNA克隆部位及終止子序列等的表達載體中重組上述的多核苷酸的表達載體，用此表達載體轉化宿主細胞之后，將得的轉化體在適當的培養(yǎng)基(例如，營養(yǎng)培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，則可在微生物內大量生產細胞外分泌型細胞色素。此時、在任意的翻譯區(qū)域之前后，附加起始密碼子和終止密碼子而表達，則可得含任意的區(qū)域的細胞外分泌型細胞色素片段?；蛘撸勺鳛榕c其他蛋白質的融合蛋白質表達。通過將此融合蛋白質用適當的蛋白酶切斷，也可取得目的細胞外分泌型細胞色素。大腸桿菌用表達載體而言，可例示PUC系統、pBluescriptll、pET表達系統、pGEX表達系統或 pCold表達系統等。在將細胞外分泌型細胞色素在真核細胞中表達生產之時，將上述多核苷酸插入有啟動子、剪接區(qū)域及聚(A)附加部位等的真核細胞用表達載體而制成重組載體，導入真核細胞內而制備轉化體，將此轉化體在適當的培養(yǎng)基(例如，營養(yǎng)培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，則可在真核細胞中生產細胞外分泌型細胞色素。再者，使用非專利文獻1的表3所述的作為細胞外細胞色素基因的登錄號No. AB193288、XM_382527或XM_369170的多核苷酸、或者非專利文獻1的表3所述的編碼位于CDH(纖維二糖脫氫酶)的N末端的電子傳遞血紅素含有結構域的多核苷酸，同樣地可在真核細胞中生產細胞外分泌型細胞色素。重組載體可在如質粒一樣的狀態(tài)下在細胞內維持，整合到染色體中而維持也可。表達載體而言，可例示PKA1、 pCDM8、pSVK3、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV 載體、pRS、pYE82 或 pUSA 等。將 ρIND/V5_Hi s、 pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl或pEGFP-Cl等作為表達載體使用，則作為附加His標簽、FLAG標簽或GFP等各種標簽的融合蛋白質表達細胞外分泌型細胞色素多肽也可。真核細胞而言，一般使用猴腎臟細胞C0S-7、中國倉鼠卵巢細胞CHO等的哺乳動物培養(yǎng)細胞、出芽酵母、分裂酵母、真菌、絲狀菌、蠶細胞、非洲爪蟾卵細胞等，只要是可表達細胞外分泌型細胞色素，就何種真核細胞都可，特別優(yōu)選為可生產血紅素b的細胞。在不具有血紅素b生產能的細胞的情況中，與生產上述細胞外分泌型細胞色素之時同樣地，將血紅素b的生產中必要的基因導入細胞內即可。特別是，曲霉屬的菌是優(yōu)選的，米曲霉(Aspergillus oryzae)是最優(yōu)選的。將表達載體導入真核細胞中，可使用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質體法、DEAE葡聚糖法等公知的方法。
將細胞外分泌型細胞色素用原核細胞或真核細胞表達之后，為了從培養(yǎng)物(含菌體、或者菌體外分泌的酶的培養(yǎng)液、培養(yǎng)基組合物等)單離純化目的蛋白質，可組合進行公知的分離操作。例如，可舉由尿素等的變性劑或表面活性劑的處理、熱處理、PH處理、超聲波處理、酶消化、鹽析或溶劑沉淀法、透析、離心分離、超濾、凝膠過濾、SDS-PAGE、等電點電泳、 離子交換層析、疏水性層析、逆相層析、親和一層析(也包括利用標簽序列的方法及使用對 MCl特異性的多克隆抗體、單克隆抗體的方法)等。細胞外分泌型細胞色素可基于例如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4的氨基酸序列或其類似序列，根據公知的肽合成法(Merrifield，R. B. J. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154,1963 ；Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W. C.及 White, P.D., Oxford University Press, 2000)制成。再者，這些的肽是天然的酰胺鍵合以外的殘基連結而成的也可。天然的酰胺鍵合以外的殘基連結，可例示例如戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、雙官能馬來酰亞胺、N，N’_ 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、或者N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)等的化學結合或偶聯設施?？沙蔀殡逆I合的代替的連結基包括例如酮基亞甲基(例如，對于-C (= 0) -CH2-的-C ( = 0) -NH-)、氨基亞甲基(CH2-NH)、亞乙基、烯烴(CH = CH)、醚(CH2-0)、 硫代醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、逆酰胺、硫代酰胺、或者酯(參照例如，Spat0la(1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides 及 Proteins, Vol. 7, pp 267-357,"Peptide Backbone Modifications, "Marcell Dekker，NY)。作為根據如上所述的方法制成的本發(fā)明的細胞外分泌型細胞色素的代表的特性可舉(1)共有從葡萄糖氧化還原酶接受電子的功能及/或向電子受體供給電子的功能。(2)分子量約30kDa (是將由導入SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3所示的多核苷酸的絲狀菌的重組細胞外分泌型細胞色素供給到聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)之時的亞
基分子量。)再有，對于上述分子量而言，由于本酶原來就附加有糖鏈，由培養(yǎng)條件或純化條件而糖鏈的附帶方式變化，則分子量不同，根據轉化細胞或載體系統的種類等，糖鏈或附加的氨基酸也變化而分子量變得不同。再者根據導入的多核苷酸的種類而氨基酸序列長或糖鏈的附帶方式變化，則分子量不同。(3)呈紅色。(4)以還原型在427nm、531nm及562nm處有特征的吸收光譜。(5)是細胞色素1^562。(6)是可溶性蛋白質。再者，本發(fā)明的包括細胞外分泌型細胞色素的電子介質與葡萄糖氧化還原酶的親和性高，相對于葡萄糖氧化還原酶的摩爾數，優(yōu)選為不足100倍量、更優(yōu)選為不足50倍量、再優(yōu)選為不足20倍量、特別優(yōu)選為以不足10倍量的摩爾數使用可能的電子介質。本發(fā)明再提供人工融合了上述的細胞外分泌型細胞色素和上述的葡萄糖氧化還原酶的融合體。融合體是在單一分子內有電子介質功能和葡萄糖氧化功能的兩功能的融合體，可舉下述(a)、(b)及(c)之中，氨基酸序列的N末端側有(a)及C末端側有(b)為特征的融合體、N末端側有(a)及C末端側有(b)，并且在(a)和(b)之間有(c)為特征的融合體、氨基酸序列的C末端側有(a)及N末端側有(b)為特征的融合體、或者C末端側有(a) 及N末端側有(b)，并且在(a)和(b)之間有(c)為特征的融合體(a)細胞外分泌型細胞色素的氨基酸序列；(b)葡萄糖氧化還原酶的氨基酸序列；及，(c)將(a)的氨基酸序列和(b)的氨基酸序列結合的接頭序列。再有，細胞外分泌型細胞色素的氨基酸序列只要是構成有電子介質功能的多肽的氨基酸序列，是例如，融合體多肽的N末端側有該多肽時，適宜削除多肽的C末端側的氨基酸序列部分(例如，數個 數十個的氨基酸)的氨基酸序列也可。再者，在融合體多肽的C 末端側有細胞外分泌型細胞色素的氨基酸序列時，可使用從該細胞外分泌型細胞色素的全氨基酸序列適宜削除含信號序列之一部分或全部的氨基酸序列部分的序列。另一方面，葡萄糖氧化還原酶的氨基酸序列只要是構成有葡萄糖氧化功能的多肽的氨基酸序列，則是適宜削除多肽的N末端側的氨基酸序列部分(例如，數個 數十個的氨基酸)的氨基酸序列也可。特別是，在融合體多肽的C末端側有葡萄糖氧化還原酶的氨基酸序列時，可使用從該葡萄糖氧化還原酶的全氨基酸序列適宜削除含信號序列之一部分或全部的氨基酸序列部分的序列。信號序列部分，可使用例如SignalP來預測。作為構成本發(fā)明的融合體的多肽，可舉以下的多肽(a)包括 SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO 27 或 SEQ ID NO 29 所示的
