專利名稱：紫貽貝g型溶菌酶基因及其重組蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及溶菌酶，具體涉及一種紫貽貝G型溶菌酶基因及其重組蛋白和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
溶菌酶(Lysozyme，EC 3.2.1.17)是無脊椎動物體內(nèi)非常重要的非特異免疫因子之一，它主要通過切斷肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的P -1，4糖苷鍵之間的聯(lián)結(jié)，破壞肽聚糖支架，使細(xì)胞脹裂從而引起細(xì)菌裂解。溶菌酶在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中不僅能直接殺死細(xì)菌，還可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)其他免疫因子的合成與分泌。溶菌酶按照其來源分為六類:C (chicken)型，G (goose)型，I (invertebrate)型，植物型，細(xì)菌型和T4嗤菌體型溶菌酶。動物界的溶菌酶包括前三種類型。C型溶菌酶大都來自于脊椎動物和節(jié)肢動物；6型溶菌酶主要存在于哺乳動物、鳥類和魚類中；而I型溶菌酶只存在于無脊椎動物中。溶菌酶的主要功能是抗菌作用，早期研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)C型溶菌酶通常只能溶解革蘭氏陽性菌。最近研究發(fā)現(xiàn)，美洲牡蠣和文蛤I型溶菌酶，以及櫛孔扇貝、牙鲆、大黃魚、斜帶石斑魚和大菱鲆G型溶菌酶都具有溶解革蘭氏陰性菌的功能。由于G型溶菌酶對各種病原菌具有較好的抗菌作用，并且具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，因此在開發(fā)作為水產(chǎn)飼料添加劑和水產(chǎn)品保鮮劑方面具有很好的應(yīng)用前景。在海洋貝類中，僅在海灣扇貝和櫛孔扇貝體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 G型溶菌酶，并進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。目前國內(nèi)外關(guān)于紫貽貝G型溶菌酶及其抗菌活性的研究較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種紫貽貝G型溶菌酶基因及其重組蛋白和應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:一種紫貽貝G型溶菌酶基因，G型溶菌酶基因如序列表SEQ ID N0.1中的堿基序列所示。 紫貽貝G型溶菌酶基因編碼蛋白，G型溶菌酶基因編碼蛋白如序列表SEQ ID N0.2中的氨基酸序列所示。紫貽貝G型溶菌酶基因重組蛋白的應(yīng)用，所述G型溶菌酶基因重組表達(dá)產(chǎn)物可制備為抗菌藥物、水產(chǎn)品保鮮劑或水產(chǎn)飼料添加劑。所述G型溶菌酶基因重組表達(dá)產(chǎn)物可作為制備革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌的抑菌藥物。紫貽貝重組溶菌酶對革蘭氏陽性菌為巴氏葡萄球菌或金黃色葡萄球菌；革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、陰溝腸桿菌、惡臭假單胞菌、奇異變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌或副溶血弧菌。所述G型溶菌酶基因重組表達(dá)產(chǎn)物可作為制備副溶血弧菌、惡臭假單胞菌和巴氏葡萄球菌的抑菌藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明紫貽貝G型溶菌酶，包括從感染病菌的紫貽貝中提取總RNA、mRNA純化、cDNA模板溶液制備、G型溶菌酶基因篩選、基因克隆、重組質(zhì)粒構(gòu)建、重組基因表達(dá)和重組蛋白純化步驟得到該G型溶菌酶，該G型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ IDN0.2所示；該G型溶菌酶屬于一類新穎的紫貽貝溶菌酶，對海洋來源的多種革蘭氏陽性和陰性病原微生物均具有很強(qiáng)的抑制活性，具有開發(fā)為食品保鮮劑、遺傳選育和飼料添加劑等方面的應(yīng)用價值；該G型溶菌酶的制備方法，通過總RNA提取、mRNA純化、cDNA模板溶液制備、G型溶菌酶基因篩選、基因克隆、重組質(zhì)粒構(gòu)建、重組基因表達(dá)和重組蛋白純化步驟，能得到純度較高的重組紫貽貝G型溶菌酶。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。本發(fā)明從紫貽貝中克隆到G型溶菌酶的全長cDNA序列，實(shí)現(xiàn)其重組表達(dá)并測定其抗菌譜和最小抑菌濃度，為水產(chǎn)動物的病害防治、基因輔助選育及進(jìn)一步開發(fā)為水產(chǎn)飼料添加劑和水產(chǎn)品保鮮劑奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:紫貽貝G型溶菌酶，包括從感染病菌的紫貽貝提取總RNA、mRNA純化、cDNA模板制備、G型溶菌酶基因篩選、基因克隆、重組質(zhì)粒構(gòu)建、重組基因表達(dá)和重組蛋白純化步驟得到該G型溶菌酶，該G型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。