專利名稱：包括1a＞g突變的cyp2c9基因片段、所編碼的蛋白質(zhì)片段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，涉及單堿基突變。更具體地，本發(fā)明涉及CYP2C9基因相對(duì)于SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第26位的突變位點(diǎn)，包含該突變位點(diǎn)的核酸片段及其相應(yīng)編碼的蛋白質(zhì)片段。本發(fā)明還涉及鑒定所述突變位點(diǎn)的試劑和檢測(cè)方法，以及鑒定該位點(diǎn)在指導(dǎo)用藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
CYP2C9是細(xì)胞色素P450酶大家族CYP2C亞家族中最重要的ー員，約占人肝微粒體CYP酶總量的20%。有大約10 16%臨床常用藥物經(jīng)由CYP2C9氧化代謝，其中主要包括甲苯磺丁服、S-華法林、苯妥英、格列吡嗪、格列苯脲、托拉噻咪、氯沙坦、厄貝沙坦和許多非甾體類抗炎藥物(如布洛芬、氯諾昔康、雙氯芬酸和萘普生)等藥物(參見參考文獻(xiàn)1-5)。CYP2C9基因具有高度多態(tài)性。目前為止，國(guó)際上已命名的等位基因共有35種(http://www. cypalleles. k1. se),除去野生型(CYP2C9*1)夕卜，共有34種突變類型可引起CYP2C9蛋白氨基酸組成發(fā)生改變，另外還有多種新發(fā)現(xiàn)的突變尚未被命名。研究較多且臨床意義較大的突變類型主要包括以下10種:CYP2C9*2、*3、*5、*6、*8、*11、*12、*13、*14、*16，其中人種分布最廣、研究最多、中國(guó)人群研究資料相對(duì)最豐富的突變型是CYP2C9*2(430C
>T)、CYP2C9*3 (1075A > C)(參見參考文獻(xiàn) 6-17,20)。根據(jù)目前的臨床研究顯示，CYP2C9基因的這種多態(tài)性是造成CYP2C9酶活性在個(gè)體之間極大不同的主要原因，因此在攜帯不同CYP2C9基因型的個(gè)體間可引起藥物療效的極大差異，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重的藥物毒副作用或治療不充分。因此，研究CYP2C9基因多態(tài)性對(duì)藥物療效的影響將對(duì)臨床合理 用藥提供重要的科學(xué)依據(jù)(參見參考文獻(xiàn)18、19、21、22)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供CYP2C9基因的新的單堿基突變位點(diǎn)，包含該突變位點(diǎn)的核酸片段、其編碼的蛋白質(zhì)片段及鑒定該突變位點(diǎn)在用藥指導(dǎo)中的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供核酸片段，所述核酸片段包含對(duì)應(yīng)于SEQ IDN0.1的第1001位的突變位點(diǎn)，且是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，其中第1001位的核苷酸是G ;或者所述核酸片段包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO. 2的第26位的突變位點(diǎn)，且是SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，其中第26位的核苷酸是G ;或者為上述核酸片段的互補(bǔ)序列。本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供與含有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的第1001位或?qū)?yīng)于SEQID NO. 2的第26位的突變位點(diǎn)的等位基因片段或其互補(bǔ)序列全部或部分雜交的等位基因特異性寡核苷酸，其中SEQ ID NO.1的第1001位或SEQID NO. 2的第26位的突變位點(diǎn)的核苷酸是G ;所述等位基因片段是SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列。
本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供用于檢測(cè)和/或分析單堿基突變的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的核酸片段或等位基因特異性寡核苷酸，或包含SEQ IDN0. 4和/或SEQ IDNO. 5和/或SEQ ID NO. 16所示序列的片段。本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供本發(fā)明的核酸片段或寡核苷酸在檢測(cè)CYP2C9基因突變中的應(yīng)用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探針或引物。本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供ー種用藥指導(dǎo)，包括檢測(cè)待測(cè)樣品中CYP2C9基因的對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第26位的單堿基突變；根據(jù)檢測(cè)到的突變，調(diào)整經(jīng)CYP2C9代謝的藥物的給藥量。 