氨基酸序列的多肽、(b)含包括 SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO 27 或 SEQ ID NO 29 所示的氨基酸序列的多肽中，1個或數個的氨基酸被取代、缺失、插入、附加的氨基酸序列，且有電子介質功能的多肽、或者(c)含與包括 SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO 27 或 SEQ ID NO 29 所示的氨基酸序列的多肽有70%以上、優(yōu)選為75%以上、更優(yōu)選為80%以上、再優(yōu)選為90% 以上、特別優(yōu)選為95%以上的同一性的氨基酸序列，且有電子介質功能的多肽。其中，包括 SEQ ID NO 23, SEQ ID NO :25、SEQ ID NO 27 或 SEQ ID NO 29 所示的氨基酸序列的多肽是融合了細胞外分泌型細胞色素及葡萄糖脫氫酶的多肽，包括SEQ ID N0:25及SEQ ID NO 四所示的氨基酸序列的多肽在細胞外分泌型細胞色素和葡萄糖脫氫酶之間含肽接頭。將有編碼上述的細胞外分泌型細胞色素的堿基序列的基因和有編碼上述的葡萄糖氧化還原酶的堿基序列的基因根據通常的基因操作方法連結，作為單一的基因，構建編碼將有細胞外分泌型細胞色素的電子介質功能及有葡萄糖氧化還原酶的葡萄糖氧化功能在相同分子內具有的融合體的融合體基因。有編碼細胞外分泌型細胞色素的堿基序列的基因，可使用例如段落編號00 所示的多核苷酸，再者，也可使用根據段落編號0031所述的方法取得的多核苷酸。該多核苷酸，可使用全長，或者只要是編碼有電子介質功能的多肽的多核苷酸，則是適宜削除編碼多肽的C末端側或N末端側的氨基酸部分的堿基序列的多核苷酸也可。有編碼葡萄糖氧化還原酶的堿基序列的基因是，例如編碼段落編號0019所述的葡萄糖氧化還原酶的堿基序列，可使用本領域技術人員公知的基因。例如，編碼葡萄糖氧化酶的序列可從黑曲霉(Aspergillus niger)用通常的方法取得，編碼以煙堿腺嘌呤二核苷
20酸作為輔酶的葡萄糖脫氫酶的序列可從巨大芽胞桿菌(Bacillus megatherium)用通常的方法取得，或者編碼以黃素腺嘌呤二核苷酸作為輔酶的葡萄糖脫氫酶的序列可從如土曲霉 (Aspergillus terreus) ^7^:(Aspergillus oryzae) ( ^ RIB40 ^) —#的曲#M、# 霉屬或果蠅屬用通常的方法取得。包括該基因的多核苷酸只要是編碼有葡萄糖氧化功能的多肽的多核苷酸，則可使用削除編碼含多肽的N末端側的信號序列部分之一部分或全部的氨基酸序列的堿基序列的多核苷酸。信號序列部分可使用例如SignalP來預測?？蓪⒂芯幋a細胞外分泌型細胞色素的堿基序列的基因和有編碼葡萄糖氧化還原酶的堿基序列的基因根據通常的基因操作方法連結，關于基因的連結無特別限制，例如2 個基因之間插入編碼接頭序列的堿基序列而連結也可。接頭序列是通常的接頭序列即可， 可舉例如土曲霉(Aspergillus terreus)來源的纖維二糖脫氫酶的接頭序列。具體而言， 可例示氨基酸序列包括⑶CS⑶GGGGSGPEPVPVPDG的接頭序列，可經編碼該氨基酸序列的堿基序列將2個基因連結。本發(fā)明的融合體，可使用上述融合體基因，或者通過肽合成法，與例如段落編號 0033 0039所述的細胞外分泌型細胞色素的制備方法同樣的方法來制備。根據該制備方法制備的本發(fā)明的融合體，在細胞外分泌型細胞色素有特征的吸收光譜，有從葡萄糖氧化還原酶接受電子的功能及/或向電子受體供給電子的功能以及葡萄糖氧化還原酶活性。再者，本發(fā)明的融合體由于電子傳遞能優(yōu)良，有在1次的測定系統中， 以葡萄糖氧化還原酶活性值，可以優(yōu)選為0. 05 400單位、更優(yōu)選為0. 1 200單位、再優(yōu)選為0. 2 100單位的少的使用量顯著測定測定對象物的特長。再者本發(fā)明涉及包括上述的包括細胞外分泌型細胞色素的電子介質及葡萄糖氧化還原酶、或者融合體的葡萄糖測定用組合物。該組合物可取液狀、冷凍狀、或者由冷凍干燥等的固體狀等之任意的形態(tài)。在該組合物中的包括細胞外分泌型細胞色素的電子介質及葡萄糖氧化還原酶的含有量可根據目的或形態(tài)等由本領域技術人員適宜選擇，通常、各自是0. 01 1，000 μ g/mL及0. 01 1，000 μ g/mL左右。在該組合物中的包括細胞外分泌型細胞色素的電子介質和葡萄糖氧化還原酶的比率，相對于葡萄糖氧化還原酶的摩爾數，電子介質的摩爾數優(yōu)選是不足100倍量、更優(yōu)選為不足50倍量、再優(yōu)選為不足20倍量、特別優(yōu)選是不足10倍量。另一方面，在該組合物中的融合體的含有量可根據目的或形態(tài)等由本領域技術人員適宜選擇，通常是0. 01 1，000 μ g/mL。關于融合體的含有量無特別限制，1 次的測定系統中使用的量，以葡萄糖氧化還原酶活性值，0. 05 400單位是優(yōu)選的，更優(yōu)選為0. 1 200單位、再優(yōu)選是0. 2 100單位。再者，本發(fā)明的融合體是，在不存在鐵氰化鉀等的其他電子介質的情況下，即便作為底物的葡萄糖的測定范圍是大于5mM或IOmM的范圍，也可測定的融合體。在該組合物中，可使適宜含有選自牛血清白蛋白(BSA)或卵白白蛋白、與葡萄糖氧化還原酶無作用性的糖類或糖醇類、含羧基的化合物、堿土金屬化合物、銨鹽、硫酸鹽或蛋白質等的熱穩(wěn)定化劑、或者緩沖劑等的本領域技術人員公知的其他任意成分，從而可穩(wěn)定化該電子介質及葡萄糖氧化還原酶或融合體。本發(fā)明涉及向上述的電子介質或融合體的酶電極的使用。酶電極可通過本領域技術人員公知之任意的方法，將上述的電子介質及葡萄糖脫氫酶等的葡萄糖氧化還原酶或上述的融合體固定到表面上而容易地制備。該酶電極可在葡萄糖傳感器等的生物傳感器及生物電池等的廣范圍的用途中使
使用含本發(fā)明的電子介質或融合體的酶電極的葡萄糖傳感器是測定樣品液中的葡萄糖濃度的傳感器。涉及的葡萄糖傳感器可通過本領域技術人員公知的，任意的方法制備。例如，通過在適當的絕緣性基板上利用絲網印刷等的方法形成包括作用極、其對電極及參照極的電極系統，在此電極系統上形成含上述的電子介質及葡萄糖氧化還原酶或上述的融合體的酶反應層來制備。向此生物傳感器的酶反應層上滴下含底物的樣品液，則酶反應層溶解而酶與底物反應，伴隨此而電子介質被還原。酶反應結束后，將還原的電子介質電化學地氧化，此時，此生物傳感器，可從得到的氧化電流值測定樣品液中的底物濃度。此外，也可構建檢測發(fā)色強度或PH變化等的方式的生物傳感器。再者，本發(fā)明涉及含上述的電子介質及葡萄糖氧化還原酶、或者融合體的生物電池。本發(fā)明的生物電池由進行氧化反應的陽極及進行還原反應的陰極構成，根據需要含隔離陽極和陰極的電解質層而構成。將含上述的電子介質及葡萄糖氧化還原酶或上述的融合體的酶電極用于陽極電極，通過將氧化底物發(fā)生的電子向電極提供的同時，發(fā)生質子。另一方面，在陰極側，一般而言，使用陰極電極中使用的酶即可，通過使用例如漆酶、抗壞血酸氧化酶或膽紅素氧化酶，使在陽極側發(fā)生的質子與氧反應而生成水。電極而言，可使用碳、金、 鉬等、一般而言在生物電池中使用的電極。再者，本發(fā)明涉及使用上述的電子介質的酶的活性測定。在酶的活性測定中，可使用酶、底物及本發(fā)明的電子介質，通過例如吸光度或吸光光譜等的分光學特性的檢測知該電子介質的電子接受狀態(tài)，從而可進行酶活性的測定。在這里使用市售的分光測定裝置即可?；蛘?，在酶的活性測定中，可除了酶、底物及本發(fā)明的電子介質之外，使用鐵氰化鉀、吩嗪甲硫酸鹽、二氯苯酚吲哚苯酚或細胞色素C等、細胞外分泌型細胞色素以外的一或一個以上的電子介質，通過例如吸光度或吸光光譜等的分光學特性的檢測知該電子介質的電子接受狀態(tài)，從而可進行酶活性的測定。再有，為了實施本發(fā)明而使用的各種各樣的技術，除特別明示其出典的技術之外， 基于公知的文獻等，只要是本領域技術人員就可容易并且確實地實施。例如，基因工程學及分子生物學技術可基于 Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-Α Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989 ；Ausubel, F. Μ. et al.， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，New York，N. Y,1995 等所述的方法或在該處引用的文獻所述的方法或與它們實質上同樣的方法或改變法來實施。再者，本發(fā)明中的用語基本上是基于根據IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature的，或者所述領域中慣用的用語的含義的。再有，本說明書中，若無特別說明， 葡萄糖等的單糖類是指D-體，但本發(fā)明不限于此。本發(fā)明之一的實施方式是使用細胞外分泌型細胞色素、酶、及電子受體的，測定對象物的測定方法，包括(A)由上述酶氧化上述測定對象物的步驟、(B)將上述步驟A中上述酶內發(fā)生的電子由上述細胞外分泌型細胞色素接受的步驟、(C)將由上述步驟B發(fā)生的上述細胞外分泌型細胞色素中的電子由上述電子受體接受的步驟、
