專利名稱：針對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的分子檢測(cè)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種針對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的分子檢測(cè)方法及其應(yīng)用，屬于作物病害診斷和病原菌鑒定的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由鐮刀菌(Fusarium spp.)引起的小麥赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是一種廣泛流行的世界性病害，主要發(fā)生于溫暖濕潤地區(qū)，是影響小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的重要因素之一。19世紀(jì)90年代以來，北美、歐洲、亞洲等地大麥、小麥赤霉病災(zāi)情嚴(yán)重。我國南方長江中下游冬麥區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，隨著全球性氣候變暖、耕作制度以及耕作方式的改變，小麥赤霉病正向黃淮麥區(qū)、北方麥區(qū)以及西南和西北麥區(qū)擴(kuò)展(Ma等，2008)，幾乎蔓延到所有小麥種植區(qū)。2003年，長江中下游地區(qū)60-80%的麥區(qū)感染赤霉病，減產(chǎn)超過20%。2005 年，江蘇省赤霉病的發(fā)生面積為1800萬畝左右，占全省總種植面積的72%。全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心預(yù)報(bào)2011年赤霉病在全國流行面積為6500萬畝。小麥赤霉病的發(fā)生與流行還帶來巨大的食品安全性隱患。鐮刀菌可以產(chǎn)生單端孢霉烯毒素(trichothecene)，人畜食用受赤霉病真菌毒素污染的面粉會(huì)發(fā)生嘔吐、腹瀉及食欲不振等急、慢性中毒癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡(陸維忠等，2001)。據(jù)美國估計(jì)，因此類毒素污染所造成的直接經(jīng)濟(jì)損失僅1991 1996年間就高達(dá)三億美元。我國、歐盟和美國、加拿大均要求面粉、面包、餅干等食品中DON毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)為1000 μ g/kg(Ippm) (Buerstmayr等，2009 ;GB 163四_1996)。因此，明確我國小麥赤霉病致病菌的種類與產(chǎn)毒類型，對(duì)開展小麥赤霉病防治與抗病育種都有重要的實(shí)踐意義。自20世紀(jì)40年代中國首次報(bào)道小麥赤霉病以來，國內(nèi)外研究認(rèn)為，禾谷鐮刀菌 (Fusarium graminearum Schwabe)是小麥赤霉病的主要致病菌之一，也是中國小麥赤霉病的優(yōu)勢(shì)致病菌。近年來的研究表明，F(xiàn). graminearum是一個(gè)含有許多特定種系的復(fù)合種 (Fg Complex)，0’ Donnell通過系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析，將FgComplex劃分成13個(gè)特定的正式命名的種。根據(jù)該項(xiàng)研究結(jié)果，目前中國小麥赤霉病的主要致病菌為禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)和亞細(xì)亞鐮刀菌(Fusariumasiaticum)。其中亞細(xì)亞鐮刀菌在長江中下游麥區(qū)、南方麥區(qū)和西南麥區(qū)均為優(yōu)勢(shì)致病菌，并且不斷向黃淮麥區(qū)、北方麥區(qū)遷移(aiang， 2010)。研究還表明，產(chǎn)生3AD0N毒素的亞細(xì)亞鐮刀菌群日益擴(kuò)展，并具有更強(qiáng)的致病力，危害性更大(aiang，2oio)。因此，快速、準(zhǔn)確鑒定檢測(cè)亞細(xì)亞鐮刀菌，有利于針對(duì)性地加強(qiáng)對(duì)小麥赤霉病的防治。傳統(tǒng)的鐮刀菌鑒定方法主要通過形態(tài)學(xué)，如大分子生孢子、小分生孢子、原膜孢子等的形態(tài)來鑒定。但形態(tài)學(xué)鑒定方法繁瑣，沒有統(tǒng)一的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，并且需要豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。隨著遺傳與分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，營養(yǎng)體親合群(Vegetative compatibility group VCG)，分子標(biāo)記也成為鑒定鐮刀菌的主要技術(shù)手段。與常規(guī)的形態(tài)鑒定法相比，分子標(biāo)記能準(zhǔn)確、快速地從混合群體中鑒定出不同病菌類型，為準(zhǔn)確、快速分析病菌的群體分布、特點(diǎn)和鑒定診斷提供新方法。