紫貽貝G型溶菌酶的制備方法，包括下述步驟:1)總RNA提取:用Trizol試劑從感染鰻弧菌的紫貽貝血淋巴中提取總RNA，存于_80°C備用；提取方法依Invitrogen公司的Trizol試劑說明書進(jìn)行；2)mRNA純化:用Oligotex mRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA ;純化方法依據(jù)QIAGENE公司的Oligotex mRNA純化試劑盒說明書進(jìn)行；3) cDNA模板制備:用cDNA Synthesis Kit試劑盒(購于Stratagene公司)將上述mRNA逆轉(zhuǎn)錄并酶切為酶切片段，具體操作方法依試劑盒說明書進(jìn)行:包括雙鏈cDNA經(jīng)末端補(bǔ)平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、Xho I內(nèi)切酶酶切等，用QIAEX II AgaroseGel Extraction Kit純化試劑盒(購于QIAGEN公司)對大于IOObp的酶切片段進(jìn)行回收，回收的酶切片段與Un1-ZAP XR vector載體(購于Invetrogen公司)連接,得到是cDNA質(zhì)粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit 試劑盒(購于 Stratagene 公司)對cDNA質(zhì)粒進(jìn)行噬菌體包裝、滴度測定、噬菌體文庫擴(kuò)增，擴(kuò)增后的噬菌體文庫加入體積百分終濃度為7%的二甲基亞砜(DMSO)，得到含G型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于_80°C ；具體包裝、測定和擴(kuò)增方法依試劑盒說明書進(jìn)行；4)基因克隆:對上述含G型溶菌酶基因的cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增的上游引物的核苷酸序列為:(正向引物序列:5’-AAATCCATTCTGGTTTCCCTC-3’，反向引物的核苷酸序列為:5’ -CGATGAATTAACCACTGGG-3’，)PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒(購于上海中科開瑞生物芯片公司)進(jìn)行回收和純化得到PCR純化產(chǎn)物，將所述PCR純化產(chǎn)物與PMD-18T載體(購于大連寶生物工程有限公司)連接得到克隆質(zhì)粒，克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOPlOF感受態(tài)細(xì)胞(購于北京全氏金生物技術(shù)有限公司)中，挑選陽性克隆質(zhì)粒提取，得到G型溶菌酶基因的克隆質(zhì)粒；3’端PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為:10XPCR緩沖液2.5 y l、25mM的氯化鎂溶液1.0iil、2.5mM的dNTP 2.0 yl、10 y M的所述正向引物溶液1 μl、10 μ M的通用引物17溶液1 U 1、濃度為5U/ U I的Taq DNA聚合酶0.2 U 1，所述cDNA模板溶液I Ul，用PCR水定容到25 u I ;反應(yīng)在ABI Veriti (購于ABI公司)中進(jìn)行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán):94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn)行34個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；5’端PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為:10XPCR反應(yīng)緩沖液
2.5iil、25mM的氯化鎂溶液1.0iil、2.5mM的dNTP溶液2.0 yl、10 y M的所述反向引物溶液1111、101^的通用引物了3溶液1111、濃度為5U/iU的Taq DNA聚合酶0.2 yl，所述cDNA模板溶液Iu 1，用PCR水定容到25 iil，反應(yīng)在ABI Veriti PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán):94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn)行34個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；上述PCR緩沖溶液、dNTP、PCR水、Taq DNA聚合酶均購自Promega公司，通用引物T7、通用引物T3購自上海生工科技有限公司。5)重組質(zhì)粒構(gòu)建:對G型溶菌酶基因的克隆質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)正向引物為含有Nde I酶切位點(diǎn)的 核苷酸序列(5 ’ -CATATGATAGATTATAACTGCCATGG-3 ’，其中劃線上的序列表示Nde I酶切位點(diǎn))，反向引物為含Xho I酶切位點(diǎn)和6個His純化標(biāo)簽的5，-CTCGAGCTA|GTGGTGGTGGTGGTGGTG| CCAATTATAACGATGAA-3'下劃線為 Xho I 酶切位點(diǎn)，