(D)檢測由上述步驟C發(fā)生的上述電子受體中的變化的步驟、(E)將上述步驟D中檢測到的上述電子受體中的變化的量與上述測定對象物的量或濃度關聯的步驟。如此，則由于細胞外分泌型細胞色素與酶之間的親和性好，可高靈敏度進行測定對象物的測定。另外，細胞外分泌型細胞色素由于水溶性高，特別是使用含水溶性的測定對象物的水溶液、例如，血液、血漿、血清、尿等的活體樣品之時，本發(fā)明是特別適宜的?？蓪⒓毎夥置谛图毎?、酶、及電子受體溶解到活體樣品中而使用。本發(fā)明是使經酶、及細胞外分泌型細胞色素而傳遞的測定對象物來源的電子向有效電子受體蓄積，根據電子受體的變化而得到測定對象物的量或濃度的方法。上述細胞外分泌型細胞色素而言，可用于測定相對于上述酶的上述細胞外分泌型細胞色素的量小于100倍的量。另外，上述細胞外分泌型細胞色素可使用屬于絲狀菌的菌、 曲霉屬的菌、土曲霉(Aspergillus terreus)、或者米曲霉(Aspergillus oryzae)之任何來源的。而且，作為上述細胞外分泌型細胞色素，可使用上述實施方式6所述的電子介質?？商峁┓从城笆龅募毎夥置谛图毎氐奶亻L的測定對象物的測定方法。上述酶而言，可使用氧化還原酶或脫氫酶。這些的酶由于從作為測定對象物的底物接受電子，可將此接受的電子向上述細胞外分泌型細胞色素傳遞。優(yōu)選使用對有醫(yī)學、及臨床學意義的測定對象物的氧化還原酶或脫氫酶。作為酶的例，可舉葡萄糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶、乳酸氧化酶、乳酸脫氫酶、膽固醇氧化酶、膽固醇脫氫酶等。在其中也是，上述酶是作用于葡萄糖的酶是更優(yōu)選的。活體液、特別是血液及尿中含的葡萄糖的濃度成糖尿病的診斷、經過觀察、或者發(fā)現中重要的指標。此時，作為測定對象物，可使用葡萄糖。另外，上述酶而言，可使用黃素腺嘌呤二核苷酸依賴型的，由于這些與細胞外細胞色素的親和性高，對作為測定對象物的底物的特異性高，可高靈敏度并且選擇性地實施測定對象物的測定。從而，特別是，上述酶使用黃素腺嘌呤二核苷酸依賴型葡萄糖脫氫酶是適宜的。上述發(fā)明的實施方式中，作為上述電子受體，可使用電極。如此，則因為可將電子受體中的變化作為向電極的電子流而捕捉，測定變得更簡便。向電極的電子流可通過將電流、或者通電電荷量使用市售的電流計、或者庫侖計等來檢測。電極而言，可使用含金、鉬、 鈀、碳等的，含這些化學穩(wěn)定的材料，在穩(wěn)定的測定的實施中是優(yōu)選的。另外，如后述的實施例中所述，電極以外的導體或碳的粉末不是必然必要的。這被推測為是由于本發(fā)明中的細胞外分泌型細胞色素向以電極為首的電子受體的電子傳遞能優(yōu)良。另外，上述電子受體而言，可使用氧化還原化合物。只要該化合物的分光學特性或量以氧化體和還原體不同，則可通過例如吸光度、或者吸光光譜等的分光學特性的檢測知該化合物的電子接受狀態(tài)，從而可進行測定對象物的測定。其中使用市售的分光測定裝置即可。那樣的測定可如以下一樣實行。在含酶及細胞分泌型細胞色素、氧化還原化合物的光透過性的池中添加液體樣品。池而言，可使用例如，玻璃或聚苯乙烯制的市售的光學測定用池。使用市售的分光光度計而向池照射光，檢測透過的光。照射的光、及檢測的光的波長而言，優(yōu)選適宜選擇伴隨氧化還原化合物的氧化及還原，吸光度大大變化的波長。由此，可通過光檢測伴隨液體樣品中含的氧化還原化合物的氧化的，細胞外分泌型細胞色素的氧化體的減少、或者還原體的增加。再有，細胞外分泌型細胞色素的氧化體的減少、或者還原體的增加，通過觀測細胞外分泌型細胞色素本身的分光學特性的變化也可實現，也可進行測定對象物的測定。氧化型的細胞外分泌型細胞色素在419nm處有吸收峰，但如果這變成還原型，則移位到427nm，而且成在531及562nm處呈現吸收峰?；蛘撸褂脛e樣電極，將該化合物氧化，將向電極的電子流，作為電流、或者通電電荷量而使用市售的電流計、或者庫侖計等檢測也可。電極而言，可使用含金、鉬、鈀、碳等的。 電子受體而言，可使用鐵氰化物離子、二茂鐵衍生物等的金屬絡合物、吩嗪鐺衍生物、醌衍生物等的有機化合物。上述步驟D中檢測到的變化可經一個以上的氧化還原物質的反應而得到。例如， 可將向電子受體傳遞的電子再傳遞到該氧化還原物質，作為該氧化還原物質的變化，間接觀察變化。例如，可舉作為上述電子受體，使用吩嗪甲硫酸鹽、作為上述氧化還原物質，使用二氯苯酚吲哚苯酚，檢測二氯苯酚吲哚苯酚的分光特性的變化的方法。本實施方式是，相比電子受體，氧化還原物質的特性變化更大，或者檢測分解能高的情況更優(yōu)選。優(yōu)選可測定的上述測定對象物的濃度大于5mM，這樣的實施方式除了酶和細胞外分泌型細胞色素之間的親和性之外，細胞外分泌型細胞色素和電子受體之間的親和性及電子傳遞能高，通過本發(fā)明的細胞外分泌型細胞色素實現。其他優(yōu)選的濃度范圍是，可測定的上述測定對象物的濃度是5 10mM、5 20mM、5 30mM、或者5 40mM。例如，測定對象是血中的葡萄糖的情況中，健康人是5mM左右，在糖尿病患者中，也有達的上述上限濃度的。僅以糖尿病患者作為對象時，可測定的上述測定對象物的濃度大于IOmM也可。例如， 10 20mM、10 30mM、或者10 40mM。作為其他實施方式優(yōu)選的范圍是大于0. 08mM(= 約 1. 5mg/dL)的范圍。更具體而言，0. 08 8mM、0. 08 10mM、0. 08 20mM、0. 08 30mM、 或者0. 08 40mM。在糖尿病患者中，雖然有通過胰島素的施用降低自己的血糖值的情況， 那時、有由過量施用示低血糖值之時。此時，由于有給健康帶來傷害的擔憂，在有必要測定低的濃度之時，本實施方式變得更優(yōu)選。如以上一樣的實施方式通過除了酶與細胞外分泌型細胞色素之間的親和性之外，細胞外分泌型細胞色素和電子受體之間的親和性及電子傳遞能高的，本發(fā)明的細胞外分泌型細胞色素來實現。上述細胞外分泌型細胞色素與上述酶融合著也可。融合的方法如本說明書的其他部分之記述。例如，在上述細胞外分泌型細胞色素和上述酶的融合體中，可將相對于上述酶的上述細胞外分泌型細胞色素的量小于100倍的量的用于測定。另外，上述細胞外分泌型細胞色素可使用屬于絲狀菌的菌、曲霉屬的菌、土曲霉(Aspergillus terreus)、或者米曲霉(Aspergillus oryzae)之任何來源的。而且，上述細胞外分泌型細胞色素可使用上述實施方式6所述的電子介質。如此，則可提供反映前述的細胞外分泌型細胞色素的特長的測定對象物的測定方法。通過使用融合體，測定對象物的測定方法中使用的材料，由于操作上減少，方法更簡便化?？傊?，期待通過融合化的電子傳遞效率的升高、由此的，更高靈敏度的測定。本發(fā)明之一實施方式是，使用細胞外分泌型細胞色素、酶、第1電極、及第2電極的，測定對象物的測定方法，包括(F)由上述酶氧化上述測定對象物的步驟、(G)將上述步驟F中上述酶內發(fā)生的電子由荷載到上述第1電極的上述細胞外分泌型細胞色素接受的步驟、(H)將由上述步驟G發(fā)生的上述細胞外分泌型細胞色素中的電子由上述第1電極接受的步驟、(I)通過上述步驟H檢測流經上述第1電極和上述第2電極之間的電流或通電電荷量的步驟、(J)將上述步驟I中檢測到的電流或通電電荷量與上述測定對象物的量或濃度關聯的步驟。如此，則可將測定對象物來源的電子經酶的催化反應、由細胞外分泌型細胞色素的電子傳遞反應，通過電極而電化學地簡便并且高精度檢測。本實施方式通過除了酶和細胞外分泌型細胞色素之間的親和性之外，細胞外分泌型細胞色素和電子受體之間的親和性及電子傳遞能高的，本發(fā)明的細胞外分泌型細胞色素來實現。上述第1電極、及上述第2電極而言，可使用含碳、金、鉬、或者鈀之任何的。細胞外分泌型細胞色素、及酶可使用前述的。上述酶荷載到上述第1電極上也可。如此，則由于反應的場限定在被用于檢測的第1電極上之外、使用的酶的量相比溶解到液的都更變少，可更有效利用酶。另外，上述酶與上述細胞外分泌型細胞色素融合著也可。在本融合體可使用前述的。另外，上述酶、上述細胞外分泌型細胞色素、或者它們的融合體通過高分子荷載到上述第1電極是優(yōu)選的。如此，則測定對象物的測定中必要的要素大致一體化，測定變得簡便。而且，由通過高分子的荷載，電流或通電電荷量的輸出變大。這被認為是由于，由通過高分子的荷載，細胞外分泌型細胞色素以高密度集積-取向，電極細胞外分泌型細胞色素的向電極的電子傳遞效率升高。使用的高分子例而言，可使用羧甲基纖維素。上述步驟H可由向上述第1電極的電位的施加誘發(fā)。例如，通過將市售的電勢恒定器的電位控制端連接到上述第1電極，將電位基準端和輔助電極端連接到上述第2電極， 將指定的電位通過該電勢恒定器施加，可將上述第1電極的電位對于上述第2電極施加。 此時，與流經上述第1電極的電流相同的電流流經上述第2電極。這樣的情況中，上述第2 電極是氧化還原性是優(yōu)選的。如此，則由于流經上述第2電極的電流成基于上述第2電極的氧化還原反應的，不發(fā)生在未知的測定樣品中發(fā)生的在上述第2電極的未知的反應。由于在上述第2電極的未知的反應成測定對象物的測定中不可預測的誤差要因，可由本實施方式實施排除誤差要因的測定對象物的測定。