本發(fā)明的第六個(gè)方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待測(cè)樣品中的包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的序列的核酸中對(duì)應(yīng)于第1001位的核苷酸，或分析待測(cè)樣品中的包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO. 2的序列的核酸中對(duì)應(yīng)于第26位的核苷酸。本發(fā)明的第七個(gè)方面是提供一種蛋白或其片段或其變異體，所述蛋白序列如SEQID NO. 3所示，所述片段或其變異體為所述蛋白序列中至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的序列。本發(fā)明提供了包含新的單堿基突變的CYP2C9基因和編碼序列。該基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO. 2的第26位核苷酸由A突變?yōu)镚，該位點(diǎn)是編碼序列的第一位，而所述突變導(dǎo)致起始密碼子的位置發(fā)生變化。該 突變基因編碼的蛋白(命名為SCM)對(duì)藥物的代謝活性比野生型CYP2C9下降。該單堿基突變對(duì)攜帯此突變位點(diǎn)的個(gè)體的用藥具有指導(dǎo)意義。


圖1是本發(fā)明的SEQ ID NO.1的第1001位核苷酸測(cè)序圖譜。
具體實(shí)施例方式通過下述具體實(shí)施方式
說明本發(fā)明，但本發(fā)明內(nèi)容不限于此。如無其它說明，本發(fā)明的“核酸片段”由核苷酸或其類似物組成，可以是DNA、RNA或其類似物的片段；可以是單鏈或雙鏈；可以是天然的(如基因組的)或合成的。本發(fā)明中，“突變”指在檢測(cè)的基因，即CYP2C9基因中存在與野生型CYP2C9基因序列不同的核苷酸位點(diǎn)?！巴蛔兾稽c(diǎn)”指堿基發(fā)生突變的位置。在本發(fā)明中，所述突變位點(diǎn)是對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1所示序列的第1001位或SEQ ID NO. 2所示序列中的第26位。該位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于野生型CYP2C9基因編碼序列的第一位，故該突變位點(diǎn)也被定義為IA > G0在本發(fā)明中，“等位基因特異性”指特異地與等位基因雜交，如在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交，使得鑒定對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1所示序列的第1001位或SEQ IDN0. 2所示序列的第26位的核苷酸為G。本發(fā)明內(nèi)容涉及CYP2C9基因的非同義突變。由于該突變位點(diǎn)位于基因的編碼序列中，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，所述突變位點(diǎn)既可以在基因組DNA中表現(xiàn)，也可以在編碼序列(即CDS，對(duì)應(yīng)于mRNA序列)中表現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)待檢測(cè)樣品，可以在基因組DNA或mRNA水平上對(duì)該突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。本申請(qǐng)中，SEQ ID NO.1是以本申請(qǐng)的突變位點(diǎn)為中心、前后各Ikb的基因組DNA序列，即SEQ ID NO.1的第1001位是本發(fā)明涉及的突變位點(diǎn)。SEQ ID NO. 2是具有所述突變位點(diǎn)的CYP2C9基因的編碼序列，其中第26位是本發(fā)明涉及的突變位點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，在本文中，對(duì)應(yīng)于SEQID NO. 2的第26位位點(diǎn)和對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的第1001位位點(diǎn)同義互用。本發(fā)明中，核苷酸和氨基酸的縮寫采用本領(lǐng)域公知的縮寫方式，如核苷酸中A表示腺嘌呤，G表示鳥嘌呤，C表示胞嘧啶，T表示胸腺嘧啶。氨基酸中，A表示丙氨酸，R表示精氨酸，N表示天冬酰胺，D表示天冬氨酸，C表示半胱氨酸，Q表示谷氨酰胺，E表示谷氨酸，G表示甘氨酸，H表示組氨酸，I表示異亮氨酸，L表示亮氨酸，K表示賴氨酸，M表示蛋氨酸，F(xiàn)表不苯丙氨酸,P表不脯氨酸，S表不絲氨酸,T表不蘇氨酸，W表不色氨酸，Y表不酪氨酸，V表示纈氨酸。本發(fā)明的內(nèi)容是基于CYP2C9基因的新的單堿基突變位點(diǎn)。所述突變位點(diǎn)是位于CYP2C9基因的編碼區(qū)內(nèi)，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO. 2的第26位，該位點(diǎn)由野生型的A突變?yōu)镚 ;此夕卜，由該突變導(dǎo)致CYP2C9基因的起始密碼子發(fā)生變化，其編碼的蛋白短于野生型CYP2C9蛋白。