方框?yàn)镠is純化標(biāo)簽)核苷酸序；將擴(kuò)增片段純化回收，導(dǎo)入PMD18-T simple (購于大連寶生物工程有限公司)載體，構(gòu)建亞克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞(購于北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，篩選陽性亞克隆質(zhì)粒，提取陽性亞克隆質(zhì)粒，用Nde I和Xho I(均購于NEB公司)雙酶切亞克隆質(zhì)粒，用膠回收純化試劑盒(大連寶生物工程有限公司)對酶切產(chǎn)生的目的片段純化回收，得到編碼重組蛋白的G型溶菌酶重組基因，測序該G型溶菌酶重組基因，該G型溶菌酶重組基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示，將該G型溶菌酶重組基因?qū)虢?jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pET_21a(購于Novagen公司)，得到重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒構(gòu)建具體依《分子克隆第三版》操作方法:擴(kuò)增反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán):94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共進(jìn)行30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；6)紫貽貝G型溶菌酶重組基因表達(dá):將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21 (DE3) -plysS (北京全式金生物技術(shù)有限公司)，篩選陽性重組質(zhì)粒，測序確認(rèn)，挑取單克隆重組質(zhì)粒,將單克隆重組質(zhì)粒接種于200ml LB(上海生工科技有限公司)培養(yǎng)基中，220rpm，37°C培養(yǎng)至0D_ = 0.5-0.7，加入異丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使終濃度達(dá)到0.6mmol/ml，繼續(xù)培養(yǎng)5小時，4°C，5000rpm,離心10分鐘，收集菌液；7)重組蛋白純化:對上述菌液超聲破碎、離心獲得包涵體，并對包涵體進(jìn)行洗滌、溶解、鎳柱親和層析純化。最后對重組蛋白進(jìn)行透析復(fù)性得到具有抗菌活性的重組蛋白，即本發(fā)明的紫貽貝G型溶菌酶，經(jīng)測序，該重組蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示，具體純化方法依蛋白純化試劑盒的說明書操作實(shí)施例紫貽貝G型溶菌酶的制備:一、用Trizol試劑從感染鰻弧菌的紫貽貝血淋巴中提取總RNA，得到總RNA，提取方法依Invitrogen公司的Trizol試劑說明書進(jìn)行:取紫貽貝仔血淋巴50ml, 2000g離心10分鐘，棄上清，向沉淀細(xì)胞中加入20ml的!TRIZOL (Invitrogen),用高速分散器將細(xì)胞分散，室溫下劇烈震蕩10秒；加入4ml氯仿，劇烈震蕩30秒；4°C 10，OOOg高速離心10分鐘；吸取上清液于一個新離心管中，加入冰浴過的等體積異丙醇(約15ml)，置于-20°C靜置I小時以上；4°C 10，OOOg高速離心10分鐘；小心棄去上清液；用5ml 70%的乙醇清洗沉淀；4 0C 10，OOOg高速離心10分鐘，小心棄去上清液；真空干燥5分鐘，用約600 ill無RNA酶水溶解RNA，待完全溶解后儲存于_80°C備用。二、用Oligotex mRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA,具體純化方法依QIAGENE公司的Oligotex mRNA純化試劑盒說明書進(jìn)行:包括在37°C水浴加熱Oligotex懸液，震蕩混勻，室溫放置；70°C水浴加熱OEB緩沖液；向500 ill總RNA溶液(RNA含量約為2mg)中加入:650 ill的OBB緩沖液，135 U I的Oligotex懸液，650 yl無RNA酶水，70°C加熱體系3分鐘；取出反應(yīng)體系后,室溫下放置10分鐘，15，OOOg離心2分鐘，小心吸走上清液，用600 ill的0W2重懸Oligotex-mRNA沉淀，劇烈震蕩。然后將懸濁液移入放在1.5ml離心管中的離心柱內(nèi)，15，OOOg離心I分鐘，將離心柱轉(zhuǎn)移到一個新的1.5ml離心管中，加入600 u I的0W2，15，OOOg離心I分鐘，將進(jìn)入離心管的液體丟棄，將離心柱轉(zhuǎn)移到另一新的1.5ml離心管中；向離心柱中加入50ii I已經(jīng)加熱到70°C的OEB緩沖液，輕輕混勻，15，OOOg離心I分鐘；向離心柱再加入50 ill的OEB緩沖液，混勻后15，OOOg離心I分鐘；回收離心管中的mRNA溶液約100 u I。