如上述一樣的氧化還原性的電極的例是Ag/ AgCl。Ag/AgCl是，被氧化則Ag — Ag+Cl_、被還原則AgCl — Ag的反應各自進行的氧化還原性的電極。還使用氧化還原性的第3電極，向上述第1電極的電位的施加對于上述第3電極進行也可。例如，通過各自將市售的電勢恒定器的電位控制端連接到上述第1電極，將輔助電極端連接到上述第2電極，將電位基準端連接到上述第3電極，將指定的電位通過該電勢恒定器施加，可將上述第1電極的電位對于上述第3電極施加。此時，由于上述第3電極是氧化還原性的，該電極的氧化及還原反應保持平衡狀態(tài)。因此，第3電極的電位大致一定。 從而，由于對于第3電極施加的第1電極的電位也大致一定，測定對象物的測定變得更穩(wěn)定。上述第3電極的例可舉Ag/AgCl。上述步驟F、及上述步驟G可并行進行。將測定對象物、酶、及細胞外分泌型細胞色素同時接觸即可。如此，則由于步驟中要求的時間縮短，測定對象物的測定迅速地進行。另外，向上述第1電極的電位的施加先于上述步驟F進行也可?？赏ㄟ^使用如前述的電位施加的方法向上述第1電極施加電位后，將測定對象物、酶、及細胞外分泌型細胞色素與上述第1電極接觸來實施。如此，則成為細胞外分泌型細胞色素通過酶接受電子，則立即向上述第1電極提供電子，細胞外分泌型細胞色素再可通過酶接受電子的形態(tài)。從而，細胞外分泌型細胞色素的向第1電極的電子傳遞效率升高，測定對象物的靈敏度好的測定變得可能。另外，本發(fā)明的其他一實施方式是，使用細胞外分泌型細胞色素、及酶的，測定對象物的測定方法，包括(K)由上述酶氧化上述測定對象物的步驟、(L)將上述步驟K中上述酶內發(fā)生的電子由上述細胞外分泌型細胞色素接受的步驟、(M)檢測由上述步驟L發(fā)生的上述細胞外分泌型細胞色素的分光學特性的變化的步驟、(N)將上述步驟M中檢測到的特性變化與上述測定對象物的量或濃度關聯的步
馬聚ο如此，則可檢測隨著測定對象物的濃度的細胞外分泌型細胞色素的氧化體的減少、或者還原體的增加。氧化型的細胞外分泌型細胞色素在419nm處有吸收峰，這變成還原型，則移位到427nm，而且在531及562nm呈現吸收峰。這樣的變化可使用市售的分光光度計測定。本發(fā)明的其他一實施方式是，用于測定測定對象物的濃度或量的電極，其為荷載細胞外分泌型細胞色素及酶的電極。如此，則由于反應的場限定到測定對象物的測定中使用的電極上之外、使用的酶的量相比溶解到液的都更變少，可更有效利用酶。另外，上述酶與上述細胞外分泌型細胞色素融合著也可。在本融合體可使用前述的。如此，則測定對象物的測定中必要的要素大致一體化，可將該電極與其他可容易入手的第2電極、以及第3電極組合而簡便地實施測定。在細胞外分泌型細胞色素及酶的荷載中可使用高分子。由此， 電流或通電電荷量的輸出變大。這被認為是由于，通過由高分子的荷載，細胞外分泌型細胞色素以高密度集積-取向，電極細胞外分泌型細胞色素的向電極的電子傳遞效率升高。使用的高分子例而言，可使用羧甲基纖維素。上述電極含碳、金、鉬、或者鈀之任何是優(yōu)選的。這些的材料由于化學穩(wěn)定，從而測定對象物的測定變得穩(wěn)定。通過向以例如，碳、金、鉬、或者鈀之任何作為材料的平板的電極滴下-干燥含細胞外分泌型細胞色素及酶的高分子溶液，可制成電極。本發(fā)明的進一步的其他一實施方式是用于進行樣品液中含的測定對象物的測定的傳感器，上述傳感器至少包括(i)絕緣性的第1基板、(ii)上述第1基板上配置的第1及第2電極、(iii)上述第1電極上配置的試劑層、(iv)與上述第1電極或上述試劑層、及上述第2電極接觸的樣品液保持部，上述試劑層含細胞外分泌型細胞色素，上述試劑層或上述樣品液保持部之任何配
置有酶。接下來將本實施方式使用附圖詳細地說明。(傳感器的概略構成)
傳感器1，具體而言，有基板2、導電層3、試劑層4、間隔物5、蓋6。如圖4所示，基板2是板狀的部件?；?有絕緣性。構成基板2的材料而言，可舉例如，聚對苯二甲酸乙二酯、乙烯基聚合物、聚亞胺、聚酯、及苯乙烯系塑料等的樹脂；玻璃；以及陶瓷等?；?的尺寸不限于具體性的數值，例如，基板2的寬度優(yōu)選設定為4 20mm、更優(yōu)選為5 10mm。另外，基板2的長度優(yōu)選設定為20 40mm。另外，基板2的厚度優(yōu)選設定為0. 1 1mm。基板2的寬度、長度，及厚度全部在這些的范圍內是更優(yōu)選的。 如圖4所示，導電層3在基板2上以略均一的厚度形成。導電層3含3個電極31 33。作為第1電極的電極31是作用電極、作為第2電極的電極32是對電極、電極33有被稱為檢測電極的時候。再有，檢測電極33可省略。電極31 33的各自之一部分配置成面對毛細管51。電極31 33的其他一部分在與傳感器1的導入口 52相反的端部，不被間隔物5及蓋6包被而露出。此露出部分發(fā)揮蓋的功能，從測定器101接受電壓的施加，或將電流傳遞到測定器101。各電極通過使用導電性材料的印刷等形成也可，將基板2用導電性材料包被之后，用激光消融等形成非導電軌道而形成也可。例如，作為非限定的例，通過向基板2濺射鈀而形成導電層3，通過激光消融，可形成非導電軌道。非導電軌道有優(yōu)選為0. 01 0. 5mm、 更優(yōu)選為0. 05mm 0. 3mm的寬度。再有，導電層3的構成材料是導電性材料(導電性物質)即可，無特別限定。導電性材料的例而言，可舉以金屬、金屬混合物、合金、金屬氧化物、及金屬化合物作為代表的無機導電性物質等、碳化氫系導電性聚合物及雜原子含有系導電性聚合物等的有機導電性物質、或者這些的物質的組合。導電層3的構成材料而言，鈀、金、鉬、碳等是優(yōu)選的，鈀是特別優(yōu)選的。這些材料由于化學穩(wěn)定，從而作為電極穩(wěn)定地發(fā)揮功能，測定對象物的測定變得穩(wěn)定。導電層3的厚度可根據其形成方法及構成材料而變更。例如，通過濺射形成導電層3之時，導電層3的厚度優(yōu)選為0. 1 20nm、更優(yōu)選是1 lOnm。通過印刷形成導電層 3之時，導電層3的厚度優(yōu)選為0. 1 50 μ m、更優(yōu)選是1 30 μ m。在對應于導電層3的電極32(第2電極)的部分涂布氧化還原性的物質，將其作為電極32也可。如此，則由于流經上述第2電極的電流成基于上述第2電極的氧化還原反應的，未知的測定樣品中發(fā)生的在上述第2電極的未知的反應不發(fā)生。在上述第2電極的未知的反應由于由在測定對象物的測定中無法預測的誤差要因而成，通過本實施方式可實施排除誤差要因的測定對象物的測定。如上述一樣的氧化還原性的電極的例是Ag/AgCl。 Ag/AgCl是被氧化則Ag — Ag+Cl_、被還原則AgCl — Ag的反應各自進行的氧化還原性的電極。如圖4所示，試劑層4配置成至少與電極31(第1電極)接觸。另外，試劑層4僅在電極31上配置的形態(tài)是更優(yōu)選的。如此，則測定對象物的反應的場被限定在檢測中使用的第1電極上，可更有效利用酶。而且，可將作為第2電極的電極32中的還原反應與第1 電極獨立而進行。從而，將如上述的氧化還原性的電極作為第2電極提供變得更容易。試劑層4與電極31及32—同，作為傳感器1的活性部發(fā)揮功能。活性部是以電化學方式發(fā)揮活性的區(qū)域，與液體樣品中的特定的物質反應，發(fā)生電信號的部分。具體而言， 試劑層4含酶及/或細胞外分泌型細胞色素。
在試劑層4中含1種或多種的酶。試劑層4中含的酶，具體而言，是以測定對象物作為底物的酶，特別是與測定對象物特異性地反應的酶是優(yōu)選的。酶根據測定對象物的濃度、即與測定對象物的反應量，向細胞外分泌型細胞色素提供電子。試劑層4中含的酶而言，氧化還原酶是特別優(yōu)選的。氧化還原酶而言，具體而言， 可舉以測定對象物作為底物的氧化酶及脫氫酶。這些的氧化還原酶的具體例而言，測定對象物是葡萄糖之時，可舉葡萄糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶，在測定對象物是乳酸之時，可舉乳酸氧化酶、或者乳酸脫氫酶，在測定對象物是膽固醇之時，可舉膽固醇酯酶、或者膽固醇氧化酶，在測定對象物是醇之時，可舉醇氧化酶，在測定對象物是膽紅素之時，可舉膽紅素氧化酶。酶對于其輔酶依賴性，無特別限定。例如，試劑層4中含的酶是對于NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)、NADP (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、PQQ(吡咯并喹琳醌)、或者FAD (黃素腺嘌呤二核苷酸)等的輔酶有依賴性的酶也可。酶的輔酶是FAD或PQQ是優(yōu)選的。對應于這些的輔酶的酶中，輔酶或者與其酶蛋白質結合，或者被包含。從而，傳感器的制備及測定方法的實施中，無以與酶別的方式添加輔酶的必要。其結果，傳感器的構成、制備步驟、及測定步驟被簡便化。在NAD及NADP依賴性的酶的情況中，有必要將在不與酶蛋白結合的狀態(tài)下發(fā)揮功能的輔酶NAD及NADP與酶一同別樣添加。構成及步驟與以FAD及PQQ作為輔酶的酶的情況比較而變得復雜，單本發(fā)明可實施。