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供核酸片段，所述核酸片段包含對(duì)應(yīng)于SEQ IDN0.1的第1001位的突變位點(diǎn)，且是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，其中第1001位的核苷酸是G ;或者所述核酸片段包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO. 2的第26位的突變位點(diǎn)，且是SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，其中第26位的核苷酸是G ;或者為上述核酸片段的互補(bǔ)序列。在一種實(shí)施方式中，所述核酸片段的長(zhǎng)度可以是如10-100、100-200、200_500、500-1000個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，所述核酸片段的長(zhǎng)度是10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-100或100-300個(gè)核苷酸。所述突變位點(diǎn)可以位于所述 核酸片段的任何位置。在另ー種實(shí)施方式中，所述核酸片段是SEQ ID NO.1所示的序列。在另ー種實(shí)施方式中，所述核酸片段是SEQ ID NO. 2所示的序列。在其它實(shí)施方式中，所示核酸片段可以是SEQ ID NO. 24-27所示的序列。本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供與含有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的第1001位或?qū)?yīng)于SEQID NO. 2的第26位的突變位點(diǎn)的等位基因片段或其互補(bǔ)序列全部或部分雜交的等位基因特異性寡核苷酸，其中SEQ ID NO.1的第1001位或SEQID NO. 2的第26位的突變位點(diǎn)的核苷酸是G ;所述等位基因片段是SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列。在一種實(shí)施方式中，所述的寡核苷酸用作探針。所述探針能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含突變位點(diǎn)的靶序列特異性雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，所述探針不需要與靶序列完全互ネト，只要能與靶序列特異雜交即可。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述雜交條件可以滿足使探針僅與靶序列特異性雜交。所述探針的長(zhǎng)度可以是5-100個(gè)核苷酸，如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、70、80、90或100個(gè)核苷酸。所述突變位點(diǎn)可以出現(xiàn)在探針的任何位置。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，是突變位點(diǎn)出現(xiàn)在探針序列的中心或大約中心處。在另ー種實(shí)施方式中，所述寡核苷酸用作指導(dǎo)DNA合成的引物，如本領(lǐng)域公知的測(cè)序引物或合成引物等。所述引物不需要與模板完全互補(bǔ)，但應(yīng)當(dāng)與模板互補(bǔ)雜交以指導(dǎo)DNA合成。所述引物的長(zhǎng)度可以是15-40個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，優(yōu)選地為18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸。所述突變位點(diǎn)可以出現(xiàn)在所述引物的任何位置；優(yōu)選地，所述突變位點(diǎn)出現(xiàn)在所述引物的3’末端。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所示寡核苷酸是如SEQ ID NO. 28-34所示的序列?；诖?，本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供用于檢測(cè)和/或分析單堿基突變的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的核酸片段或等位基因特異性寡核苷酸，或包含SEQ ID NO. 4和/或SEQ ID NO. 5和/或SEQ ID NO. 16所示的序列片段。本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供本發(fā)明的核酸片段或寡核苷酸用于檢測(cè)CYP2C9基因突變的應(yīng)用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探針或引物。本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供用藥指導(dǎo)，包括檢測(cè)待測(cè)樣品中CYP2C9基因的對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第26位的單堿基突變。當(dāng)檢測(cè)到的CYP2C9基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第26位的位點(diǎn)為G時(shí)，相對(duì)應(yīng)地調(diào)整經(jīng)CYP2C9代謝的藥物的給藥量。