Nicholson等(1998)找到了一對(duì)鑒定禾谷鐮刀菌Fg Complex的標(biāo)記Fgl6F/R，但在擴(kuò)增來自不同地區(qū)的禾谷鐮刀菌株時(shí)得到6種PCR產(chǎn)物，不能有效地區(qū)分菌株的種類。 Qu等Q008)利用該對(duì)引物，并結(jié)合AFLP標(biāo)記，鑒定出Fgl6F/R擴(kuò)增類型5和AFLP擴(kuò)增類型B的菌株為亞細(xì)亞鐮刀菌。由于AFLP標(biāo)記操作繁瑣，且涉及到酶切和兩次PCR擴(kuò)增等步驟，難以在實(shí)際檢測(cè)中推廣應(yīng)用。Yang等O008)利用氨連接酶基因的單核苷酸多態(tài)性 (SNP)設(shè)計(jì)了 4個(gè)引物試圖來區(qū)分Fg complex中的七個(gè)種，其中鑒定亞細(xì)亞鐮刀菌需要擴(kuò)增出536bp、388bp、311bp、162bp等4條不同大小的條帶，并且還需要通過條帶的強(qiáng)弱進(jìn)行輔助判斷，并不能真正滿足快速簡(jiǎn)易檢測(cè)的要求。目前，一種針對(duì)所有亞細(xì)亞鐮刀菌具有特異性的引物，未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的鑒定方法過于復(fù)雜，或只能針對(duì)個(gè)別亞細(xì)亞鐮刀菌，在預(yù)防亞細(xì)亞鐮刀菌對(duì)農(nóng)作物和飼料污染，以及在鑒別病原菌等一系列實(shí)際應(yīng)用中存在明顯的局限性的實(shí)際問題，提供一種由新的特異性引物組成的針對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的分子檢測(cè)方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種針對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的分子檢測(cè)方法，是利用對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的一對(duì)特異性引物對(duì)樣本提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳凝膠成像分析，其特征在于所述的一對(duì)特異性引物為上游引物SEQ ID NO. 1和下游引物 SEQ ID N0. 2;對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳凝膠成像分析中，根據(jù)172bp處是否出現(xiàn)特異條帶來判斷樣本提取的DNA是否與亞細(xì)亞鐮刀菌相關(guān)；所述的一對(duì)特異性引物是基于亞細(xì)亞鐮刀菌相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性SRAP標(biāo)記， SRAP標(biāo)記的序列為SEQ ID N0. 3，其大小為172bp0在本發(fā)明中DNA是通過改良CTAB法或改良SDS法從樣本中提取的。在本發(fā)明中所述樣本提取的DNA是指從農(nóng)作物籽粒或飼料樣本中提取的農(nóng)作物或飼料DNA。在本發(fā)明中所述的農(nóng)作物是指麥類農(nóng)作物。在本發(fā)明中所述樣本提取的DNA是指病原菌基因組樣本提取的DNA。在本發(fā)明中PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系 20yL，包括 DNA 10-20ng,2y L 10 X buffer, 1. 6μ L 2. 5mmol/L dNTP, 1. 2 μ L 25mmol/L MgCl2, 2. 5 μ mol/L 上游及下游引物各 2 μ L，1. 0 U Taq酶，ddH20補(bǔ)齊至20 μ L ；PCR擴(kuò)增條件為第一循環(huán)95°C預(yù)變性5min ；然后95°C變性 45sec，60°C退火30sec，72°C延伸45sec，共；35個(gè)循環(huán)；最后一個(gè)循環(huán)為72°C延伸lOmin，擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存。在本發(fā)明中所述的電泳是指在2%瓊脂糖凝膠中用IXTAE緩沖液中電泳 30min,電壓為4-5V/cm的條件下凝膠成像。一種上述檢測(cè)方法的應(yīng)用，其特征在于用于對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的鑒別，或用于監(jiān)控亞細(xì)亞鐮刀菌對(duì)農(nóng)作物或飼料的污染。在所述檢測(cè)方法的應(yīng)用中所述的用于對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的鑒別是指從病原菌基因組樣本中提取的DNA，當(dāng)電泳后的凝膠成像中172bp處存在特異條帶，該病原菌為亞細(xì)亞鐮刀菌。
在所述檢測(cè)方法的應(yīng)用中所述的用于亞細(xì)亞鐮刀菌對(duì)農(nóng)作物污染的監(jiān)控是指 從農(nóng)作物籽?；蝻暳蠘颖局刑崛〉霓r(nóng)作物或飼料DNA ；當(dāng)電泳后的凝膠成像中172bp處存在特異條帶，該農(nóng)作物籽?；蝻暳蠘颖疽呀?jīng)被亞細(xì)亞鐮刀菌污染。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1. 一對(duì)特異性引物能夠針對(duì)目前所知的各中亞細(xì)亞鐮刀菌都能夠擴(kuò)增一個(gè)特異性產(chǎn)物，對(duì)鑒定亞細(xì)亞鐮刀菌具有特殊的意義。2.采用一對(duì)引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，操作步驟少，操作方法簡(jiǎn)單；3. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一個(gè)特異性產(chǎn)物，不需要通過幾個(gè)產(chǎn)物或者多條條帶來鑒定菌株，利用本方法，能擴(kuò)增出產(chǎn)物的即為亞細(xì)亞鐮刀菌，擴(kuò)增不出的即為其他菌株，測(cè)定結(jié)果簡(jiǎn)單明了 ；4.本方法所需的DNA量較少，10-20ng的DNA即可檢測(cè)到結(jié)果，以確保從麥穗、種子、飼料中檢測(cè)出亞細(xì)亞鐮刀菌。