例如，酶是FAD依賴性的氧化酶、NAD依賴性、PQQ依賴性、或者FAD依賴性的脫氫酶等也可。氧化酶及脫氫酶的具體例如上所述。試劑層4中的酶與上述細胞外分泌型細胞色素融合也可，在本融合體可使用前述的。另外細胞外分泌型細胞色素可使用前述的。試劑層4中的酶的含有量設定為可進行目標物質的檢測的程度，對于每1次的測定或每1個傳感器，優(yōu)選設定為0. 2 20U (單位)、更優(yōu)選為0. 5 IOU左右。另外，在試劑層4中，含與酶相容的輔酶也可。試劑層4含細胞外分泌型細胞色素。細胞外分泌型細胞色素可可逆地變成氧化體及還原體，直接或與別的物質協同，介導物質間的電子的移動。例如，試劑層4中含氧化底物的酶之時，酶通過氧化底物，從底物的接受電子，給輔酶電子。其結果，輔酶從氧化體成還原體。氧化體的細胞外分泌型細胞色素從變成還原體的輔酶接受電子，使輔酶變回氧化體。 其結果，細胞外分泌型細胞色素自身變成還原體。變成還原體的細胞外分泌型細胞色素給電極31或32電子，自身變成氧化體。如此，細胞外分泌型細胞色素介導酶與電極間的電子移動。上述輔酶通過與酶蛋白質(酶分子)結合，保持在酶蛋白質也可。另外，輔酶與酶蛋白質不同地，溶解著也可。試劑層4含酶及細胞外分泌型細胞色素以外的其他成分也可。那樣的成分而言， 使用可提高酶或細胞外分泌型細胞色素的保存性，或提高酶和目標物質的反應性的各種的物質。作為那樣的成分，可舉例如緩沖劑。試劑層4可通過各種的方法形成。形成方法而言，可舉例如印刷法、涂布法等。接下來述形成方法之一例。將酶、細胞外分泌型細胞色素、及根據需要含其他成分的水溶液使用微注射器等，以一定量滴到電極31上之后，通過在適宜的環(huán)境靜置而干燥， 可形成試劑層4。再有，在用試劑層4包被電極31的更大的表面之時，將滴下的水溶液用注射器的尖端等涂開也可。水溶液的滴下量不限于特定的數值，優(yōu)選為0. 5 5 μ L、更優(yōu)選是1 2 μ L。試劑層4的形狀不限于具體性的形狀。此形狀是矩形狀或圓形狀等也可。試劑層4的面積(基板2的平面方向的面積)根據裝置的特性及尺寸而決定。此面積可優(yōu)選為 1 25mm2、更優(yōu)選為2 10mm2。涂布的水溶液含的，酶及細胞外分泌型細胞色素以及其他成分的含有量根據必要的裝置的特性或尺寸選擇。如圖4所示，作為第2基板的間隔物5是用于形成含測定對象物的樣品液保持部的部件。具體而言，間隔物5是板狀的部件，除電極31 33的蓋部分及后述的毛細管51部分，包被導電層3的全體。間隔物5具備露出與電極31 33的蓋部分相反的端部的矩形的切口。切口部是U字型也可。間隔物5通過具備此切口，從而形成樣品液保持部。再者， 通過將作為第3基板的蓋6與間隔物5貼合，由蓋6形成樣品液保持部之一部分。如此，形成作為由間隔物5、導電層3、及蓋6包圍的樣品液保持部發(fā)揮功能的毛細管51。如此，間隔物5提供毛細管51的側壁，再者可規(guī)定毛細管51的長度，寬度、高度等。毛細管51的容量優(yōu)選設定為0. 1 1. 0μ L(y L)左右。間隔物5的厚度優(yōu)選是 0. 1 0. 2mm,間隔物具備的切口的長度是1 5mm是優(yōu)選的，間隔物具備的寬度是0. 5 2mm是優(yōu)選的。再有，這些的尺寸適宜選擇成毛細管51變成所望的容量即可。例如，使用具備長度是3. 4mm、寬度是1. 2mm的切口的厚度0. 145mm的間隔物5之時，提供長度是3. 4mm、 寬度是1. 2mm、高度是0. 145mm、容量是0. 6 μ L的毛細管51。毛細管51從作為其開口部的導入口 52通過毛細管現象吸引液體樣品，保持在電極31 33上。如圖4所示，蓋6是包被間隔物5全體的板狀的部件。蓋6具備從表面至里面貫通的孔。此孔作為從毛細管51向外部通的通氣口 61而發(fā)揮功能。通氣口 61是液體樣品被毛細管51吸引之時，用于將毛細管51內的空氣向毛細管外排出的排氣孔。通過如此排出空氣，液體樣品容易被吸引到毛細管51內。通氣口 61，在從導入口 52離開的位置，S卩，從導入口 52看設在毛細管51的里面是優(yōu)選的。導入口 52通過如此配置，液體樣品可從導入口 52快速移動至毛細管51的里面。再有，上述的實施方式中，記載了第1及第2電極在相同基板上配置的例，但不限于此。例如將一方的電極配置在上述基板上，將另一方配置在蓋基板上也可。上述的傳感器1在圖5所示的測定系統100中使用。測定系統100有傳感器1及測定器101。如圖5及圖6所示，測定器101具備顯示部102、安裝部103、切換電路107、基準電壓源108、電流/電壓變換電路109、A/D變換電路110、計算部111。測定器101，再者，有對應于傳感器1的各電極的連接器。在圖6中描繪了連接器104 106。顯示部102顯示測定器101的狀態(tài)、測定結果，操作內容等。顯示部102，具體而言，通過液晶顯示面板實現。
如圖5所示，在安裝部103連離可能地插入傳感器1。如圖6所示，連接器104 106，通過傳感器1安裝到安裝部103，從而連接到各自傳感器1的電極31 33。切換電路107，或將連接器104 106連接到基準電壓源108，或實施電流/電壓變換電路109?；鶞孰妷涸?08經連接器104 106，向電極31 33施加電壓。電流/電壓變換電路109經連接器104 106接受從傳感器1的電流，變換成電壓而輸出到A/D變換電路110。A/D變換電路110，將從電流/電壓變換電路109的輸出值(類似物值)變換成脈沖(數字值)。計算部111有CPU(中央處理器)以及R0M(只讀存儲器)及RAM(隨機存儲器) 等的記錄介質。計算部111或進行目標物質的濃度算出，或控制測定器101內的各部的動作。對于計算部111的濃度算出功能進行說明。在計算部111的記憶介質中，記憶了樣品中的目標物質的濃度的決定中使用的換算表、此濃度的修正量的決定中使用的修正量表等。計算部111，基于從A/D變換電路110的脈沖，通過參照換算表，算出目標物質的假定的濃度。計算部111，再者，使用修正量表中的修正量，確定目標物質的最終的濃度。由此算出的濃度顯示在顯示部102。另外，計算部111除了濃度算出功能以外，有切換電路107的切換控制、基準電壓源108的電壓控制、濃度測定或修正量選擇時之時間的測定(定時器功能)、向顯示部102 的顯示數據輸出、及與外部機器的通信功能等。計算部111的各功能通過CPU讀出未圖示的ROM等中儲存的程序而實行來實現。以下，對于由測定系統100的濃度測定進行說明。傳感器1插入到安裝部103，則連接器104 106各自連接到電極31 33。另外，安裝部103內的開關(未圖示)被傳感器1按下。通過開關的按下，計算部111判斷為安裝了傳感器1，使測定器101成為樣品待機狀態(tài)。樣品待機狀態(tài)是指，在計算部111的控制下、基準電壓源108經連接器104及106，開始向作用電極31及檢測電極33間的電壓施加，并且電流/電壓變換電路109開始電流測定之后，液體樣品尚未向測定供給的狀態(tài)。使用者向傳感器1的導入口 51附著液體樣品，則通過毛細管現象，液體樣品從導入口 51被引入毛細管52。液體樣品而言，使用例如，血液、汗、尿等的活體來源的液體樣品，或環(huán)境來源的液體樣品、食品來源的液體樣品等。例如，將傳感器1作為血糖值傳感器使用之時，使用者將自身的指、掌、或者腕等穿刺，榨出少量的血液，將此血液作為液體樣品，供給到在傳感器1 的測定。液體樣品到達作用電極31及檢測電極33，則計算部111經電流/電壓變換電路 109接受的電流值變化。從此變化，計算部111判斷液體樣品被吸引到傳感器1。由此，檢測到液體樣品的吸引，則測定開始。在傳感器1內，在電極31及32上，液體樣品、酶、及介質互相接觸。通過計算部111的控制，切換電路107將連接器104和連接器105連接到基準電壓源108及電流/電壓變換電路109。由此，在作用電極31和對電極32之間施加電壓，作用電極31和對電極32之間發(fā)生的電流被傳遞給電流/電壓變換電路109。向電流/電壓變換電路109流的電流被變換成電壓。然后，此電壓通過A/D變換電路110再被變換成脈沖。計算部111由此脈沖算出特定成分的濃度。由計算部111算出的值顯示在顯示部202。那時，有向使用者的其他信息一同顯示的情況。測定結束后，使用者可將傳感器1從安裝部103拆下。再有，基準電壓源108，在2個電極31及32間，施加對于引起目的電化學反應充分的電壓。此電壓主要根據利用的化學反應及電極進行設定。另外，上述(f)通過例如，計算裝置利用使用目標物質的濃度已知的標準溶液得到的標準曲線來算出目標物質的濃度來實行。本發(fā)明的其他一實施方式是用于測定測定對象物的濃度或量的電極，其為荷載細胞外分泌型細胞色素及酶的電極。如此，則由于反應的場被限定在測定對象物的測定中使用的電極上之外，使用的酶的量相比溶解于液的都更變少，從而可更有效利用酶。另外，上述酶與上述細胞外分泌型細胞色素融合著也可。在本融合體可使用前述的。如此，則測定對象物的測定中必要的要素被大致一體化，可將該電極與其他可容易入手的第2電極、以及第3電極組合而簡便地實施測定。在細胞外分泌型細胞色素及酶的荷載中，可使用高分子。由此，電流或通電電荷量的輸出變大。這被認為是由于，由通過高分子的荷載，細胞外分泌型細胞色素高密度集積-取向，電極細胞外分泌型細胞色素的向電極的電子傳遞效率升高。使用的高分子例而言，可使用羧甲基纖維素。以下，基于實施例更詳細地說明本發(fā)明。再有，本發(fā)明的技術性范圍不以任何方式受這些記載的限制。本說明書中引用的文獻中記載的內容作為本說明書之一部分而構成本說明書的公開內容。
