專利名稱：一種腎綜合征出血熱雙價(jià)疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種新的漢坦病毒(Hantavirus)，以及由該病毒制備的腎綜合征出血熱的雙價(jià)疫苗，本發(fā)明還涉及該疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
腎綜合征出血熱(hemorrhagicfever with renal syndrome, HFRS)是由漢坦病毒(Hantaviruses)引起的經(jīng)嚙齒類動(dòng)物傳播的自然疫源性疾病，具有地區(qū)性、爆發(fā)性、周期性、易變性的流行特點(diǎn)。我國HFRS疫區(qū)已從80年代600多個(gè)縣市擴(kuò)大到現(xiàn)在1300多個(gè)縣市，疫區(qū)類型亦發(fā)生改變；在國外，新型疫區(qū)也在不斷擴(kuò)大和演變。人通過氣溶膠吸入、傷口、消化道等途徑感染病毒而發(fā)病。該病死亡率高，危害性大。我國是漢坦病毒感染影響最嚴(yán)重的國家，在過去十年中每年報(bào)道的HFRS病例達(dá)到25，000至60，000例，占世界發(fā)病人 數(shù)的90%以上。疫苗預(yù)防是目前唯一有效控制HFRS的手段。1978年韓國李鎬汪首先分離到HFRS病毒后，我國自1981 1982年先后從黑線姬鼠和褐家鼠體內(nèi)分離到HFRS病毒，各地亦從不同動(dòng)物和人體分離到許多病毒株。對(duì)HFRS疫區(qū)病毒型別進(jìn)行鑒定，80年代前為漢灘型(HTN型)疫區(qū)，之后又出現(xiàn)漢城型(SE0型)且兩型并存，2003年又報(bào)道有普馬拉型(PUU型)出現(xiàn)。病毒的成功分離為疫苗的開發(fā)奠定了基本條件，我國已批準(zhǔn)生產(chǎn)的滅活疫苗包括地鼠腎細(xì)胞疫苗(II型，SEOV, L99株)、沙鼠腎細(xì)胞疫苗(I型，HTNV, ZlO株)、純化鼠腦細(xì)胞疫苗(I型，HTNV, LRl株)三種單價(jià)疫苗和雙價(jià)(I、II型)沙鼠腎細(xì)胞疫苗相繼初步研制成功。這4種疫苗的三期臨床觀察，在防治和控制HFRS上起到了重要的作用。然而，疫苗所用病毒來自早期分離獲得，以I型HFRS疫苗毒種ZlO和LRl為例，分別分離自1982年浙江省HFRS疫區(qū)病人血清和1983年捕獲于陜西省疫區(qū)黑線姬鼠肺組織，是否作為疫苗株病毒合適，并未證明，病毒的遺傳背景亦不清楚，也并非針對(duì)近年來HFRS流行的優(yōu)勢(shì)疫苗株。漢坦病毒屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，其基因組由大(L)、中(M)、小(S)三個(gè)單股負(fù)鏈的RNA組成，分別編碼RNA多聚酶，兩個(gè)包膜蛋白(Gl和G2)和核蛋白(N)，其中以M基因所承受的來自HV感染宿主的免疫壓力最大，變異最顯著。在不同型的漢坦病毒中，其S片段3' NCR區(qū)核苷酸序列除手柄狀部分外，其余部分差異亦較大。漢坦病毒極易發(fā)生變異，存在不同型別及亞型之間。若變異引發(fā)病毒毒力即致病性的改變，則現(xiàn)有疫苗可能失去保護(hù)性效果，導(dǎo)致新疫區(qū)的不斷出現(xiàn)和擴(kuò)大，并出現(xiàn)HFRS的爆發(fā)流行。此外，以上這些疫苗株生物特性的分子學(xué)基礎(chǔ)研究，如基因組測(cè)定、分析和與國內(nèi)毒株親緣關(guān)系的比較等，都是在疫苗臨床使用后才進(jìn)行。可以說明這些疫苗株的代表性不強(qiáng)，因此，要控制HFRS流行就必須對(duì)HFRS流行與演變的規(guī)律及本質(zhì)有足夠的認(rèn)識(shí)，同時(shí)必須明確流行高峰期的優(yōu)勢(shì)流行病毒株的本質(zhì)，才能制備出更具有針對(duì)性、預(yù)防效果更好的疫苗。本發(fā)明在獲得湖北地區(qū)1985 2000年HFRS患者體內(nèi)漢坦病毒的M基因特征的基礎(chǔ)上，擬用RT-PCR、核苷酸測(cè)序等技術(shù)進(jìn)一步分析長(zhǎng)江中下游地區(qū)1985 2009年間鼠源、螨源及人源漢坦病毒的S、M片段高變區(qū)基因變異頻率與變異位點(diǎn)，從而明確流行高峰期的優(yōu)勢(shì)流行病毒株的特征。在此基礎(chǔ)上，分離得到流行高峰期的優(yōu)勢(shì)流行病毒株并大規(guī)模培養(yǎng)，最終獲得這一地區(qū)具有代表性腎綜合征出血熱疫苗毒株。然后對(duì)病毒進(jìn)行滅活、超濾和濃縮，經(jīng)層析純化，鑒定獲得滅活疫苗，并進(jìn)行疫苗原液、疫苗的效力和其他常規(guī)項(xiàng)目的檢測(cè)以及疫苗免疫原性、安全性和保護(hù)性的評(píng)價(jià)，完成疫苗生產(chǎn)的臨床前研究。本發(fā)明可為制訂HFRS的防治方案，控制該病的流行和漢坦病毒疫苗的研制策略提供新的理論依據(jù)
