專利名稱：豬傳染性胃腸炎病毒抗原融合基因及重組巨大芽孢桿菌菌株和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗原融合基因以及含有該抗原融合基因的重組菌株，尤其涉及豬傳染性胃腸炎病毒抗原融合基因以及含有該抗原融合基因的表達(dá)載體，本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有該表達(dá)載體的重組巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)菌株以及它們?cè)谥苽浞乐呜i傳染性胃腸炎疫苗中的用途，屬于豬傳染性胃腸炎的防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬傳染性胃腸炎是由傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)所引起的以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水和高死亡率為主要特征的高度接觸性傳染病。TGEV主要存在于空腸和十二指腸，各種日齡的豬均易感。由于仔豬自身抵抗力比較差，易受外界各種刺激因素的影響和病原微生物的侵襲，常會(huì)因嚴(yán)重脫水而發(fā)生死亡，并以2周齡以內(nèi)的仔豬死亡率最高，可達(dá)100 %。隨日齡的增大，雖然其死亡率逐漸下降，但感染該病的豬生產(chǎn)性能下降，飼料報(bào)酬率低，給世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)都帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。傳染性胃腸炎病毒主要通過腸道感染豬，具有明顯的腸道組織嗜性的特點(diǎn)，在抗 TGEV感染免疫過程中除體液免疫和細(xì)胞免疫外，局部腸粘膜免疫系統(tǒng)發(fā)揮著不可替代的作用。常規(guī)的滅活疫苗和弱毒疫苗在防治該疾病中起到了積極作用，取得良好的效果， 但是仍然存在一些問題，譬如滅活疫苗免疫原性差，不能有效誘導(dǎo)si gA，抵抗感染；弱毒疫苗接種后的動(dòng)物機(jī)體排散病毒、病毒毒力可能返強(qiáng)等，另外還必須通過注射途徑免疫。TGEV有三種主要結(jié)構(gòu)蛋白，分別為磷酸化的核衣殼蛋白N、膜蛋白M和糖基化的纖突蛋白S，其中S糖蛋白攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定族，并且可以介導(dǎo)細(xì)胞的吸附、中和抗體的產(chǎn)生等過程，可以提供有效的免疫保護(hù)作用。S蛋白含有A、B、C、D四個(gè)主要抗原位點(diǎn)，其中A、D位點(diǎn)能產(chǎn)生中和性抗體。TGEV感染具有明顯的嗜腸性，病毒粒子表面的纖突蛋白(S蛋白)與存在于腸上皮細(xì)胞頂膜的氨基肽酶(APN)的結(jié)合是感染發(fā)生的首要條件，粘膜免疫是本病特異性免疫應(yīng)答的主要特征，腸道粘膜表面SIgA含量的高低直接決定臨床疾病的發(fā)生和疾病嚴(yán)重程度。針對(duì)豬傳染性胃腸炎發(fā)病的幾個(gè)特點(diǎn)，采用口服免疫是較為理想的預(yù)防途徑。口服免疫突出的優(yōu)點(diǎn)是可有效地刺激腸道局部免疫細(xì)胞產(chǎn)生分泌型IgA，這尤其適應(yīng)于腸道粘膜傳染病，但口服免疫需要克服免疫原在到達(dá)小腸粘膜之前被降解或滅活的可能。使用細(xì)菌病毒等活載體來傳遞完整無損的抗原成分解決了這個(gè)問題，目前有使用減毒細(xì)菌作為疫苗抗原的載體的報(bào)道，如沙門氏菌、弱毒李斯特菌等，但沙門氏菌作為載體傳遞DNA疫苗可能存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，質(zhì)粒DNA也可能會(huì)整合到宿主細(xì)胞基因組，引起調(diào)控細(xì)胞生長的基因紊亂、原癌基因和抑癌基因的表達(dá)失控、體細(xì)胞癌變、細(xì)胞轉(zhuǎn)型等一系列問題
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種豬傳染性胃腸炎病毒主要抗原位點(diǎn)的融合基因及其編碼的蛋白；本發(fā)明的目的之二是提供含有上述豬傳染性胃腸炎病毒主要抗原位點(diǎn)的融合基因的重組表達(dá)載體；本發(fā)明的目的之三提供含有上述重組表達(dá)載體的重組宿主菌株。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供了一種由豬傳染性胃腸炎病毒Sad序列與化膿鏈球菌細(xì)胞壁錨定序列(CWAm6)連接在一起后得到的抗原融合基因，其多核苷酸序列為 SEQ ID No. 1 所示。本發(fā)明將TGEV S蛋白中A、D抗原位點(diǎn)(Md)和化膿鏈球菌細(xì)胞壁錨定序列(CWAm6)(以化膿鏈球菌M6蛋白的最后140個(gè)氨基酸為細(xì)胞壁錨定序列)連接起來， 考慮到巨大芽孢桿菌使用密碼子的偏嗜情況，為了提高異源基因在宿主菌中的表達(dá)，并保證翻譯后的氨基酸不變的情況下，對(duì)稀有密碼子蘇氨酸(ACC)和異亮氨酸(ΑΤΑ)、精氨酸(AGG、CGA)等進(jìn)行改變，但不改變其所編碼的氨基酸。