在具體的實(shí)施例中，當(dāng)CYP2C9基因在SEQ ID NO. 2的第26位的位點(diǎn)為G吋，該基因編碼的CYP2C9蛋白酶活性下降，故需要減少經(jīng)CYP2C9代謝的藥物的給藥量。 本發(fā)明中所述的經(jīng)CYP2C9代謝的藥物包括抗癌藥物，如環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺或紫杉醇；抗凝血藥，如華法林、醋硝香豆素、抗驚厥藥或美芬妥英；降糖藥，如甲苯磺丁脲、那格列奈、吡格列酮或羅格列酮；抗癲癇藥，如苯妥英或唑尼沙胺；抗瘧藥/抗寄生蟲藥，如阿莫地喹、鹽酸氯胍或奎寧；抗精神病藥，如阿米替林、西酞普蘭、丙咪嗪、哌羅匹隆、舍曲林、硫利達(dá)嗪或文拉法辛；降壓藥，如氯沙坦、厄貝沙坦或纈沙坦；非類固醇性抗炎藥，如雙氯芬酸、氨基比林、安替比林、塞來昔布、氟比洛芬、布洛芬、n引哚美辛、氯諾昔康、甲芬那酸、萘普生、吡羅昔康或替諾昔康；鎮(zhèn)痛藥，如、洛哌丁胺、美沙酮或嗎啡；質(zhì)子泵抑制劑，如蘭索拉唑或奧美拉唑；鎮(zhèn)靜藥，如氯巴占、甲苯比妥或佐匹克隆。本發(fā)明的第六個(gè)方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待測(cè)樣品中的包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的序列的核酸中對(duì)應(yīng)于第1001位的核苷酸或分析待測(cè)樣品中的包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO. 2的序列的核酸中對(duì)應(yīng)于第26位的核苷酸。在一種實(shí)施方式中，所述方法可以是測(cè)序法，包括分離并測(cè)定來自基因組DNA或RNA的核酸序列，分析其中包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的序列的核酸中的對(duì)應(yīng)于第1001位的核苷酸或包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO. 2的序列的核酸中的對(duì)應(yīng)于第26位的核苷酸是否為G。測(cè)序法可以是本領(lǐng)域已知的任何可用的測(cè)序方法。測(cè)序引物可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識(shí)進(jìn)行設(shè)計(jì)，如在待檢測(cè)位點(diǎn)的上下游適當(dāng)位置處設(shè)計(jì)引物，以擴(kuò)展包含該待測(cè)位點(diǎn)的片段，從而判斷該位點(diǎn)的核苷酸。也可以采用本發(fā)明的寡核苷酸作為引物序列。在另ー種實(shí)施方式中，所述方法是利用探針雜交的方法，特異性地鑒定檢測(cè)樣品中包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的序列的核酸中的對(duì)應(yīng)于第1001位的核苷酸或包含對(duì)應(yīng)于SEQID NO. 2的序列的核酸中對(duì)應(yīng)于第26位的核苷酸是否為G ;所述方法中采用的探針是本發(fā)明的寡核苷酸。例如，從待測(cè)樣品中分離出核酸，在允許探針與核酸中可能存在的特異性靶序列雜交的條件下使探針與核酸接觸；可被檢測(cè)的雜交可以通過使用由可檢測(cè)的試劑標(biāo)記過的探針來實(shí)現(xiàn)；例如，用放射性同位素、熒光染料或能催化形成可檢測(cè)產(chǎn)物的酶來標(biāo)記探針。標(biāo)記探針、用標(biāo)記探針檢測(cè)樣品中是否存在靶序列的方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在ー種具體的實(shí)施方式中，提供以Taqman探針SNP檢測(cè)法檢測(cè)對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO.1的第1001位的核苷酸的方法，包括1)設(shè)計(jì)引物用于特異性擴(kuò)增包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的第1001位的PCR產(chǎn)物，同時(shí)設(shè)計(jì)兩條Taqman-MGB探針，分別針對(duì)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的第1001位的A和G(如SEQID NO. 33所不序列)等位基因。引物設(shè)計(jì)原則為()序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；(2)避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；(3)引物長(zhǎng)度在18到24個(gè)核苷酸；(4) Tm 值在 55_65°C，GC 含量在 40% -60% ；(5)引物之間的Tm值相差避免超過2 V ；(6)引物的3’端避免使用堿基A，引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的喊基；(7) PCR 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在 50bp_150bp ；(8)引物末端最后5個(gè)核苷酸不能有超過2個(gè)的G和C。