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種新型漢坦病毒，以及由該病毒制備滅活疫苗，用于腎綜合征出血熱的防治。本發(fā)明的另一目的在于提供一種包括上述漢坦病毒的雙價(jià)疫苗。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供上述疫苗的制備方法。本發(fā)明人通過采集自長(zhǎng)江中下游地區(qū)1985 2009年鼠源、螨源、人源的漢坦病毒標(biāo)本，對(duì)其S、M基因進(jìn)行核苷酸序列分析，獲得漢坦病毒基因變異情況，進(jìn)一步篩選得到優(yōu)勢(shì)病毒疫苗株HV004，該病毒已于2011年12月7日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱〇6皿0，地址武漢市武昌珞珈山郵編430072)保藏，分類命名為漢坦病毒屬(Hantavirus)漢灘型,保藏號(hào)為CCTCC No. V201139。進(jìn)而本發(fā)明提供一種由上述病毒制得的腎綜合征出血熱疫苗。該疫苗可以是由上述病毒滅活制得，此外還可以加入佐劑，例如鋁佐劑，以增強(qiáng)免疫效果。此外，上述病毒還可以與其他病毒制成雙價(jià)或多價(jià)疫苗，例如，將上述病毒HV004與漢坦病毒Hubei- I株制備成雙價(jià)疫苗。本發(fā)明疫苗可以按照常規(guī)方法制備獲得，例如，將所述病毒在宿主細(xì)胞或組織中增值，收獲病毒液后，經(jīng)滅活純化處理，即得。以單價(jià)疫苗為例，將上述病毒在乳鼠腦組織連續(xù)傳代，收獲發(fā)病鼠腦，研磨成勻漿，經(jīng)滅活純化處理，即得。具體地，將發(fā)病鼠腦研磨成勻漿后，取上清加將發(fā)病鼠腦研磨成勻漿后，取上清加硫酸魚精蛋白(終濃度為lmg/ml)，經(jīng)蔗糖密度梯度區(qū)帶離心11萬g離心2. 5h，取在30%與45%以及45%與60%之間一條明亮的帶，用逐滴加入10%W/V BPL，使其最終濃度為1/4000，加入10%V/V Al (OH) 3膠體佐劑，漢坦病毒按抗原量為I :128稀釋，總蛋白含量不超過40呢/劑。雙價(jià)疫苗的制備和單價(jià)疫苗類似，在獲得病毒液時(shí)，將兩者混合，再繼續(xù)處理即可。具體地，將上述兩種病毒分別在乳鼠腦組織連續(xù)傳代，分別將發(fā)病鼠腦研磨成勻漿后，取上清加將發(fā)病鼠腦研磨成勻漿后，取上清加硫酸魚精蛋白(終濃度為lmg/ml )，經(jīng)蔗糖密度梯度區(qū)帶離心11萬g離心2. 5h，取在30%與45%以及45%與60%之間一條明亮的帶，用逐滴加入10%W/V BPL，使其最終濃度為1/4000，加入10%V/V Al (OH)3膠體佐劑，漢坦病毒按抗原量為I :128稀釋，總蛋白含量不超過401^/劑。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
(I)本發(fā)明通過對(duì)長(zhǎng)江中下游地區(qū)1985 2009年鼠源、螨源、人源的漢坦病毒標(biāo)本的S、M基因進(jìn)行核苷酸序列分析，在此基礎(chǔ)上，得到了這一地基因特征。本發(fā)明中所確立的漢坦病毒疫苗株是在已有毒株序列的基礎(chǔ)上得到的毒株，具有代表性。(2)本發(fā)明通過對(duì)病毒基因的分析，確立了長(zhǎng)江中下游地區(qū)漢坦病毒優(yōu)勢(shì)流行株，使疫苗株病毒的選擇較傳統(tǒng)疫苗株更有針對(duì)性。
(3)本發(fā)明中對(duì)優(yōu)勢(shì)流行株進(jìn)行分離培養(yǎng)，在乳鼠體內(nèi)傳代增毒、純化，β_丙內(nèi)酯滅活，最終獲得了適用于HFRS預(yù)防的疫苗。


圖I顯示的是ELISA檢測(cè)不同組血清特異性IgG抗體的水平；