對(duì)TGEV S蛋白A抗原位點(diǎn)上的3個(gè)甲基化位點(diǎn)(AAC-AAT，ATC-ATT，ACA-ACT)進(jìn)行點(diǎn)突變。通過兩個(gè)柔性的 Linker ((GGGGS) 3)將TGEV的A、D抗原位點(diǎn)基因和細(xì)胞壁錨定序列(CWAm6)連接起來(順序?yàn)镈-Linker-A-Linker-CWAM6)，本發(fā)明把該序列命名為MLS(SEQ ID No. 1)。其中，在MLS 的上游和下游分別引入BglII酶切位點(diǎn)和SphI酶切位點(diǎn)。本發(fā)明的另一方面是提供由SEQ ID No. 1所示融合基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明的又一方面是提供含有所述抗原融合基因的重組表達(dá)載體，譬如，將本發(fā)明的SEQ ID No. 1所示的抗原融合基因與表達(dá)載體pHIS1525進(jìn)行連接，得到可以在巨大芽孢桿菌細(xì)菌的外表面表達(dá)抗原融合基因的分泌表達(dá)載體。由此，本發(fā)明的再一方面是提供一株表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的重組巨大芽孢桿菌，能夠用其制備成防治豬傳染性胃腸炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本發(fā)明將SEQ ID No. 1所示融合基因與分泌表達(dá)載體pHIS1525進(jìn)行雙酶切、連接并經(jīng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)WH320細(xì)胞，獲得含有重組質(zhì)粒的巨大芽孢桿菌命名為WH320-pHIS1525-MLS，其微生物保藏號(hào)是CCTCC No :M2011429 ； 分類命名是Bacillus megaterium WH320-pHIS1525_MLS ；保藏時(shí)間是2011 年 11 月 27 日；保藏單位是中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址是中國武漢武漢大學(xué)。進(jìn)一步的，本發(fā)明將重組巨大芽孢桿菌WH320-pHIS1525-MLS用木糖進(jìn)行誘導(dǎo)，使重組蛋白在巨大芽孢桿菌細(xì)胞壁表面進(jìn)行表達(dá)(表達(dá)約26KDa的重組蛋白)；免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，所表達(dá)的重組蛋白能夠與TGEV免疫血清發(fā)生反應(yīng)，表明重組蛋白與TGEV天然抗原一樣具有相同的抗原性，能夠用于制備成防治豬傳染性胃腸炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本發(fā)明構(gòu)建了 WH320-pHIS1525-MLS表達(dá)載體系統(tǒng)，表達(dá)了含有TGEV蛋白A/D位點(diǎn)和化膿鏈球菌細(xì)胞壁錨定序列CWAM6連接序列MLS，目的蛋白約^kDa ；免疫印跡試驗(yàn)表明，所表達(dá)的重組蛋白能夠與TGEV免疫血清發(fā)生反應(yīng)，表明重組蛋白與TGEV天然抗原一樣具有相同的抗原性。間接免疫熒光檢測(cè)也證實(shí)表達(dá)蛋白存在于菌體上，誘導(dǎo)表達(dá)后的活菌體免疫熒光試驗(yàn)表明，所表達(dá)的蛋白初步定位于菌體的表面，存在菌體表面的目的蛋白，為抗原物質(zhì)有效刺激免疫系統(tǒng)，提高抗體水平奠定了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明針對(duì)TGEV發(fā)生和免疫的幾個(gè)特點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上以阻斷腸道傳染病疾病病原感染的第一道防線為目的，使用安全無毒的巨大芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)，巨大芽孢桿菌不產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)毒素，不產(chǎn)胞外堿性蛋白酶，有利于所表達(dá)蛋白的穩(wěn)定積累，質(zhì)粒穩(wěn)定，可以穩(wěn)定高效地表達(dá)蛋白，比較適合工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。同時(shí)芽孢桿菌在腸道定植后，能消耗大量的游離氧，造成厭氧環(huán)境，可減少需氧菌對(duì)腸道的定植。也有利于乳酸桿菌和雙歧桿菌等厭氧菌的生長，致使體內(nèi)的有益菌增加而致病菌減少，保持腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡。本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。