三、用cDNA Synthesis Kit試劑盒將上述mRNA逆轉(zhuǎn)錄并酶切為酶切片段，具體操作依試劑盒說明書進(jìn)行:包括雙鏈cDNA末端補(bǔ)平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、Xho I內(nèi)切酶酶切等，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit純化試劑盒對大于IOObp的酶切片段進(jìn)行回收，回收的酶切片段與Un1-ZAP XR vector載體連接，得到cDNA質(zhì)粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit試劑盒對cDNA質(zhì)粒進(jìn)行噬菌體包裝、滴度測定和噬菌體文庫擴(kuò)增，具體方法參照說明書進(jìn)行，擴(kuò)增后的文庫加入終濃度為7%的二甲基亞砜溶液，得到cDNA模板溶液，存于_80°C備用。逆轉(zhuǎn)錄方法包括一鏈cDNA合成:在無RNA酶的200 U I離心管中依次加入5 X逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液10 ill與2.5mM的dNTP 8.5 U I試劑混勻，然后加入30 yl的poly (A)引物和RNA (5 V- g),混勻，室溫下放置10分鐘后，向體系中加入1.1的一鏈合成酶StrataScriptRT(50U/iU)，終體積達(dá)到50iU，輕輕混勻反應(yīng)體系，離心數(shù)秒，42°C溫育I小時。二鏈合成:在冰上依次向含有一鏈cDNA的離心管中加入需用反應(yīng)物反應(yīng)，再向反應(yīng)體系中加入2 u I核糖核酸酶H (1.5U/u l),llu IDNA聚合酶I (9.0U/ u I)，輕輕混勻反應(yīng)體系，離心數(shù)秒，16°C放置2.5小時后立即將反應(yīng)體系置于冰上。補(bǔ)平cDNA末端:向二鏈合成體系中加入需用反應(yīng)物，快速震蕩反應(yīng)體系離心后，于72°C反應(yīng)30分鐘；加入200 ill酚-氯仿[I: I (v/v)]，震蕩混勻體系，室溫下高速離心2分鐘，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中；加入等體積的氯仿，震蕩混勻，室溫下高速離心2分鐘，然后轉(zhuǎn)移上清至新管中；加入下列試劑使cDNA沉淀，并震蕩體系:20u I 3M醋酸鈉，400iil的100% (v/v)酒精，_20°C沉淀過夜；4°C高速離心60分鐘，小心棄去 上清，保留沉淀；加入500 ill的70%乙醇輕輕洗滌沉淀，室溫高速離心2分鐘；輕輕吸去乙醇，在真空離心機(jī)中干燥沉淀；用9 含有EcoR I接頭的溶液溶解沉淀并于4°C放置至少30分鐘。EcoR I接頭的連接:向體系中加入下列成分:1 U I10X連接酶緩沖液，I U I IOmM rATP，I u I T4DNA連接酶(4U/ U I)，離心后8°C放置過夜；700C 30分鐘滅活連接酶。磷酸化EcoR I末端:離心反應(yīng)物2秒，室溫放置5分鐘冷卻，加入下列反應(yīng)物用于磷酸化接頭:10X連接酶緩沖液lyl，2iil IOmM ^了？，5111無菌水，2111T4多聚核苷酸激酶(5U/ u I)，37°C溫育30分鐘，70°C 30分鐘滅活激酶，離心2秒后室溫放置5分鐘冷卻。Xho I內(nèi)切酶酶切:向體系中加入下列成分:28 ill Xho I緩沖液，3 ill XhoI(40U/iil)，37°C 溫育 1.5 小時，加入 125 u I 的 100% (v/v)乙醇，_20°C 放置過夜，4°C 離心60分鐘，棄去上清，完全干燥沉淀，用50 u I雙蒸水溶解沉淀。cDNA片段回收方法:從濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠上將DNA帶切下，將大約250mg的膠塊放入1.5ml離心管中，加入相當(dāng)于3倍膠塊體積的QXl緩沖液，將QIAEX II劇烈震蕩30秒，充分混勻，向含有膠塊的QXl緩沖液中加入60 u I QIAEX II，50°C加熱10分鐘，溶解膠塊；每2分鐘震蕩一次，保持溶液始終為黃色；13，OOOrpm離心30秒，小心吸去上清液；用500 u I的QXl緩沖液清洗沉淀，重懸沉淀，13，OOOrpm離心30秒并小心吸去上清液；用500 ill PE緩沖液清洗沉淀2次，重懸沉淀，13，OOOrpm離心30秒，棄上清液，真空干燥15分鐘至沉淀變白，加入20 u I pH8.5的IOmM Tris-Cl溶液室溫下溶解5分鐘。cDNA與Un1-ZAP XR載體(Invetrogen)連接:在另一干凈的200 U I離心管中依次加入下列試劑:2.5iil重懸cDNA( > 100ng),10X連接酶緩沖液0.5 yl，0.5 IOmMrATP (pH7.5), 1.0u I Un1-ZAP XR 載體(lu g),0.5u I T4DNA 連接酶(4U/ u I)。12°C 放置過夜。噬菌體文庫的包裝:從_80°C冰箱中取出包裝蛋白，迅速用手握住融化，立即加入4 Ul重組cDNA，用微量移液器吸頭混勻體系(不要產(chǎn)生氣泡)，離心5秒，室溫(22°C )溫育2小時,加入500 ii I的SM緩沖液和20 u I氯仿,輕輕混勻反應(yīng)體系。快速離心數(shù)秒，沉淀蛋白碎片，轉(zhuǎn)移上清至新管中。包裝反應(yīng)的滴度測定:在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基(I升培養(yǎng)基含有氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，瓊脂粉15g，pH7.5)上將大腸桿菌菌株XLl-Blue MRF’劃線培養(yǎng)，37°C過夜培養(yǎng)；用LB液體培養(yǎng)基(I升培養(yǎng)基含有氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，pH7.5)培 養(yǎng)單克隆菌落，30°C，200rpm搖床培養(yǎng)過夜；4°C，IOOOg下離心10分鐘沉淀細(xì)菌。