圖1 對(duì)已知種型的菌株的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果，其中M 分子量標(biāo)準(zhǔn)50bp ； 1_5泳道為公知的亞細(xì)亞鐮刀菌株的DNA ；6-10泳道為公知的禾谷鐮刀菌株(非亞細(xì)亞鐮刀菌株) 的 DNA。圖2 對(duì)中國采集菌株的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果，其中M 分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp ； 1_20泳道為采集的鐮刀菌株樣本的DNA。圖3 對(duì)不同小麥產(chǎn)區(qū)麥粒受亞細(xì)亞鐮刀菌污染的鑒定結(jié)果，其中M 分子量標(biāo)準(zhǔn) IOObp ； 1-20泳道為小麥籽粒樣本的DNA。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 根據(jù)已確定的42個(gè)亞細(xì)亞鐮刀菌和30個(gè)非亞細(xì)亞鐮刀菌，通過相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)標(biāo)記，對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌和非亞細(xì)亞鐮刀菌進(jìn)行擴(kuò)增和比對(duì)分析。所擴(kuò)增出的SRAP標(biāo)記是基于基因序列中內(nèi)含子與外顯子的SRAP多態(tài)性標(biāo)記，這種多態(tài)性標(biāo)記往往代表的是基因之間的多態(tài)性(也就是差異)。我們從近400個(gè)標(biāo)記中找到只在亞細(xì)亞鐮刀菌中能夠擴(kuò)增，而在非亞細(xì)亞鐮刀菌中不能夠擴(kuò)增的SRAP標(biāo)記，SRAP標(biāo)記的序列為SEQ ID NO. 3，其大小為172bp。通過對(duì)這個(gè)標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序，并在NCBI的GeneBank里進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這是一個(gè)新的基因，只在亞細(xì)亞鐮刀菌中存在，目前在其他鐮刀菌的序列中都沒有找到同源序列。我們針對(duì)這個(gè)標(biāo)記，重新進(jìn)行了引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)針對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的分子具有特異性的引物對(duì)(委托上海生工公司合成)上游引物SEQ ID NO. 15' -TGAGTCCAAACCGGATAGCAAGGTA-3‘，下游引物SEQ ID NO. 25' -GACTGCGTACGAATTTGCACTTCCT-3‘。對(duì)特異性引物的驗(yàn)證已知菌株的來源亞細(xì)亞鐮刀菌株w316，w346, B156, B592, B755 (湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所喻大昭研究員提供)。禾谷鐮刀菌(非亞細(xì)亞鐮刀菌株)菌株Fg820，M101, M83，M129，G12(荷蘭國際植物研究所Lee博士提供)。對(duì)已知種型菌株的PCR擴(kuò)增鑒定過程1.菌株DNA樣本的提取分別挑取各菌株的菌絲在PDA培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g， 蒸餾水1000ml)上，24°C培養(yǎng)3天，挑取新鮮菌絲用液氮凍干并研磨粉碎，用改良CTAB法 (Zhang, 2004)提取 DNA。適量菌絲中加入 200 μ L CTAB 提取緩沖液(80mM Tris-HCl，117M NaCl, 16. 7mM EDTA, 16. 7mg/ml CTAB)，65°C溫浴 40min，加入 200 μ L 氯仿-異戊醇 Q4 1) 抽提液振蕩混勻，12000rpm離心5min，上清液加入120 μ L異丙醇沉淀DNA，ddH20溶解DNA。 取10-20ng DNA加入到PCR反應(yīng)體系中。2. PCR擴(kuò)增反應(yīng)及擴(kuò)增程序反應(yīng)體系20 μ L，包括 DNA 10-20ng,2y L 10 X buffer, 1. 6μ L 2. 5mmol/L dNTP, 1. 2μ L 25mmol/L MgCl2, 2. 5 μ mol/L 上游及下游引物各 2 μ L，1. OU Taq 酶，ddH20 補(bǔ)齊至 20 μ L ；PCR擴(kuò)增條件為第一循環(huán)95預(yù)變性5min ；然后95°C變性45sec，60°C退火30sec， 72°C延伸45sec，共35個(gè)循環(huán)；最后一個(gè)循環(huán)為72°C延伸lOmin，完成擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存。3. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定泳道分配M 分子量標(biāo)準(zhǔn)50bpw316, w346, B156, B592, B755 依次列入 1-5 泳道；Fg820, MlOl，M83, M129, G12 依次列入 6-10 泳道。取8yL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中用1X TAE緩沖液電泳分析，電壓為 4-5V/cm,電泳分離30min，經(jīng)溴化乙錠染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判斷結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。表1本發(fā)明所采用的已知種型的鐮刀菌菌株
權(quán)利要求