術(shù)語“重組宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞，而不管使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對(duì)或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。術(shù)語“多核苷酸”或“核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè)以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)并密碼子取代(Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19 :5081 (1991) ；Ohtsuka 等人，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985)；和 Cassol 等人，(1992) ；Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8 :91-98(1994))。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。艮口， 針對(duì)多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述術(shù)語適用于天然產(chǎn)生氨基酸聚合物以及其中一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術(shù)語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基經(jīng)由共價(jià)肽鍵連接。


圖IPCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。圖2表達(dá)質(zhì)粒pHIS1525的酶切鑒定結(jié)果。圖3重組質(zhì)粒pHIS1525-MLS的酶切和PCR鑒定結(jié)果。圖4表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析；M 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1_3、重組巨大芽孢桿菌 WH320-pHIS1525-MLS誘導(dǎo)后的蛋白質(zhì)；4、重組巨大芽孢桿菌WH320_pHIS1525誘導(dǎo)后的蛋白質(zhì)。圖5表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光檢測(cè)(X40) ；A :WH320-pHIS1525-MLS重組菌的IFA試驗(yàn)結(jié)果，菌體細(xì)胞散發(fā)了強(qiáng)烈的黃綠色熒光；B :WH320-pHIS1525重組菌的IFA試驗(yàn)結(jié)果， 沒有熒光，菌體呈紅色。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例IMLS基因巨大芽孢桿菌分泌表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定1.序列的設(shè)計(jì)與合成豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白含有A、B、C、D共4個(gè)抗原位點(diǎn)，其中A (536-593殘基區(qū))和D (376-392殘基區(qū))抗原位點(diǎn)在誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體中起重要作用，并且A抗原位點(diǎn)是一個(gè)主要的B細(xì)胞抗原表位，并且以化膿鏈球菌M6蛋白的最后140個(gè)氨基酸為細(xì)胞壁錨定序列(CWAm6)，將Sad和CWAm6連接，使Sad能在巨大芽孢桿菌WH320細(xì)胞壁表達(dá)。通過兩個(gè)柔性的Linker ((GGGGS) 3)將TGEV的A、D抗原位點(diǎn)基因和細(xì)胞壁錨定序列(CWAm6)連接起來(順序?yàn)镈-Linker-A-Linker-CWAJ，并把該序列命名為MLS。對(duì)稀有密碼子蘇氨酸(ACC)和異亮氨酸(ΑΤΑ)、精氨酸(AGG、CGA)等進(jìn)行改變，但不改變其所編碼的氨基酸。對(duì)A抗原位點(diǎn)上的3個(gè)甲基化位點(diǎn)(AAC-AAT，ATC-ATT，ACA-ACT)進(jìn)行點(diǎn)突變，但不改變其所編碼的氨基酸，具體序列見SEQ ID No. 2。在MLS的上游和下游分別引入BglII 酶切位點(diǎn)和SphI酶切位點(diǎn)。將設(shè)計(jì)好的MLS序列(SEQ ID No. 1)進(jìn)行人工合成，構(gòu)建了重組質(zhì)粒 PMD18-MLS ;pMD18-T Simple Vector 購自 TaKaRa (大連)公司，pMD18_MLS 的具體構(gòu)建過程如下PCR擴(kuò)增目的基因在PCR反應(yīng)管中加入下列試劑和溶液表IMLS的PCR反應(yīng)體系