用25ml IOmM MgS04重懸細(xì)菌；用IOmM MgSO4重懸XLl_BlueMRF’細(xì)胞，使?jié)舛冗_(dá)到0D_ = 0.5 ;將包裝產(chǎn)物按下列比例與宿主菌混合:(I) I Ul包裝產(chǎn)物和200 u I濃度達(dá)到OD 600 = 0.5大腸桿菌XLl-Blue MRF’ ；(2)0.1u I包裝產(chǎn)物和200 u I濃度達(dá)到OD600 = 0.5大腸桿菌XLl-Blue MRF’ ；將混合體系置于37°C溫育15分鐘使噬菌體充分附著在宿主細(xì)胞表面；加入3ml融化狀態(tài)下約48°C的NYZ上層培養(yǎng)基(I升培養(yǎng)基含有氯化鈉5g，七水硫酸鎂2g, NZ胺10g，酵母提取物5g，瓊脂糖7g，pH7.5);迅速鋪在干燥預(yù)熱過的NYZ瓊脂培養(yǎng)基(I升培養(yǎng)基含有氯化鈉5g，七水硫酸鎂2g，NZ胺10g，酵母提取物5g，瓊脂粉15g，pH7.5)上，靜置10分鐘后，倒置于37°C過夜培養(yǎng)；8小時后可見噬菌斑；分別計(jì)數(shù)兩個平板的噬菌斑數(shù)目，計(jì)算其滴度(每毫升生長的噬菌斑數(shù)目，pfu/ml)。而后在30°C，200rpm條件下，用LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)XLl-Blue MRF’細(xì)胞50ml ;IOOOg離心宿主細(xì)胞10分鐘；用25ml IOmM硫酸鎂溶液重懸細(xì)胞，測定600納米可見光下菌液吸光度，然后用IOmM硫酸鎂將菌液稀釋至濃度為0D_ = 0.5 ;將含有大約5X104pfu噬菌體顆粒的懸濁液與600 u I濃度為OD6tltl = 0.5的XLl-Blue MRF’大腸桿菌混合，置于Falcon 2059聚丙烯管中，37°C溫育混合液15分鐘，使噬菌體充分附著在宿主菌表面；將混合液加入約48°C的6.5ml液態(tài)NZY上層培養(yǎng)基中，混勻后倒入新鮮的150mmNZY瓊脂糖培養(yǎng)基平板上，靜置平板十分鐘，倒轉(zhuǎn)平板置于37°C約8小時(噬菌斑直徑不超過2_);在每塊平板上倒入大約IOml SM緩沖液(I升緩沖液中含有5.8g氯化鈉，2.0g七水硫酸鎂，50.0ml IM Tris鹽酸[pH 7.5]，5.0ml 2% [w/v]白明膠)，4°C放置過夜；將所有平板上的SM緩沖液回收入新的聚丙烯管中，每塊平板再用2ml SM緩沖液清洗一次并回收上清液；向回收液中加入終濃度為5% (v/v)的氯仿,室溫下放置15分鐘,混勻，500g離心10分鐘去除細(xì)胞碎片，將上清液轉(zhuǎn)移至新聚丙烯管中，并重復(fù)步驟8、9至上清液澄清，加入終濃度為7% &八)01^0，儲存于801:。測定擴(kuò)增文庫滴度(方法同前)。四、cDNA模板溶液中溶菌酶基因的確認(rèn):用Exassist Helper Phage和SOLR菌株(均購于Stratagene公司)從Un1-ZAP XR載體上體外切割pBluescript卩遼菌粒(進(jìn)行體外切割；然后質(zhì)粒cDNA的大規(guī)模提取和測序分析獲得目的EST序列，對上述EST測序結(jié)果，用BLASTn和BLASTx程序分析，根據(jù)相似性分析結(jié)果尋找出溶菌酶基因片段。五、對上述含溶菌酶基因的cDNA模板溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增的(正向引物序列:5 ’ -AAATCCATTCTGGTTTCCCTC-3 ’，反向引物的核苷酸序列為:5’ -CGATGAATTAACCACTGGG-3’)，PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行回收和純化得到PCR純化產(chǎn)物，將所述PCR純化產(chǎn)物與pMD-18T載體連接得到克隆質(zhì)粒，克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10F感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性克隆質(zhì)粒提取，得到溶菌酶基因的克隆質(zhì)粒；3’端PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為:10 X PCR緩沖液2.5iil、25mM的氯化鎂溶液1.0iU、2.5mM的dNTP2.0iil、10iiM的正向引物IiUUOiiM的通用引物T71iil、濃度為5U/iU的Taq酶0.2iU，cDNA模板(文庫)lyl，用PCR水定容到25 ill ;反應(yīng)在ABI Veriti PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán):94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn)行34個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；5’端PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為:10XPCR緩沖溶液 2.5 ii l、25mM 的氯化鎂溶液 1.0ii 1、2.5mM 的 dNTP 溶液 2.0 y 1、10iiM 的反向引物溶液1.0 