1.一種針對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的分子檢測(cè)方法，是利用對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的一對(duì)特異性引物對(duì)樣本提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳凝膠成像分析，其特征在于一對(duì)特異性引物為上游引物SEQ ID NO. 1和下游引物SEQ ID NO. 2 ；對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳凝膠成像分析中，根據(jù)172bp處是否出現(xiàn)特異條帶來判斷樣本是否與亞細(xì)亞鐮刀菌相關(guān)；所述的一對(duì)特異性引物是基于亞細(xì)亞鐮刀菌相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性SRAP標(biāo)記，SRAP標(biāo)記的序列為SEQ ID NO. 3，其大小為172bPo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的分子檢測(cè)方法，其特征在于DNA是通過改良CTAB法或改良SDS法從樣本中提取的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的分子檢測(cè)方法，其特征在于所述樣本提取的DNA是指從農(nóng)作物籽?；蝻暳蠘颖局刑崛〉霓r(nóng)作物或飼料DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的針對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的分子檢測(cè)方法，其特征在于所述的農(nóng)作物是指麥類農(nóng)作物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的分子檢測(cè)方法，其特征在于所述樣本提取的DNA是指病原菌基因組樣本提取的DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5之一所述的針對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的分子檢測(cè)方法，其特征在于 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系 20 μ L，包括 DNA 10-20ng,2y L 10Xbuffer, 1. 6 μ L2. 5mmol/L dNTP, 1. 2μ L 25mmol/L MgCl2, 2. 5 μ mol/L 上游及下游引物各 2 μ L，1. OU Taq 酶，ddH20 補(bǔ)齊至 20 μ L ；PCR擴(kuò)增條件為第一循環(huán)95°C預(yù)變性5min ；然后95°C變性45sec，6(TC退火30sec， 72°C延伸45sec，共35個(gè)循環(huán)；最后一個(gè)循環(huán)為72°C延伸lOmin，擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的針對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的分子檢測(cè)方法，其特征在于所述的電泳是指在2%瓊脂糖凝膠中用IXTAE緩沖液電泳30min，電壓為4-5V/cm的條件下凝膠成像。
8.—種如權(quán)利要求1所述檢測(cè)方法的應(yīng)用，其特征在于用于對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的鑒別， 或用于監(jiān)控亞細(xì)亞鐮刀菌對(duì)農(nóng)作物或飼料的污染。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述檢測(cè)方法的應(yīng)用，其特征在于所述的用于對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的鑒別是指從病原菌基因組樣本中提取的DNA，當(dāng)電泳后的凝膠成像中172bp處存在特異條帶，該病原菌為亞細(xì)亞鐮刀菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述檢測(cè)方法的應(yīng)用，其特征在于所述的用于亞細(xì)亞鐮刀菌對(duì)農(nóng)作物污染的監(jiān)控是指從農(nóng)作物籽?；蝻暳蠘颖局刑崛〉霓r(nóng)作物或飼料DNA，當(dāng)電泳后的凝膠成像中172bp處存在特異條帶，該農(nóng)作物籽?；蝻暳蠘颖疽呀?jīng)被亞細(xì)亞鐮刀菌污染。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的分子檢測(cè)方法和應(yīng)用，是利用對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的一對(duì)特異性引物對(duì)樣本提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳凝膠成像分析，其中所述的一對(duì)特異性引物為上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳凝膠成像分析中，根據(jù)172bp處是否出現(xiàn)特異條帶來判斷樣本是否與亞細(xì)亞鐮刀菌相關(guān)；所述的一對(duì)特異性引物是基于亞細(xì)亞鐮刀菌相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性SRAP標(biāo)記，SRAP標(biāo)記的序列為SEQ ID NO.3，其大小為172bp。本發(fā)明可以用于對(duì)亞細(xì)亞鐮刀菌的鑒別，或用于監(jiān)控亞細(xì)亞鐮刀菌對(duì)農(nóng)作物或飼料的污染。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102559873SQ20111042214
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者余桂紅, 周永進(jìn), 孫曉波, 張旭, 王磊, 邢錦城, 馬鴻翔 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院