用量(yL) 合成基因模板Γο
dNTPs (2. 5mmol/L)2.0
引物Pl1.0引物 P21.0
IOXExTaq buffer5. 0
ExTaq DNA聚合酶1. 0
二餾水38. 0
總體積50.0Pl :5，-GA AGA TCT ATGTCTGTAAGTGATTCAAGCT 3，；P2 :5， -ACAT GCA TGC GTTTTCTTCTTTGCGTTTTAC 3，
混勻并離心后放置于PCR儀中，94°C預(yù)變性5min后，進(jìn)行如下循環(huán)94°C，30s ； M°C，30s ;72°C，30s。30個(gè)循環(huán)后72°C延伸lOmin。PCR擴(kuò)增完成后，取5 μ L產(chǎn)物用1 % 瓊脂糖凝膠電泳觀察。并參照DNA凝膠回收試劑盒說明書回收酶切產(chǎn)物，參照DNA凝膠回收試劑盒說明書回收PCR反應(yīng)產(chǎn)物，操作步驟如下將IOOyL PCR產(chǎn)物于1 %的瓊脂糖凝膠中電泳，在紫外線燈下切下含有目的DNA 的瓊脂糖凝膠，加入3個(gè)凝膠體積的DE-A溶液(為DNA凝膠回收試劑盒中的試劑)，混合均勻后于75°C加熱融化。加0.5個(gè)DE-A體積的DE-B溶液(為DNA凝膠回收試劑盒中的試劑)，混合均勻。取以上混合液，轉(zhuǎn)移至DNA制備管中離心棄濾液。將制備管置回離心管，加
0.5mlWl溶液(為DNA凝膠回收試劑盒中的試劑)，12000rpm離心30s，棄濾液。將制備管置回離心管，加0. 7ml W2溶液(為DNA凝膠回收試劑盒中的試劑)，12000rpm離心30s，棄濾液，重復(fù)此步驟一次。將制備管置回離心管中，12000rpm離心lmin。將制備管置于潔凈的
1.5ml離心管中，在制備膜正中央加適量(20 μ L)水或洗脫液室溫靜置lmin，12000rpm離心 lmin洗脫DNA。取回收產(chǎn)物IyL 1 %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，檢測(cè)回收結(jié)果。并于_20°C 保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物與克隆載體的連接及轉(zhuǎn)化按pMD18-T Simple Vector說明書將回收的PCR產(chǎn)物與pMD18_T Vector連接。連接體系見表2 表2連接反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.豬傳染性胃腸炎病毒主要抗原位點(diǎn)的融合基因，其特征在于其多核苷酸序列為 SEQ ID No. 1 所示。
2.由權(quán)利要求1所述融合基因編碼的蛋白，其特征在于其氨基酸序列為SEQID No. 2所示。
3.含有權(quán)利要求1所述融合基因的重組表達(dá)載體。
4.含有權(quán)利要求3所述重組表達(dá)載體的重組宿主株。
5.按照權(quán)利要求4所述的重組宿主株，其特征在于所述的重組宿主株是重組巨大芽孢桿菌(feci/^As megaterium)菌株，其微生物保藏號(hào)是CCTCC No:M2011429。
6.權(quán)利要求1所述的融合基因在制備防治豬傳染性胃腸炎疫苗中的用途。
7.權(quán)利要求2所述的蛋白在制備防治豬傳染性胃腸炎疫苗中的用途。
8.權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體在制備防治豬傳染性胃腸炎疫苗中的用途。
9.權(quán)利要求4或5所述的重組宿主株在制備防治豬傳染性胃腸炎疫苗中的用途。
10.按照權(quán)利要求6-9所述的用途，其特征在于所述的疫苗是粘膜免疫活菌疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬傳染性胃腸炎病毒抗原融合基因及重組巨大芽孢桿菌菌株和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種由豬傳染性胃腸炎病毒Sad序列與化膿鏈球菌細(xì)胞壁錨定序列連接在一起后得到的抗原融合基因，其核苷酸序列為SEQIDNo.1所示。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有該抗原融合基因的重組表達(dá)載體以及含有該重組表達(dá)載體的重組巨大芽孢桿菌菌株。將本發(fā)明的重組巨大芽孢桿菌菌株用木糖進(jìn)行誘導(dǎo)，抗原融合基因可以在該細(xì)菌細(xì)胞壁的表面進(jìn)行表達(dá)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，所表達(dá)的重組蛋白能夠與TGEV免疫血清發(fā)生反應(yīng)，表明本發(fā)明重組蛋白與TGEV天然抗原一樣具有相同的抗原性，可將其制備成防治豬傳染性胃腸炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/62GK102399805SQ20111042442
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者張金林, 胡曉芬 申請(qǐng)人:武漢華揚(yáng)動(dòng)物藥業(yè)有限責(zé)任公司