ill、IOii M的通用引物T3溶液lul、濃度為lU/iU的Taq酶0.2 iil，所述cDNA模板溶液I Ul，用PCR水定容到25 U 1，反應(yīng)在ABI Veriti PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán):94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn) 行34個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；六、對G型溶菌酶基因的克隆質(zhì)粒再進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，(擴(kuò)增反應(yīng)正向引物為含有Nde I酶切位點(diǎn)的核苷酸序列:5’-CATATGATAGATTATAACTGCCATGG-3’，反向引物為含Xho I酶切位點(diǎn)和6個His純化標(biāo)簽的核苷酸序列:5’ -CTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCAATTATAACGATGAA-3’);將擴(kuò)增片段純化回收，導(dǎo)入pMD18_T載體，構(gòu)建亞克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOPlOF'感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性亞克隆質(zhì)粒，提取陽性亞克隆質(zhì)粒，用Nde I和Xho I雙酶切亞克隆質(zhì)粒，用膠回收純化試劑盒對酶切產(chǎn)生的目的片段純化回收，得到編碼重組蛋白的G型溶菌酶重組基因，測序該G型溶菌酶重組基因，該G型溶菌酶重組基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示，將該G型溶菌酶重組基因?qū)虢?jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pET-21 (a)，得到重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒構(gòu)建具體依《分子克隆第三版》操作方法。擴(kuò)增反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán):94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共進(jìn)行30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；七、將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)plysS，(購于北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，篩選陽性重組質(zhì)粒，測序確認(rèn)，挑取單克隆重組質(zhì)粒，將單克隆重組質(zhì)粒接種于200ml LB液體培養(yǎng)基中，220rpm，37°C培養(yǎng)至OD6tltl = 0.5-0.7，加入IPTG，使終濃度達(dá)到0.6mM,繼續(xù)培養(yǎng)5h，4°C，5000rpm,離心10分鐘，收集菌液；八、對上述菌液超聲破碎、離心獲得包涵體，并對包涵體進(jìn)行洗滌、溶解、鎳柱親和層析純化。最后對重組蛋白進(jìn)行透析復(fù)性得到具有抗菌活性的重組蛋白，即本發(fā)明的紫貽貝G型溶菌酶，經(jīng)測序，該重組蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示；在收集的菌體沉淀中，加入適量的菌體裂解液(0.5M氯化鈉，IOmM Tris-HCl,0.5% Triton X-1OOpH
8.5)重懸沉淀，超聲波處理，條件為:300W，處理200次，每次5秒，間隔15秒；菌體裂解液在4°C下IOOOOrpm離心20分鐘收集包涵體；包涵體沉淀分別用洗液I (0.5M氯化鈉，IOmMTris-HCl, 0.5% Triton X_100，2M 尿素 pH 8.5)和洗液 II (0.5M 氯化鈉，IOmM Tris-HCl,0.5% Triton X-100，2%脫氧膽酸鈉pH 8.5)洗滌一次后用8M尿素溶液(20mM PBS，0.5M氯化鈉，SM尿素，20mM咪唑pH 7.4)溶解；經(jīng)鎳柱親和層析純化后的重組蛋白采用逐漸降低尿素濃度的方法進(jìn)行透析復(fù)性，透析緩沖液成分如下:100mM Tris-HCl，50mM氯化鈉，ImMEDTA, 2mM還原型谷胱甘肽，0.02mM氧化型谷胱甘肽，10 %甘油，I %甘氨酸，尿素(6M，4M，3M，2M，0M)，pH 9.2。.透析緩沖液依次降低尿素的濃度，每次于4°C透析12小時，最后在TBS緩沖液(50mM Tris_HCl，IOOmM氯化鈉，pH9.2)中透析兩次。重組蛋白濃度測定采用碧云天生物公司的BCA法測定蛋白濃度試劑盒(P0012)。