實施例實施例1細胞外分泌型細胞色素基因的取得(1)培養(yǎng) 將包含PinedeX2% (松谷化學工業(yè)社制)(W/V)、胰蛋白胨1 % (BD社制)(W/V)、 磷酸二氫鉀 0. 5% (Nacalai tesque 社制)(W/V)、硫酸鎂七水和物 0. 05% (ff/V) (Nacalai tesque社制)及水的液體培養(yǎng)基150mL放入500mL容積的坂口瓶，用silicosen栓之后，在 121°C、高壓滅菌20分鐘。向冷卻的此液體培養(yǎng)基中接種土曲霉(Aspergillus terreus) NIH26M株或米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40株，于30°C振蕩培養(yǎng)62小時。(2)總 RNA 提取將根據實施例(1-1)所述的方法培養(yǎng)的土曲霉(Aspergillus terreus)NIH2624 株或米曲霉(Aspergillus oryzae) RIB40株的濕菌體2g各由液氮冷凍而磨碎之后，使用 illustra RNAspin Mini Kit (GE HEALTHCARE-日本社制)，提取各 0. Img 的總 RNA。(3)cDNA 庫的制備通過使用自土曲霉(Aspergillus terreus) ΝΙ 624 株或米曲霉(Aspergillus oryzae) RIB40株的各總RNA，逆轉錄酶及適配體附帶寡dT引物的逆轉錄反應制備各cDNA庫。在反應中使用I^rime Script RT-PCR Kit (寶生物社制)，反應條件基于說明書所述的流程進行。(4)細胞外分泌型細胞色素基因的向大腸桿菌的亞克隆合成以下的表1所示的2組的引物，通過該引物，以土曲霉(Aspergillus terreus)NIH2624株或米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40株的cDNA庫作為模板，將各細胞外分泌型細胞色素基因PCR擴增。白勺弓Lt艮ig NCBI (National Center for Biotechnology Information) (網址 http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)中公開的基因數據庫，基于 XM_001216771 ( 土曲霉(Aspergillus terreus)推定為以mRNA之一部分編碼蛋白質)及ΧΜ_001820457 (米曲霉(Aspergillus oryzae)推定為以mRNA之一部分編碼蛋白質)的序列設計。其理由是， 使用 SMART (網址 http://smart, embl-heidelberg. de/)進行上述 XM_001216771 的結構域結構預測的結果，推測為有電子傳遞能的蛋白質(細胞色素)。再者，在正向側附加用限制酶BglII識別的序列(四邊形框內)(AT Cytb Bgl2_F、A0 Cytb Bgl2_F)、在反向側附加用 XhoI 或 NcoI 識別的序列(四邊形框內)(AT Cytb Xhol_R、A0 Cytb Nco 1_R)。表1AT Cytb Bgl2_F(SEQ ID NO :5) 5' -GA ^GATClj TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAAATGCGTTCCTTTCTCGCCA-3 ’AT Cytb Xhol_R(SEQ ID NO :6)5 ’ -CCG ICTCGAGlr TCAAATGGGGTCAGAGACTTGTTCCACGAGA-3 ’AO Cytb Bgl2_F(SEQ ID NO :7)5 ’ -GA IagatctI TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAAATGACATTAAGAAACCCTA-3 ’AO Cytb Ncol_R(SEQ ID NO :8)5 ’ -CATG ICCATGGI' CTAAGCGGAGCACTTCTCAGGAACTGCATCCTT-3 ’對于土曲霉(Aspergillusterreus)NIH2624 株是以 AT Cytb Bgl2_F 和 AT Cytb Xhol_R 的組合，對于米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40 株是以 AO Cytb Bgl2_F 禾口 AO Cytb Ncol_R的組合進行PCR，擴增各自的目的基因區(qū)域。再有，PCR是使用市售的聚合酶 pfu ultra (STRATAGENE 社制)，反應條件作為[94°C /2 分鐘一(94°C /30 秒鐘 55°C /30 秒 It 72 V /1 分鐘)X 30 循環(huán)]。接下來，將土曲霉(Aspergillus terreus)株來源擴增基因片段用限制酶 BglII及BioI切斷，將米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40株來源擴增基因片段用限制酶 BglII及NcoI切斷，同樣地用BglII及XhoI或BglII及NcoI連接到各限制酶處理的真菌的表達用載體，各構建土曲霉(Aspergillus terreus)株來源或米曲霉(Aspergillus oryzae) RIB40株來源的細胞外分泌型細胞色素表達用載體。再有，本載體是公知文獻1 ( 了
屬Θ異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化學i生物、38、12、P831-838、2000)中記載的，使用米曲霉(Aspergillus oryzae)來源的淀粉酶系統的改良啟動子，制備可表達目的基因的載體。上述、將細胞外分泌型細胞色素表達用載體各導入大腸桿菌JM109株而轉化。使用 illustra plasmidPrep MidiFlowKit (GE HEALTHCARE-日本社制)，由各得到的轉化體中，由各3個克隆提取質粒，進行插入子的序列解析，在全部的質?？纱_認目的基因。(5) 土曲霉(Aspergillus terreus)株來源細胞外分泌型細胞色素基因的取得但是，由于取得的土曲霉(Aspergillus terreus)NIH2624株來源的基因相比公開序列(SEQ ID NO 1)缺失10個堿基，人工合成含缺失位置的周邊275個堿基，取代土曲霉 (Aspergillus terreus)株來源細胞外分泌型細胞色素基因的對應位置。制備的基因片段以與實施例(1-4)所述的方法同樣地，克隆到大腸桿菌之后，進行基因解析的結果， 可取得與公開序列XM_001216771相同的序列的基因。再有，將根據本發(fā)明取得的土曲霉(Aspergillus terreus)株及米曲霉 (Aspergillus oryzae)RIB40株來源的細胞外分泌型細胞色素的基因序列及氨基酸序列以 SEQ ID NO :1 及 2、以及，SEQ ID NO :3 及 4 各自示。實施例2細胞外分泌型細胞色素的表達-純化(1)真菌的轉化和目的蛋白質的表達確認使用在實施例(1-4)或(1-5)制備的，土曲霉(Aspergillusterreus) NIH2624 株來源細胞外分泌型細胞色素表達用載體或米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40株來源細胞外分泌型細胞色素表達用載體，基于公知文獻1及3 (清酒用麹菌”遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、P494-502、2000)所述的方法，各制備生產各細胞外分泌型細胞色素的重組真菌 (米曲霉(Aspergillus oryzae))。再有，使用的宿主真菌如公知文獻2 (Bic^ci. Biotech. Biochem.，61 (8)，1367-1369，1997)，在1997年(平成9年)在釀造試驗場育種，用于轉錄因子的解析、各酶的高生產株的育種等，可得到分售的。用Czapek-Dox固體培養(yǎng)基選擇各轉化體之后，向各放入實施例(1-1)所述的液體培養(yǎng)基IOmL的大試管O2mmX200mm)中， 將各轉化體植菌，于30°C振蕩培養(yǎng)62小時。培養(yǎng)結束后，將各培養(yǎng)液離心(3，000Xg、20 分鐘)，將去除沉淀的作為粗蛋白質樣品。將各粗蛋白質使用15.0%聚丙烯酰胺凝膠，根據 LaemmLi等的方法進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳后，進行考馬斯亮藍 (CBB)染色，將移動度與分子量標記物(GE HEALTHCARE-日本社制的LMW Marker)的進行比較而確認各目的蛋白質的表達，均確認分子量約30kDa的目的蛋白質的表達。(2)重組真菌的種培養(yǎng)向實施例(1-1)所述的坂口瓶中接種在實施例(2-1)制備的各重組真菌，將于 30°C振蕩培養(yǎng)62小時的作為各培養(yǎng)液。(3)本培養(yǎng)制備各3. 5L，pH6. 0的包含PinedeX2% (松谷化學工業(yè)社制)(W/V)、胰蛋白胨 1 % (BD社制)(W/V)、磷酸二氫鉀0. 5 % (Nacalai tesque社制)(W/V)、硫酸鎂七水和物 0. 05% (ff/V) (Nacalai tesque社制)、消泡劑及水的液體培養(yǎng)基，放入5L容積的各發(fā)酵罐， 于121°C、高壓滅菌20分鐘。向冷卻的此液體培養(yǎng)基，各接種實施例(2- 中制備的各培養(yǎng)液45mL，于30°C在通氣攪拌的條件下培養(yǎng)62小時。將各培養(yǎng)液過濾而得到的培養(yǎng)上清作為各粗蛋白質溶液使用。從該粗蛋白質溶液，再根據以下(4) (6)單離純化各細胞外分泌型細胞色素。(4)濃縮-脫鹽
