專利名稱：一種適合Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的低血清培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞無(wú)血清或低血清培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是關(guān)于一種適合Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的低血清培養(yǎng)基，用于VeiO細(xì)胞低血清培養(yǎng)及病毒的增殖。2.背景技術(shù)
Veix)細(xì)胞是世界衛(wèi)生組織和我國(guó)生物制品規(guī)程認(rèn)可的生產(chǎn)疫苗的細(xì)胞系，它具有來(lái)源方便，生物安全性高，對(duì)多種病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高等優(yōu)點(diǎn)。普通的Vero細(xì)胞培養(yǎng)基中使用終濃度10% (體積)的小牛血清。但是血清所含的化學(xué)成分不確定，每個(gè)批次之間也存在著差異，同時(shí)血清的價(jià)格昂貴，還容易引起細(xì)菌、真菌、病毒和支原體污染；此外，血清中大量成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)會(huì)給疫苗、細(xì)胞因子和單克隆抗體等生物制品的分離純化帶來(lái)很大的困難。
因此，盡量不用或少用血清成為VeiO細(xì)胞培養(yǎng)的趨勢(shì)?，F(xiàn)有技術(shù)常通過(guò)添加牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等動(dòng)物源成分，來(lái)降低血清的量。但是動(dòng)物源成分的蛋白質(zhì)對(duì)生物制品(如疫苗)的安全性有很大影響。發(fā)明人研制出一種Veix)細(xì)胞低血清培養(yǎng)基，既能夠使細(xì)胞生長(zhǎng)良好，形態(tài)正常，又減少了污染，提高細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的穩(wěn)定性，減少后期純化工藝，降低生產(chǎn)成本。3.發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服VeiO細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)中必須使用高含量小牛血清才能促進(jìn)生長(zhǎng)、安全性差的缺點(diǎn)，提供一種新的低血清培養(yǎng)基。
這種培養(yǎng)基在DMEM(購(gòu)自HyClone公司)作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的條件下，在原有10%小牛血清的基礎(chǔ)上，將血清濃度降低到2%，再在培養(yǎng)基中添加2-10g/L的大豆植物水解蛋白，20-100 μ g/L的表皮生長(zhǎng)因子，25-50nM的亞硒酸鈉，2_8mM的谷氨酰胺，50-200 μ M的檸檬酸鐵，50-200 μ M的維生素C，150-300 μ M的乙醇胺，β -巰基乙醇0-50 μ Μ，丙酮酸鈉0.5_2mM。
與通過(guò)引入動(dòng)物來(lái)源組分降低血清用量的培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明研制的低血清培養(yǎng)基，引入的是植物源的蛋白質(zhì)-大豆植物水解蛋白，重組表皮生長(zhǎng)因子和一些化學(xué)合成物質(zhì)。大豆植物水解蛋白是一種超濾、不含動(dòng)物組分培養(yǎng)基添加物，它是由高度優(yōu)化的消化過(guò)程生產(chǎn)而來(lái)的，在生產(chǎn)中使用了獨(dú)特的混合酶，含有15種氨基酸成分。重組表皮生長(zhǎng)因子和其他添加成分的來(lái)源明確 ，成分均一。使用這些成分替代動(dòng)物源的成分能夠促進(jìn)VeiO細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，本發(fā)明的Veix)細(xì)胞低血清培養(yǎng)基不產(chǎn)生伴隨蛋白成分的副作用，安全性好。本發(fā)明研制此，本發(fā)明的VeiO細(xì)胞低血清培養(yǎng)基不產(chǎn)生伴隨蛋白成分的副作用，安全性好。本發(fā)明研制的低血清培養(yǎng)基與常規(guī)培養(yǎng)的10%小牛血清相比形態(tài)相似，減少了污染，有利于細(xì)胞下游產(chǎn)品的分離、安全性好；與商用的無(wú)血清培養(yǎng)基相比，降低了成本，適于用作生產(chǎn)疫苗等生物制品的病毒宿主、表達(dá)載體的培養(yǎng)。4.