Taqman MGB探針設(shè)計(jì)原則為(I)探針的5’端避免出現(xiàn)G ；(2) Tm 值應(yīng)為 65_67°C ;(3)盡量縮短Taqman MGB探針,但探針長(zhǎng)度不少于13bp ；(4)盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，尤其是G堿基，避免出現(xiàn)4個(gè)或4個(gè)以上的G重復(fù)出現(xiàn)；(5)將探針的突變位點(diǎn)盡量放在中間1/3的地方。熒光基團(tuán)可以采用FAM、VIC等來標(biāo)記兩個(gè)等位基因。2)利用上述引物和探針，對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。PCR條件95°C預(yù)變性10分鐘后進(jìn)入30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)92°C變性12秒，60°C退火及延伸I分鐘(此階段檢測(cè)熒光信號(hào))。3)數(shù)據(jù)分析。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)樣本兩種熒光的強(qiáng)弱判定待測(cè)樣本CYP2C9基因是否存在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO. 2的第26位由A到G的突變。本發(fā)明中，所述樣品可以是任何包含核酸的樣品，如血液；優(yōu)選所述樣品來自于人。所述核酸可以是DNA或編碼RNA，優(yōu)選為基因組DNA。本發(fā)明的分析核酸的方法可以以DNA或RNA為目標(biāo)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，當(dāng)以DNA為檢測(cè)目標(biāo)物時(shí)，分析待測(cè)樣品中的包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的序列的核酸中對(duì)應(yīng)于第1001位的核苷酸，所使用的探針或引物根據(jù)SEQ ID NO.1的序列設(shè)計(jì)；當(dāng)以RNA為檢測(cè)目標(biāo)物時(shí)，分析待測(cè)樣品中的包含對(duì)應(yīng)于SEQID NO. 2的序列的核酸中對(duì)應(yīng)于第26位的核苷酸，所使用的探針或引物根據(jù)SEQ IDNO. 2的序列設(shè)計(jì)。本發(fā)明的第七個(gè)方面是提供一種蛋白或其片段或其變異體，所述蛋白序列如SEQID NO. 3所示；所述片段或變異體包含SEQ ID NO. 3所示的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸，如10-20、20-50或50-100個(gè)氨基酸。
本發(fā)明中的核苷酸突變是野生型的CYP2C9基因編碼區(qū)第I位(即SEQ IDN0. 2的第26位)的A突變成G，從而導(dǎo)致翻譯起始位點(diǎn)發(fā)生變化，故由此翻譯的蛋白的長(zhǎng)度變短。下面將通過具體的實(shí)施例進(jìn)ー步說明本發(fā)明，但以下具體的實(shí)施例僅出于示例性的目的。實(shí)施例實(shí)施例1 :人CYP2C9基因新的突變位點(diǎn)的鑒定本實(shí)施例中，采集2127份血液樣本，提取血液中的基因組DNA，設(shè)計(jì)測(cè)序引物對(duì)CYP2C9基因的9個(gè)外顯子進(jìn)行序列擴(kuò)增、測(cè)序，篩選CYP2C9基因的突變位點(diǎn)I)提取 DNA 從每位被測(cè)者采取5ml靜脈EDTA抗凝血液樣本；然后按照普通鹽析法和/或采用專門的DNA提取試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Omega公司的DNA提取試劑盒)提取待測(cè)血樣的基因組DNA。2) PCR 擴(kuò)增設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，對(duì)獲得的基因組DNA樣品中的CYP2C9基因的9個(gè)外顯子序列進(jìn)行擴(kuò)增。所述擴(kuò)增引物對(duì)序列見表I。采用50 u I PCR反應(yīng)體系，包括:1 XPCR緩沖液、1. 5mM MgCl2UOO 150ng的基因組DNA、上下游引物均為0. 2 ii M、dNTP為0. 4mM、TaKaRa公司的LATaq DNA聚合酶1. 5U。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)如下94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，退火30秒，72°C延伸2分30秒，30個(gè)循環(huán)后再延伸5分鐘。退火溫度與引物長(zhǎng)度相關(guān)，具體溫度見表I。

使用美國(guó)ABI公司的GeneAmp PCR System 9700擴(kuò)增儀擴(kuò)增。表1:測(cè)序引物對(duì)及退火溫度
權(quán)利要求