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將各粗蛋白質溶液各用分級分離分子量10，000的超濾膜“PelliCOn2模塊”(Millipore社制)濃縮，取代成20mM磷酸鉀緩沖液(pH7. 0)，制備各粗蛋白質濃縮液。(5)由 Butyl-TOYOPEAL65OM CTosoh 社制)的純化將上述各粗蛋白質濃縮液各調節(jié)成60%飽和硫酸銨液(pH7.5)后，將離心分離而得到的各上清各通液到用含60%硫酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡化的 Butyl-T0Y0PEAL650M柱，使吸附各目的蛋白質，用同緩沖液清洗之后，用60% 30%的硫酸銨濃度的梯度溶出法將各蛋白質各溶出。對于各目的級分進行350nm 600nm的光譜解析，各回收在細胞色素1^562觀察到特征性的562nm處的還原光譜。(6)通過DEAE-cellulofine A-500 (生物化學工業(yè)社制)的純化將上述各回收級分各用超濾膜“PelliCOn2模塊”濃縮，脫鹽后用5mM Tris-鹽酸緩沖液(PH8.0)平衡化，使各吸附到用上述緩沖液平衡化的DEAE-cellulofine A-500，用同緩沖液清洗之后，用含同緩沖液和0.2M NaCl的同緩沖液通過梯度溶出法將各蛋白質各溶出，集合目的級分。將得的各純化蛋白質，使用15.0%聚丙烯酰胺凝膠根據LaemmLi等的方法，進行SDS-PAGE。電泳后，進行CBB染色，將移動度與分子量標記物(GE HEALTHCARE 社制的LMW Marker)的移動度比較的結果，可確認成單一(分子量約30kDa)。如此，土曲霉(Aspergillus terreus)NI!E6M株來源細胞外分泌型細胞色素或米曲霉(Aspergillus oryzae) RIB40株來源細胞外分泌型細胞色素可容易地從各轉化體的培養(yǎng)上清回收，從而可穩(wěn)定純化，單離。再者，通過確立將作為絲狀菌的屬于曲霉屬的菌的米曲霉(Aspergillus oryzae)作為宿主的制備方法，與以酵母作為宿主的制備方法比較，從而可得到無過量的糖鏈附加的重組細胞外分泌型細胞色素。再者，從實施例(2-6)得到的，土曲霉(Aspergillus terreus)株來源細胞外分泌型細胞色素(AtCytb)或米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40株來源細胞外分泌型細胞色素(AoCytb)有以下的物理化學性質。(1)共有從葡萄糖氧化還原酶接受電子的功能及/或向電子受體供給電子的功能。(2)分子量約30kDa (是將由導入SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3所示的多核苷酸的絲狀菌的重組細胞外分泌型細胞色素供給到聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)之時的亞
基分子量。)再有，對于上述分子量而言，由于本酶原來就附加有糖鏈，由培養(yǎng)條件或純化條件而糖鏈的附帶方式變化，則分子量不同，根據轉化細胞或載體系統的種類等，糖鏈或附加的氨基酸也變化而分子量變得不同。再者根據導入的多核苷酸的種類而氨基酸序列長或糖鏈的附帶方式變化，則分子量不同。(3)呈紅色。(4)還原型而在細胞色素1^562有特征的吸收光譜G27、531、562nm)。(5)是可溶性蛋白質。實施例3對葡萄糖的應答電流值測定酶電極在玻璃化碳(直徑6mm、電極表面的直徑)的表面作為固定酶和電子介質的構成。酶電極在使用之前，通過在IM的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中浸漬而平衡化。酶而言，使用國際公開第2006/101239所述的土曲霉(Aspergillus terreus)來源的葡萄糖脫氫酶 (AtGLD、2，000U/mg)以及國際公開第 2008/001903 號所述的米曲霉(Aspergillus oryzae) 來源的葡萄糖脫氫酶(AoGLD、2，000U/mg)，電子介質而言，使用實施例2中得到的AtCytb、 ^VoCytb、馬心肌來源細胞色素C(HCytC)、大腸桿菌來源細胞色素b (EcCytb)、以及鐵氰化鉀而制成酶電極。酶電極中，將酶的含有量為5U、電子介質的含有量為與0. ^XlO-iciHi0I相當的量((摩爾比)酶電子介質=1:1)。應答特性是，對于濃度不同的多個葡萄糖溶液，基于測定應答電流的結果來檢查。 應答電流值是，對于保持調節(jié)到目的濃度的葡萄糖溶液的反應槽，浸漬酶電極、參照電極及對電極的同時，在酶電極和對電極之間施加電壓，以參照電極作為基準電極而測定。葡萄糖溶液是，通過將葡萄糖溶解到IM的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中而制成。葡萄糖溶液的濃度設定到0. ImM 40mM。參照電極而言使用Ag/AgCl電極，對電極而言使用Pt電極。施加電壓值作為+500mV，應答電流值的測定是將反應槽的溫度維持在30°C而進行。應答電流值的測定結果如表2及表3、以及，圖1及圖2所示。表2
權利要求
1.使用細胞外分泌型細胞色素、酶、及電子受體的，測定對象物的測定方法，所述方法包括(A)由上述酶氧化上述測定對象物的步驟、(B)將上述步驟A中上述酶內發(fā)生的電子由上述細胞外分泌型細胞色素接受的步驟、(C)將由上述步驟B發(fā)生的上述細胞外分泌型細胞色素中的電子由上述電子受體接受的步驟、(D)檢測由上述步驟C發(fā)生的上述電子受體中的變化的步驟、(E)將上述步驟D中檢測到的上述電子受體中的變化的量與上述測定對象物的量或濃度關聯的步驟。
2.權利要求1所述的測定方法，其中測定中使用的，相對于上述酶的上述細胞外分泌型細胞色素的量小于100倍。
3.權利要求1所述的測定方法，其中上述細胞外分泌型細胞色素是屬于絲狀菌的菌來源的。
4.權利要求3所述的測定方法，其中上述絲狀菌是曲霉屬的菌。
5.權利要求4所述的測定方法，其中上述曲霉屬的菌是土曲霉(Aspergillus terreus)、或者米曲霉(Aspergillus oryzae)。
6.權利要求1所述的測定方法，其中上述細胞外分泌型細胞色素是葡萄糖氧化還原酶用電子介質，其包括以下的(a)、(b)或(c)的多肽(a)包括SEQID NO :2或SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的多肽、(b)包括SEQID NO 2或SEQ ID NO 4的氨基酸序列中，1個或數個的氨基酸被取代、 缺失、插入或附加的氨基酸序列，且有電子介質功能的多肽、(c)包括與SEQID NO :2或SEQ ID NO :4的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列，且有電子介質功能的多肽。
7.權利要求1所述的測定方法，其中上述酶是氧化還原酶或脫氫酶。
8.權利要求1所述的測定方法，其中上述酶是作用于葡萄糖的酶。
9.權利要求1所述的測定方法，其中上述酶是黃素腺嘌呤二核苷酸依賴型。
10.權利要求1所述的測定方法，其中上述酶是黃素腺嘌呤二核苷酸依賴型葡萄糖脫氫酶。
11.權利要求1所述的測定方法，其中上述測定對象物是葡萄糖。
12.權利要求1所述的測定方法，其中上述電子受體是電極。
13.權利要求1所述的測定方法，其中上述電子受體是氧化還原化合物。
14.權利要求1所述的測定方法，其中上述步驟D中的檢測通過電流、通電電荷量、或者分光學量進行。
15.權利要求1所述的測定方法，其中上述步驟D中檢測到的變化經一個以上的氧化還原物質的反應得到。