具體操作依試劑盒說明書進(jìn)行:根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加I體積BCA試劑B (50: I)配制適量BCA工作液，充分混勻；完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10 ill用PBS稀釋至100 u 1，使終濃度為0.5mg/ml ;將標(biāo)準(zhǔn)品按0，1,2,4,8,12，16, 20 u I加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，用PBS溶液補(bǔ)足到20 U I ；加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中并用PBS補(bǔ)足到到20 u I ;各孔加入200 u I BCA工作液，37°C放置30分鐘；測定A562，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度為0.34mg/mL。G型溶菌酶基因的cDNA序列全長802bp，含有621bp的開放閱讀框，編碼206個氨基酸，5’非編碼區(qū)長121bp，3’非編碼區(qū)長60bp，有多聚腺苷酸尾巴。利用pET21(a)表達(dá)載體在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中重組表達(dá)了該蛋白，表達(dá)產(chǎn)物對多種革蘭氏陽性和陰性病原菌均有一定的抑制作用，其中對副溶血弧菌，惡臭假單胞菌和巴氏葡萄球菌的作用最為顯著，最小抑菌濃度均為 1.91-3.82 u mol/Lo`序列表SEQ ID N0.1acaacaagat ttcttacaga ggagaaatcc attctggttt ccctcatcgg aggtatcaacacaatttgaa gaacactaat tgttgtcagt tcagctgata attctcagaa gttaattttcaatggaaaat attttggtag ttcttgctgt attggtatca gttgaagcaa tagattataactgccatggt aacgtgacag ttctacatcc taaaggcatg gctcctaaat acggtggaatggcagcctcc catctcgcca tagaccagga tataagtgaa atagataaac gaaagtcctgttatcttaaa gcagcagcta ataactgcat acacccagct gtgattgccg gtattgctagcagagagtct cgtgctggaa agatgttgta cagtaccaat ggttgggctg atcatcaccatgcttatggc atcatgcagt gtgatgtccg agtcgatccg cttcaccct taccacaaaaactgcacatct tacctctggt acagctgtga tcatatcaac gccatgacaa aatatgtcttagtaccatac atagaggctg tgaaacaaaa actaccatca tggtcggatg ctcaagcaccacaaggtgga gtggcagcat acaattttgg agtacgcaat gttaggacct gggataaattagatattgga acaacgcata atgattatag taatgacgta attgcacagg cccagtggttaattcatcgt tataattggt agaatccgaa tatttaaaac agttcaaata aaaacgaaat
gaataaaaaa aaaaaaaaaa aa(a)序列特征 長度:802bp(122-742bp) 類型:堿基序列籲鏈型:單鏈 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性(b)分子類型:雙鏈DNA(c)假設(shè):否(d)反義:否(e)最初來源:紫貽貝 Mytilus galloprovincialis(f)特異性名稱:cDNA序列表SEQ ID N0.2Met Glu Asn He Leu Val Val Leu Ala Val Leu Val Ser Val GluAla He Asp Tyr Asn Cys His Gly Asn Val Thr Val Leu His ProLys Gly Met Ala Pro Lys Tyr Gly Gly Met Ala Ala Ser His LeuAla He Asp Gln Asp He Ser Glu He Asp Lys Arg Lys Ser CysTyr Leu Lys Ala Ala Ala Asn Asn Cys He His Pro Ala Val IleAla Gly He Ala Ser Arg Glu Ser Arg Ala Gly Lys Met Leu TyrSer Thr Asn Gly Trp Ala Asp His His His Ala Tyr Gly He MetGln Cys Asp Val Arg Val Asp Pro Leu His Pro Tyr His Lys AsnCys Thr Ser Tyr Leu Trp Tyr Ser Cys Asp His He Asn Ala MetThr Lys Tyr Val Leu Val Pro Tyr He Glu Ala Val Lys Gln LysLeu Pro Ser Trp Ser Asp Ala Gln Ala Pro Gln Gly Gly Val AlaAla Tyr Asn Phe Gly Val Arg Asn Val Arg Thr Trp Asp Lys LeuAsp He Gly Thr Thr His Asn Asp Tyr Ser Asn Asp Val He AlaGln Ala Gln Trp Leu He His Arg Tyr Asn Trp(a)序列特征 長度:2Ofea (17_206aa) 類型:氨基酸序列籲鏈型:單鏈 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性(b)分子類型:雙鏈DNA(C)假設(shè):否(d)反義:否(e)最初來源:紫貽貝 Mytilus galloprovincialis(f)特異性名稱:蛋白質(zhì)上述紫貽貝G型溶菌酶編碼蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，分子量為23.lkDa，等電點(diǎn)為7.18，其中編碼序列的1_16位氨基酸為信號肽序列，成熟肽為190個氨基酸，該成熟蛋白分子量為21.4kDa，理論等電點(diǎn)為8.21，有2個凈正電荷。