1.核酸片段，所述核酸片段包含對(duì)應(yīng)于SEQID NO.1的第1001位的突變位點(diǎn)，且是SEQID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，其中第1001位的核苷酸是G ;或者所述核酸片段包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO. 2的第26位的突變位點(diǎn)，且是SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸，其中第26位的核苷酸是G ;或者為所述核酸片段的互補(bǔ)序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段的長(zhǎng)度是10-100、100-200,200-500或500-1000個(gè)核苷酸；優(yōu)選地，所述核酸片段的長(zhǎng)度是10-20、20_30、30-40,40-50,50-60,60-100或100-300個(gè)核苷酸；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述核酸片段是SEQ IDNO.1、2、24-27所示的序列。
3.等位基因特異性寡核苷酸，所述寡核苷酸與含有對(duì)應(yīng)于SEQID NO.1的第1001位或?qū)?yīng)于SEQ ID NO. 2的第26位的突變位點(diǎn)的等位基因片段或其互補(bǔ)序列全部或部分雜交，其中SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第26位的突變位點(diǎn)的核苷酸是G ;所述等位基因片段是SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的等位基因特異性寡核苷酸，其特征在干，所述寡核苷酸是探針或引物；優(yōu)選地，當(dāng)所述寡核苷酸是探針時(shí)，所述寡核苷酸的長(zhǎng)度是5-100個(gè)核苷酸；當(dāng)所述寡核苷酸是引物時(shí)，所述寡核苷酸的長(zhǎng)度是15-40個(gè)核苷酸；優(yōu)選地，當(dāng)所述寡核苷酸是探針時(shí)，所述突變位點(diǎn)位于探針序列的中心或大約中心處；當(dāng)所述寡核苷酸是引物時(shí)，所述突變位點(diǎn)位于引物的3’末端。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所示的等位基因特異性寡核苷酸，其特征在干，所述寡核苷酸是如SEQ ID NO. 28-34所示的序列。
6.用于檢測(cè)和/或分析單堿基突變的試劑盒，包括權(quán)利要求1或2所述的核酸片段和/或權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的等位基因特異性寡核苷酸；或者包含SEQ ID NO. 4和/或SEQ ID NO. 5和/或SEQ ID NO. 16所示序列的片段。
7.權(quán)利要求1或2所述的核酸片段和/或權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的等位基因特異性寡核苷酸在檢測(cè)CYP2C9基因突變中的應(yīng)用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探針或引物。
8.ー種用藥指導(dǎo)，包括檢測(cè)待測(cè)樣品中CYP2C9基因的對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第26位的單堿基突變；根據(jù)檢測(cè)到的突變，調(diào)整經(jīng)CYP2C9代謝的藥物的給藥量；優(yōu)選地，所述藥物是環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、紫杉醇、華法林、醋硝香豆素、美芬妥英、甲苯磺丁脲、那格列奈、吡格列酮、羅格列酮、苯妥英、唑尼沙胺、阿莫地喹、鹽酸氯胍、奎寧、阿米替林、西酞普蘭、丙咪嗪、哌羅匹隆、舍曲林、硫利達(dá)嗪、文拉法辛、氯沙坦、厄貝沙坦、纈沙坦、雙氯芬酸、氨基比林、安替比林、塞來昔布、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、氯諾昔康、甲芬那酸、萘普生、吡羅昔康、替諾昔康、洛哌丁胺、美沙酮、嗎啡、蘭索拉唑、奧美拉唑、氯巴占、甲苯比妥或佐匹克隆。
9.ー種分析核酸的方法，包括分析待測(cè)樣品中的包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的序列的核酸中對(duì)應(yīng)于第1001位的核苷酸或分析待測(cè)樣品中的包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO. 2的序列的核酸中對(duì)應(yīng)于第26位的核苷酸；優(yōu)選地，所述方法是測(cè)序法或探針雜交法。
10.CYP2C9蛋白或其片段或變異體，所述蛋白序列為SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列；所述片 段或變異體為SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，涉及單堿基突變。更具體地，本發(fā)明涉及CYP2C9基因?qū)?yīng)于SEQ ID NO.2的第26位的突變位點(diǎn)，所述位點(diǎn)由野生型的A突變?yōu)镚，包含該突變位點(diǎn)的核酸片段、其編碼的蛋白質(zhì)片段及其應(yīng)用。本發(fā)明還提供了檢測(cè)所述突變位點(diǎn)的等位基因特異性寡核苷酸、試劑盒和檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12N15/53GK103031315SQ20111042528
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者蔡劍平, 戴大鵬, 徐仁愛, 胡國(guó)新, 楊麗萍 申請(qǐng)人:蔡劍平