專利名稱：高密度微生物混合發(fā)酵在氮限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高密度微生物混合發(fā)酵在氮限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法。
背景技術(shù)：
伴隨石油化工的發(fā)展，合成塑料已成為人們生活和生產(chǎn)密不可分的工業(yè)產(chǎn)品。但是大量不可降解塑料的廢棄已造成愈來愈嚴(yán)重的“白色污染”，日益威脅著人類賴以生存的環(huán)境，因此開發(fā)可生物降解的塑料已成為當(dāng)務(wù)之急。目前采用生物技術(shù)生產(chǎn)的生物可完全降解的塑料中，研究得比較多的有兩類聚乳酸和聚羥基烷酸酯。尤其后者的物化性能與聚丙烯相近，還具有生物相容性、光學(xué)活性、壓電效應(yīng)、低透氧性、抗紫外線和抗凝血性等許多獨特的優(yōu)點，在醫(yī)用產(chǎn)品領(lǐng)域也有廣泛的用途。臨床醫(yī)學(xué)研究表明含苯基功能團(tuán)的有機(jī)物苯乙酸和苯丁酸等具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛和化學(xué)預(yù)防治療等功能。如果將苯基功能團(tuán)引入生物高分子聚合材料一一聚羥基烷酸酯中，合成出具有優(yōu)良物理化學(xué)和機(jī)械性能的含苯聚羥基烷酸酯(PHPhA)，利用它在降解過程中緩慢釋放出含苯基功能團(tuán)的有機(jī)酸如苯乙酸、苯丁酸等的特點，從而使生物可降解醫(yī)用材料聚羥基烷酸酯在使用過程中具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等新的醫(yī)學(xué)作用，可為擴(kuò)大該類生物高分子材料在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。不含苯基功能團(tuán)的聚羥基烷酸酯的生物合成技術(shù)已經(jīng)基本成熟，如利用發(fā)酵法合成聚羥基丁酸酯(PHB)的濃度可達(dá)到每升140克，合成的羥基丁酸和羥基戊酸共聚物的濃度能達(dá)到每升50 90克左右，這使它們的生產(chǎn)成本大幅度降低，具備了工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的條件。但是利用微生物以含苯有機(jī)物(如苯戊酸、苯乳酸等)為碳源合成含有苯基功能團(tuán)的聚羥基烷酸酯時，由于通常微生物代謝含苯有機(jī)物的速率較低，而且有機(jī)物碳源對細(xì)胞生長有明顯抑制作用等原因，使得最終得到的細(xì)胞濃度和產(chǎn)物濃度都較低。近期報道的兩段流加式高密度發(fā)酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法，可有效地降低有機(jī)物碳源對細(xì)胞生長抑制作用，從而使得發(fā)酵果汁最終得到的細(xì)胞濃度可以達(dá)到35. 3克/升，產(chǎn)物聚羥基苯烷酸酯的濃度達(dá)到12. 3克/升。但此發(fā)酵過程僅僅利用單一菌種I^seudomonas putida發(fā)酵合成含苯羥基烷酸酯共聚物，其中的單體絕大部分都是中長鏈(六個碳或以上)烷酸酯單體， 短鏈G個碳或以下，或5個碳)烷酸酯單體含量低，導(dǎo)致其材料難于加工成型，應(yīng)用范圍受到很大限制。此外，利用單一菌種微生物發(fā)酵合成含苯聚羥基烷酸酯時，因微生物特性所定，其代謝產(chǎn)物含苯聚羥基烷酸酯往往主要由短鏈單體組成，或者主要由中長鏈單體組成，很難調(diào)節(jié)和控制含苯聚羥基烷酸酯產(chǎn)物中短鏈單體和中長鏈單體的比例，以使其產(chǎn)物的物理化學(xué)性能難以調(diào)控，大大地限制了它的使用范圍
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種利用微生物混合發(fā)酵、多種碳源分段補(bǔ)給來合成既含有短鏈單體又含有中長鏈單體的含苯聚羥基烷酸酯，并能有效地大范圍調(diào)控其產(chǎn)物組成的高密度微生物混合發(fā)酵在氮限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為高密度微生物混合發(fā)酵在氮限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，主要將兩種或兩種以上的微生物接種到同一發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行混合培養(yǎng)，為了實現(xiàn)高密度發(fā)酵，整個發(fā)酵分兩個階段完成