16.權利要求1所述的測定方法，其中可測定的上述測定對象物的濃度大于5mM。
17.權利要求1所述的測定方法，其中上述細胞外分泌型細胞色素與上述酶融合。
18.權利要求17所述的測定方法，其中上述酶是葡萄糖脫氫酶、或者葡萄糖氧化酶。
19.權利要求17所述的測定方法，其中上述細胞外分泌型細胞色素與上述酶的融合體是在單一分子內有電子介質功能和底物的氧化功能的兩功能的融合體，其特征在于，在下述(a)、(b)及(c)之中有(a)及(b)、或者有(a)及(b)，并且在(a)和(b)之間有(c)(a)細胞外分泌型細胞色素的氨基酸序列、(b)葡萄糖氧化還原酶的氨基酸序列、(c)將(a)的氨基酸序列和(b)的氨基酸序列結合的接頭序列。
20.權利要求17所述的測定方法，其中上述細胞外分泌型細胞色素與上述酶的融合體是以下的(a)、(b)或(c)的多肽(a)包括SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO 27 或 SEQ ID NO 29 所示的氨基酸序列的多肽、(b)包括SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27 或 SEQ ID N0:29 中，1 個或數個的氨基酸被取代、缺失、插入或附加的氨基酸序列，且有電子介質功能及葡萄糖氧化功能的多肽、(c)包括與SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO 27 或 SEQ ID NO 29 的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列，且有電子介質功能及葡萄糖氧化功能的多肽。
21.使用細胞外分泌型細胞色素、酶、第1電極、及第2電極的，測定對象物的測定方法， 所述方法包括(F)由上述酶氧化上述測定對象物的步驟、(G)將上述步驟F中上述酶內發(fā)生的電子由荷載到上述第1電極的上述細胞外分泌型細胞色素接受的步驟、(H)將由上述步驟G發(fā)生的上述細胞外分泌型細胞色素中的電子由上述第1電極接受的步驟、(I)通過上述步驟H檢測流經上述第1電極和上述第2電極之間的電流或通電電荷量的步驟、(J)將上述步驟I中檢測到的電流或通電電荷量與上述測定對象物的量或濃度關聯的步驟。
22.權利要求21所述的測定方法，其中上述酶荷載到上述第1電極。
23.權利要求21所述的測定方法，其中上述酶與上述細胞外分泌型細胞色素融合。
24.權利要求21所述的測定方法，其中上述酶、上述細胞外分泌型細胞色素、或者它們的融合體通過高分子荷載到上述第1電極。
25.權利要求21所述的測定方法，其中上述步驟H通過向上述第1電極的電位的施加誘發(fā)。
26.權利要求25所述的測定方法，其中向上述第1電極的電位的施加對于上述第2電極進行。
27.權利要求沈所述的測定方法，其中上述第2電極是氧化還原性的。
28.權利要求27所述的測定方法，其中上述第2電極是Ag/AgCl。
29.權利要求25所述的測定方法，其中還使用氧化還原性的第3電極，向上述第1電極的電位的施加對于上述第3電極進行。
30.權利要求四所述的測定方法，其中上述第3電極是Ag/AgCl。
31.權利要求21所述的測定方法，其中上述步驟F、及上述步驟G并行實施。
32.權利要求21所述的測定方法，其中向上述第1電極的電位的施加先于上述步驟F 進行。
33.使用細胞外分泌型細胞色素、及酶的，測定對象物的測定方法，所述方法包括 (K)由上述酶氧化上述測定對象物的步驟、(L)將上述步驟K中上述酶內發(fā)生的電子由上述細胞外分泌型細胞色素接受的步驟、 (M)檢測由上述步驟L發(fā)生的上述細胞外分泌型細胞色素的分光學特性的變化的步驟、(N)將上述步驟M中檢測到的特性變化與上述測定對象物的量或濃度關聯的步驟。
34.用于測定測定對象物的濃度或量的電極，其為荷載細胞外分泌型細胞色素及酶的電極。
35.權利要求34所述的電極，其中上述細胞外分泌型細胞色素及上述酶通過高分子荷載。
36.權利要求34所述的電極，其中上述細胞外分泌型細胞色素與上述酶融合。
37.權利要求34所述的電極，其中上述電極含碳、金、鉬、或者鈀之任何。
38.用于進行樣品液中含的測定對象物的測定的傳感器， 上述傳感器至少包括(i)絕緣性的第1基板、( )上述第1基板上配置的第1及第2電極、(iii)上述第1電極上配置的試劑層、(iv)與上述第1電極或上述試劑層、及上述第2電極接觸的樣品液保持部，上述試劑層含細胞外分泌型細胞色素，上述試劑層或上述樣品液保持部之任何配置有酶。
39.權利要求38所述的傳感器，其中上述第1及第2電極之任何含碳、金、鉬、或者鈀之任何。
40.權利要求38所述的傳感器，其中上述第2電極是氧化還原性的電極。
41.權利要求40所述的傳感器，其中上述第2電極是Ag/AgCl。
42.權利要求38所述的傳感器，其中上述試劑層僅配置在上述第1電極上。
43.權利要求38所述的傳感器，其中上述細胞外分泌型細胞色素與上述酶融合。
44.權利要求38所述的傳感器，其中測定中使用的，相對于上述酶的上述細胞外分泌型細胞色素的量小于100倍。
45.權利要求38所述的傳感器，其中上述細胞外分泌型細胞色素是屬于絲狀菌的菌、 曲霉屬的菌、土曲霉(Aspergillus terreus)、或者米曲霉(Aspergillus oryzae)之任何來源的。
46.權利要求38所述的傳感器，其中上述細胞外分泌型細胞色素是葡萄糖氧化還原酶用電子介質，其包括以下的(a)、(b)或(c)的多肽(a)包括SEQID NO :2或SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的多肽、(b)包括SEQID NO :2或SEQ ID NO 4的氨基酸序列中，1個或數個的氨基酸被取代、 缺失、插入或附加的氨基酸序列，且有電子介質功能的多肽、(c)包括與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列，且有電子介質功能的多肽。
47.權利要求43所述的傳感器，其中上述細胞外分泌型細胞色素與上述酶的融合體是在單一分子內有電子介質功能和底物的氧化功能的兩功能的融合體，其特征在于，在下述(a)、(b)及(c)之中有(a)及(b)、或者有(a)及(b)，并且在(a)和(b)之間有(c)(a)細胞外分泌型細胞色素的氨基酸序列、(b)葡萄糖氧化還原酶的氨基酸序列、(c)將(a)的氨基酸序列和(b)的氨基酸序列結合的接頭序列。
48.權利要求43所述的傳感器，其中上述細胞外分泌型細胞色素與上述酶的融合體是以下的(a)、(b)或(c)的多肽(a)包括SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO 27 或 SEQ ID NO 29 所示的氨基酸序列的多肽、(b)包括SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27 或 SEQ ID N0:29 中，1 個或數個的氨基酸被取代、缺失、插入或附加的氨基酸序列，且有電子介質功能及葡萄糖氧化功能的多肽、(c)包括與SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO 27 或 SEQ ID NO 29 的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列，且有電子介質功能及葡萄糖氧化功能的多肽。
49.權利要求38所述的傳感器，其中上述酶是氧化還原酶或脫氫酶。
50.權利要求38所述的傳感器，其中上述酶是作用于葡萄糖的酶。
51.權利要求38所述的傳感器，其中上述酶是黃素腺嘌呤二核苷酸依賴型。
52.權利要求38所述的傳感器，其中上述酶是黃素腺嘌呤二核苷酸依賴型葡萄糖脫氫酶。
53.權利要求38所述的傳感器，其中上述測定對象物是葡萄糖。
54.權利要求38所述的傳感器，其還包括(ν)有切口部的第2基板，上述第2基板形成上述樣品液保持部的至少一部分。
55.權利要求M所述的傳感器，其中上述切口部的形狀是矩形、或者U字型。
56.權利要求M所述的傳感器，其還包括(vi)第3基板，上述第3基板形成上述樣品液保持部的至少一部分。
57.權利要求38所述的傳感器，其中可測定的上述測定對象物的濃度大于5mM。
全文摘要
課題是提供與酶親和性高的電子介質及融合體、使用細胞外分泌型細胞色素和酶的測定方法、電極、及傳感器。本發(fā)明涉及包括細胞外分泌型細胞色素的葡萄糖氧化還原酶用電子介質、將該電子介質與葡萄糖氧化還原酶融合的融合體、含該電子介質或融合體的葡萄糖測定用組合物、以及新穎的編碼細胞外分泌型細胞色素的基因、使用細胞外分泌型細胞色素和酶的測定方法、電極、及傳感器。
文檔編號C12Q1/32GK102559846SQ20111042094
公開日2012年7月11日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權日2009年4月30日
發(fā)明者小村啟悟, 本田通濟, 竹中涼 申請人:池田食研株式會社