圖1是具體實(shí)施方式
二中與10%小牛血清比較的Vero細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)圖片，圖2是具體實(shí)施方式
二中自制低血清培養(yǎng)基Vero細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)圖片，圖3是具體實(shí)施方式
二中與商用無(wú)血清相比VeiO細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)圖片。5.具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述:
實(shí)施例1:
本發(fā)明由5%小牛血清，大豆植物水解蛋白(￥組分)58/1，表皮生長(zhǎng)因子2(^8/1，谷氨酰胺2mM組成，β -巰基乙醇30 μ M0
本實(shí)施方式降低了常規(guī)培養(yǎng)使用的小牛血清的量，采用大豆植物水解蛋白，其成本低于使用常規(guī)培養(yǎng)基，并同時(shí)解決了因降低小牛血清的使用而造成的細(xì)胞過(guò)早死亡，形態(tài)不飽和的問(wèn)題。
實(shí)施例2:
本發(fā)明由2%小牛血清，大豆植物水解蛋白(V組分)5g/L，表皮生長(zhǎng)因子60μ g/L,谷氨酰胺4mM，亞硒酸鈉50nM，檸檬酸鐵100 μ Μ，維生素C 100 μ Μ，乙醇胺200 μ M組成，β -巰基乙醇30 μ Μ，丙酮酸鈉ImM。
本實(shí)施方式進(jìn)一步降低血清的量，增加植物水解蛋白和表皮生長(zhǎng)因子，增加了細(xì)胞的密度，提高了比生長(zhǎng)速率，從而提高了醫(yī)藥領(lǐng)域的疫苗產(chǎn)量。
配制方法:
I)大豆植物水解蛋白母液的配制在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下使用大豆植物水解蛋白用于基本生長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)，需要使用濃·縮且消毒的儲(chǔ)存液。在我們實(shí)驗(yàn)室以100g/L的濃度作為儲(chǔ)存液。稱取IOg大豆植物水解蛋白粉末，將其溶解在IOOml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，完全溶解后用0.22 μ m的無(wú)蛋白結(jié)合的注射器式過(guò)濾器進(jìn)行消毒。如果在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不易溶解，可以在過(guò)濾前將溶液置于37°C的培養(yǎng)箱中保持大約30分鐘。然后貼上標(biāo)簽，放在4°C冰箱保存，備用。
2)表皮生長(zhǎng)因子的配制將表皮生長(zhǎng)因子溶解在IOmM的醋酸中，用0.22mm的過(guò)濾器過(guò)濾除菌，貼上標(biāo)簽，放在-20°C，至少能夠保存兩年。必要的情況下分裝成小管，使用時(shí)盡量避免反復(fù)凍融。
3)谷氨酰胺的配制稱取2.922g谷氨酰胺，溶解在IOOml三蒸水中，用0.22mm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，用高壓滅菌后的5ml離心管分裝，貼上標(biāo)簽，-20°C保存。
4)培養(yǎng)基的配制首先在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入2%的小牛血清，再分別加入大豆植物水解蛋白、表皮生長(zhǎng)因子、谷氨酰胺、維生素C、檸檬酸鐵、乙醇胺和亞硒酸鈉，調(diào)節(jié)PH為7.2-7.4，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容至終體積，于2 V _8°C保存。
權(quán)利要求
1.一種適合Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的低血清培養(yǎng)基，其特征在于以DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入2ml的小牛血清，然后加入5g/L的大豆植物水解蛋白，60 μ g/L的表皮生長(zhǎng)因子，30nM的亞硒酸鈉，4mM 的谷氨酰胺，100 μ M的檸檬酸鐵，100 μ M的維生素C，200 μ M的乙醇胺，巰基乙醇30μΜ，丙酮酸鈉1禮。請(qǐng)求對(duì)該新型低血清培養(yǎng)基的配方進(jìn)行專利保護(hù)。
全文摘要
本發(fā)明研制了一種適合Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的低血清培養(yǎng)基，將常規(guī)培養(yǎng)小牛血清用量由10％(V組分)降至2％，并且將常規(guī)添加的動(dòng)物源成分替換成植物源成分和重組蛋白。該低血清培養(yǎng)基降低血清的用量，不但降低了成本，而且減小培養(yǎng)基中血清攜帶外源病原菌污染的可能，同時(shí)減少了血清中大量的雜蛋白，利于下游產(chǎn)品的分離純化；用植物水解蛋白和重組表皮生長(zhǎng)因子替代動(dòng)物源的成分，降低動(dòng)物源成分的副作用，提高了生物制品的安全性。本發(fā)明研制的培養(yǎng)基不但使Vero細(xì)胞生長(zhǎng)良好，而且降低成本，減少外源病原菌污染，減少后期純化工藝，提高細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的穩(wěn)定性，為以Vero細(xì)胞為病毒宿主或表達(dá)載體的生物制品的生產(chǎn)提供了一種優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)基。
文檔編號(hào)C12N5/071GK103160458SQ20111042185
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者湯承, 岳華, 蘇曉蕊 申請(qǐng)人:西南民族大學(xué)