(1)第一階段首先在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不大于0. 5g/L的含苯有機(jī)物和5 20g/ L的糖作為碳源，然后接入兩種或兩種以上的微生物種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以Ivvm的流量將無菌空氣或富氧氣體(如工業(yè)級的氧氣)連續(xù)通入攪拌釜式發(fā)酵罐內(nèi)，控制發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為150 800轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵溫度為微生物生長的適宜溫度，發(fā)酵液中溶解氧濃度高于微生物生長代謝的需求值；并利用氨水調(diào)節(jié)PH為微生物生長的適宜PH值(如果不用氨水而用氫氧化鈉溶液來調(diào)節(jié)pH值時，在發(fā)酵過程中需要補(bǔ)給一定量的氮源如硫酸銨，以保證發(fā)酵過程中微生物對氮的需求量)；發(fā)酵過程中利用在線信號(如溶氧濃度、PH、在線糖濃度分析儀等)判斷發(fā)酵過程中碳源(糖和含苯有機(jī)物等) 的消耗量，適時流加碳源以保證微生物的生長所需碳源；
(2)第二階段當(dāng)微生物細(xì)胞吸光密度達(dá)到30(600nm波長下的測量值)后，利用不含氮的堿性溶液來調(diào)節(jié)PH值，并停止補(bǔ)加氨水和其它含氮物質(zhì)，使發(fā)酵液中的氮含量逐漸降低至0. OOlmol/L，造成發(fā)酵液中氮源供給不足實現(xiàn)氮限制；并隨時監(jiān)控溶解氧濃度和 PH值的變化，當(dāng)二者的值同時迅速上升時，流加碳源，微生物就會將發(fā)酵液中的碳源通過微生物代謝合成轉(zhuǎn)化為含苯聚羥基烷酸酯。
本發(fā)明上述的兩種或兩種以上的微生物為有能力將碳源轉(zhuǎn)化為含苯聚羥基烷酸酉旨的微生物，如Pseudomonas oleovorans (食油假單胞菌),Pseudomonas putida(惡臭假單胞菌)，Pseudomonas hydrogenovora,Caldimonas taiwanensi,Ralstonia eutropha(真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌)等中的兩種或兩種以上。
本發(fā)明上述第一階段中所述的“微生物生長的適宜溫度”和“微生物生長的適宜PH 值”，因為適宜溫度和PH與菌種種類有關(guān)，根據(jù)具體采用的菌種種類可以給出適宜的溫和 PH值，如本發(fā)明采用的適宜溫度可以為28 38°C，如以惡臭假單胞菌I^seudomonas putida KT2442和真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌fcilstonia eutropha混合培養(yǎng)為例，適宜pH值為7. O士2。
上述所述的含苯有機(jī)物為苯乙酸、苯己酸、苯戊酸、苯乳酸中的一種或一種以上混合物。
上述所述的糖為葡萄糖、蔗糖、木糖等中的一種或一種以上的混合。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果如下
1.不同的微生物可將碳源轉(zhuǎn)化為不同的聚羥基烷酸酯，如Ralstonia eutropha 可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為聚羥基丁酸酯(屬于短鏈聚羥基烷酸酯，比較脆、硬)，而I^seudomonas putida可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為聚羥基癸酸-月桂酸酯共聚物(屬于中長鏈聚羥基烷酸酯，比較柔、有彈性)；本發(fā)明利用不同微生物的混合發(fā)酵，可以合成出既含有短鏈也含有中長鏈的聚羥基烷酸酯；同時通過混合碳源補(bǔ)給，利用不同微生物在不同碳源環(huán)境下生長代謝的差異性，可實現(xiàn)大范圍調(diào)控產(chǎn)物中短鏈和中長鏈單體的比例，達(dá)到調(diào)控產(chǎn)物組成的目的，從而改善產(chǎn)物的物理化學(xué)性能，擴(kuò)大產(chǎn)物的應(yīng)用范圍。
2.本發(fā)明通過兩階段碳源補(bǔ)給策略，可有效地克服含苯有機(jī)物對細(xì)胞代謝生長的抑制作用，實現(xiàn)高密度發(fā)酵，通過增加細(xì)胞密度，提高了含苯有機(jī)物的消耗速率，從而提高了含苯聚羥基烷酸酯的生產(chǎn)率。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實施例
惡臭fi單胞菌Pseudomonas putida KT2442禾口真養(yǎng)產(chǎn)喊桿菌Ralstonia eutropha 都具有將碳源(糖類)轉(zhuǎn)化為含苯聚羥基烷酸酯的能力，在此以惡臭假單胞菌I3Seudomonas putida KTM42和真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Ralstonia eutropha的高密度微生物混合發(fā)酵在氮限制條件下高效合成含苯聚羥基烷酸為例，說明本發(fā)明的具體實施方式