應(yīng)用例:將紫貽貝G型溶菌酶加入試管中制成濃度為0.34mg/mL作用液共9管，分別接種產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形桿菌、巴氏葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、陰溝腸桿菌及惡臭假單胞菌各5 iil，使每管最終菌液濃度約為5X105CFU/ml，培養(yǎng)24小時后，利用酶標(biāo)儀測定600nm的光吸收值，確定MIC值，得到如表I所示的結(jié)果，從表I中可以看出，紫貽貝G型溶菌酶對上述革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有效，說明本發(fā)明的紫貽貝G型溶菌酶具有廣譜抗菌性，且效果較好。其中產(chǎn)氣腸桿菌，奇異變形桿菌，陰溝腸桿菌，巴氏葡萄球菌及金黃色葡萄球菌37°C培養(yǎng)；副溶血弧菌，惡臭假單胞菌和溶藻弧菌28°C培養(yǎng)；具體步驟:調(diào)節(jié)各囷至OD6tl。為I后,稀釋1000倍備用。在96孔板中每孔中加入100 u I LB液體培養(yǎng)基，再在每一行第一個孔中加入100 u IG型溶菌酶，混勻后從第一個孔中吸出IOOiI I加到第二個空中，混勻后吸出IOOiI I加到第三個孔中，依此類推,第10個孔中吸出的IOOii I不再加到第11孔中。每行1-11孔中都接種稀釋好的相應(yīng)菌種5 i! 1，第12孔為只含培養(yǎng)基的對照。培養(yǎng)24h以上，測定吸光值，并計(jì)算相應(yīng)MIC。最終測得:紫貽貝G型溶菌酶對以上各種菌都有一定的抑制作用，其中對副溶血弧菌，惡臭假單胞菌和巴氏葡萄球菌的作用最為顯著，最小抑菌濃度均為1.91-3.82 u mol/Lo表1:紫貽貝G型溶菌酶抗菌素療效表
權(quán)利要求
1.一種紫貽貝G型溶菌酶基因，其特征在于:G型溶菌酶基因如序列表SEQ ID N0.1中的喊基序列所不。
2.—種權(quán)利要求1所述的紫貽貝G型溶菌酶基因編碼蛋白，其特征在于:G型溶菌酶基因編碼蛋白如序列表SEQ ID N0.2中的氨基酸序列所示。
3.—種權(quán)利要求1所述的紫貽貝G型溶菌酶基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于:所述G型溶菌酶基因重組表達(dá)產(chǎn)物可制備為抗菌藥物、水產(chǎn)品保鮮劑或水產(chǎn)飼料添加劑。
4.按權(quán)利要求3所述的紫貽貝G型溶菌酶基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于:所述G型溶菌酶基因重組表達(dá)產(chǎn)物可作為制備革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌的抑菌藥物。
5.按權(quán)利要求4所述的紫貽貝G型溶菌酶基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于:紫貽貝重組溶菌酶對革蘭氏陽性菌為巴氏葡萄球菌或金黃色葡萄球菌；革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、陰溝腸桿菌、惡臭假單胞菌、奇異變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌或副溶血弧菌。
6.按權(quán)利要求5所述的紫貽貝G型溶菌酶基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于:所述G型溶菌酶基因重組表達(dá)產(chǎn)物可作為制備副溶血弧菌、惡臭假單胞菌和巴氏葡萄球菌的抑菌藥物。`
全文摘要
本發(fā)明涉及溶菌酶，具體涉及一種紫貽貝G型溶菌酶基因及其重組蛋白和應(yīng)用。G型溶菌酶基因如序列表SEQ ID NO.1中的堿基序列所示。所述G型溶菌酶基因重組表達(dá)產(chǎn)物可制備為抗菌藥物、水產(chǎn)品保鮮劑或水產(chǎn)飼料添加劑。本發(fā)明紫貽貝G型溶菌酶，包括從感染病菌的紫貽貝中提取總RNA、mRNA純化、cDNA模板溶液制備、G型溶菌酶基因篩選、基因克隆、重組質(zhì)粒構(gòu)建、重組基因表達(dá)和重組蛋白純化步驟得到該G型溶菌酶，該G型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；該G型溶菌酶屬于一類新穎的紫貽貝溶菌酶，對海洋來源的多種革蘭氏陽性和陰性病原微生物均具有很強(qiáng)的抑制活性。
文檔編號C12N9/36GK103160526SQ201110421428
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者王清, 吳惠豐, 趙建民, 張林寶 申請人:中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所