。
上述的惡臭假單胞菌I^seudomonas putida KTM42來源于韓國科學(xué)技術(shù)院生物化學(xué)工程實驗室，真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Ralstonia eutropha購于英國菌種保藏中心。
實施例1
以表3中所述的分批流加補(bǔ)料發(fā)酵方案中的補(bǔ)料方案1實施，具體過程如下
(1)第一階段在5L發(fā)酵罐(發(fā)酵罐Model :KF_5，KOBIOTECH CO.，LTD韓國生物技術(shù)有限公司，型號KF-幻中，配制1.8L基本發(fā)酵培養(yǎng)基(其組成見表1)，滅菌后分別接入 IOOmL惡臭假單胞菌的種子液和IOOmL真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的種子液(液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖濃度為5g/L，其它成分的濃度與基本發(fā)酵培養(yǎng)基的相同，見表1，種子液按照常規(guī)技術(shù)制備)。在30°C、初始攪拌轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分鐘下開始發(fā)酵培養(yǎng)，再以Ivvm的流量通入無菌空氣或富氧氣體，保持發(fā)酵液中溶氧濃度高于20% (通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速或氣體中氧氣的濃度使溶解氧濃度高于20%，以同溫同壓下空氣中的氧在發(fā)酵液中的飽和溶解度值為100%為參照)；用36%氨水調(diào)節(jié)pH為7.0，氨水可以同時當(dāng)做氮源使用，在線監(jiān)測發(fā)酵罐中pH和溶解氧濃度的變化，當(dāng)二者同時迅速上升時(行業(yè)常規(guī)技術(shù)判斷)，說明培養(yǎng)基中碳源耗盡， 需要流加碳源即加入補(bǔ)料I (其組成見表2即蔗糖)，使發(fā)酵罐中蔗糖濃度保持在15g/L之下。
(2)定期從發(fā)酵罐內(nèi)取出發(fā)酵液，用分光光度計測量細(xì)胞吸光密度值(OD)，當(dāng)細(xì)胞吸光密度值到達(dá)30后，發(fā)酵進(jìn)入第二階段，此時采用2M NaOH調(diào)控pH為7. 0，開始實施氮限制；同樣通過在線監(jiān)測發(fā)酵罐中PH和溶解氧濃度的變化，當(dāng)二者的值同時迅速上升時， 流加碳源即加入補(bǔ)料I和補(bǔ)料II適量，以保持罐體內(nèi)蔗糖濃度低于15g/L，苯戊酸濃度低于1. 0g/L ；每隔一定時間取發(fā)酵液，離心后測上清液中銨鹽離子濃度，由測量值判斷，適時加入一定量的補(bǔ)料HK其組成見表2即(NH4)2SO4, MgSO4 · 7H20, KH2PO4)，以保持發(fā)酵液中 (NH4)2SO4濃度低于0. 05g/L。培養(yǎng)48小時發(fā)酵結(jié)束。
實施例2
以表3中所述的兩步分批補(bǔ)料發(fā)酵方案中的補(bǔ)料方案2實施，即第一階段流加補(bǔ)料IV，第二階段流加補(bǔ)料IV+II+III，培養(yǎng)時間50h，其他過程同例1。
實施例3
以表3中所述的兩步分批補(bǔ)料發(fā)酵方案中的補(bǔ)料方案3實施，即第一階段流加補(bǔ)料V，第二階段流加補(bǔ)料V+II+III，培養(yǎng)時間47h，其他過程同例1。
實施例4
以表3中所述的兩步分批補(bǔ)料發(fā)酵方案中的補(bǔ)料方案4實施，即第一階段流加補(bǔ)料VI，第二階段流加補(bǔ)料VI+II+III，培養(yǎng)時間50h，其他過程同例1。
利用上述發(fā)酵方法，采取如表3所示的補(bǔ)料策略，發(fā)酵終了時細(xì)胞濃度、產(chǎn)物聚羥基苯烷酸酯的濃度及其組成(通過氣相色譜分析確定其組成)的變化見表4。
表1發(fā)酵培養(yǎng)基及微量元素溶液的組成
權(quán)利要求
1.一種高密度微生物混合發(fā)酵在氮限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，其特征在于合成方法為(1)第一階段首先在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不大于0.5g/L的含苯有機(jī)物和5 20g/L的糖作為碳源，然后接入兩種或兩種以上的微生物種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以Iwm的流量將無菌空氣或富氧氣體連續(xù)通入攪拌釜式發(fā)酵罐內(nèi)，控制發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為150 800轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵溫度為微生物生長的適宜溫度，發(fā)酵液中溶解氧濃度高于微生物生長代謝的需求值；并利用氨水調(diào)節(jié)PH為微生物生長的適宜pH值；發(fā)酵過程中利用在線信號判斷發(fā)酵過程中碳源的消耗量，適時流加碳源以保證微生物的生長所需碳源；(2)第二階段當(dāng)微生物細(xì)胞吸光密度達(dá)到30后，利用不含氮的堿性溶液來調(diào)節(jié)pH 值，并停止補(bǔ)加氨水和其它含氮物質(zhì)，使發(fā)酵液中的氮含量逐漸降低至0. OOlmol/L，造成發(fā)酵液中氮源供給不足實現(xiàn)氮限制；并隨時監(jiān)控溶解氧濃度和PH值的變化，當(dāng)二者的值同時迅速上升時，流加碳源，微生物就會將發(fā)酵液中的碳源通過微生物代謝合成轉(zhuǎn)化為含苯聚羥基烷酸酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度微生物混合發(fā)酵在氮限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，其特征在于所述的兩種或兩種以上的微生物為I^seudomonas oleovorans, Pseudomonas putida, Pseudomonas hydrogenovora, Caldimonas taiwanensi, Ralstonia eutropha中的兩種或兩種以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度微生物混合發(fā)酵在氮限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，其特征在于所述的含苯有機(jī)物為苯乙酸、苯己酸、苯戊酸、苯乳酸中的一種或一種以上的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度微生物混合發(fā)酵在氮限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，其特征在于所述的糖為葡萄糖、蔗糖、木糖中的一種或一種以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度微生物混合發(fā)酵在氮限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，其特征在于第一階段中所述的適宜溫度為觀 38°C，適宜pH值為7. O士2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度微生物混合發(fā)酵在氮限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為組成如下的培養(yǎng)基蔗糖15g/L，KH2PO4 3g/L， (NH4)2SO4 lg/L，MgSO4 · 7H20 1. 2g/L，檸檬酸 1. 7g/L，苯戊酸 0. lg/L，微量元素溶液 IOml/ L0
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高密度微生物混合發(fā)酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，其特征在于所述的微量元素溶液，其組成如下=FeSO4 · 7H20 10g/L，CaCl2 2g/ L, ZnSO4 · 7H20 2. 25g/L, MnSO4 · 4H20 0. 35g/L, CuSO4 · 5H20 1. 2g/L, H3BO3 0. 25g/L, Na2MoO4 ‘ 2H20 0. 12g/L,35% HCl 10ml/L。
全文摘要
本發(fā)明公開一種高密度微生物混合發(fā)酵在氮限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，第一階段在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入≤0.5g/L的含苯有機(jī)物和5～20g/L的糖作為碳源，接入兩種或兩種以上的微生物種子液，利用在線信號判斷碳源消耗量，流加碳源保證微生物生長所需；第二階段當(dāng)微生物細(xì)胞吸光密度30，用不含氮堿性溶液調(diào)pH值并停止補(bǔ)氨水和其它含氮物質(zhì)，使發(fā)酵液中的氮含量降低至0.001mol/L實現(xiàn)氮限制；監(jiān)控溶解氧和pH值的變化，當(dāng)二者同時迅速上升加碳源轉(zhuǎn)化為含苯聚羥基烷酸酯。本發(fā)明利用微生物混合發(fā)酵、多種碳源分段補(bǔ)給合成既含短鏈單體又含有中長鏈單體的含苯聚羥基烷酸酯，并能有效地大范圍調(diào)控其產(chǎn)物組成的優(yōu)點。
文檔編號C12R1/40GK102517369SQ20111042274
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者尚龍安, 張艷輝, 張蓓蕾, 范代娣, 金志華, 黃錦標(biāo) 申請人:浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院