圖2顯示的是不同組的小鼠脾臟細(xì)胞刺激率； 圖3、4顯示的是流式檢測(cè)胞內(nèi)Y干擾素染色結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。若未特別指明，實(shí)施例中所用的生化試劑為市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例I漢坦病毒(Hantavirus) HV004的獲得及鑒定 I、病毒采集及測(cè)序
Cl)收集長(zhǎng)江中下游地區(qū)1985 2009年鼠肺組織、螨媒懸液、HFRS患者血標(biāo)本。(2)對(duì)這一地區(qū)鼠肺組織、螨媒懸液、HFRS患者血標(biāo)本進(jìn)行間接免疫熒光(Indirect immunofluorescence, IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunosorbent assay, EILSA)、(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測(cè)，篩選鼠源、螨源、人源的病毒抗原陽性標(biāo)本。其中RT-PCR篩選過程如下用病毒特異性RNA提取試劑盒(Promega)提取標(biāo)本總RNA ;核酸分析儀檢測(cè)RNA含量，所有標(biāo)本RNA 0D260/280彡I. 9，后取50ng RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；使用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄，其反應(yīng)條件為37°C反應(yīng)60min，93°C 5min終止反應(yīng)，迅速置冰上冷卻3min ；PCR使用設(shè)計(jì)的新型漢坦病毒通用引物(序列5’ -3’ GATTGAAGATATTGAGTCACC, Pl/5’ -3’ GTTGTATCCCCATTGATTGTG, P2)，其反應(yīng)條件為 94°C 預(yù)變性 3min，94°C 變性 Imin，50° C復(fù)性lmin，72°C延伸Imin，循環(huán)35次，最后72° C延伸5min ；1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察病毒核酸擴(kuò)增結(jié)果。切下含目的片段的凝膠，采用Omega gel Extraction kit (Omega)回收DNA，純化后的DNA溶于ddH20中。純化后的PCR產(chǎn)物的測(cè)序交由INVITR0GEN公司(上海)完成,序列測(cè)定引物為PCR引物。2、確定漢坦病毒優(yōu)勢(shì)毒株
已完成624份人源性，896份鼠源性樣本，3829份螨媒標(biāo)本的RNA的提取和陽性標(biāo)本的篩選工作。獲得人源性漢坦病毒陽性標(biāo)本537份，鼠源性漢坦病毒陽性標(biāo)本58份，從螨體內(nèi)檢測(cè)出病毒RNA。詳細(xì)內(nèi)容如下
(I)從HFRS患者血清中共篩選出陽性標(biāo)本從624份HFRS患者血清中共篩選出陽性標(biāo)本537份，獲得漢坦病毒S、M片段序列。完成了 166份長(zhǎng)江中游地區(qū)HFRS患者陽性樣本的分型檢測(cè)；獲得了 74份人源樣本的序列結(jié)果。對(duì)現(xiàn)有的病毒基因同源性分析，結(jié)果顯示，長(zhǎng)江中下游地區(qū)HFRS爆發(fā)的病毒既有HTN型病毒，也有SEO型病毒。前者以與76-118株同源為主，后者以與Z37株相似的病毒為主。(2)鼠樣本中篩選出陽性樣本從687性樣本中篩選出陽性樣本45陽性率6. 5%。獲得了 206份鼠源樣本的測(cè)序結(jié)果，并進(jìn)行病毒與宿主基因同源性分析，結(jié)果顯示，目前長(zhǎng)江中下游地區(qū)漢坦病毒的流行仍以SEO型和HTN型為主，并且有明顯的地區(qū)聚集性。對(duì)病毒進(jìn)行進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)可將我們獲得的SEO型病毒分為三個(gè)進(jìn)化分支，他們都與Z37株有較高的同源性高達(dá)96% 100%。HTN型漢坦病毒基因變化更加多樣，它們與Q32和76-118株有較高的同源性分別為83. 9^84. 4%和89. (T89. 2 %。從鼠體內(nèi)分離漢坦病毒S、M基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。3、優(yōu)勢(shì)病毒疫苗株分離及鑒定
(I)無菌條件下取漢坦病毒 的陽性標(biāo)本黑線姬鼠鼠肺約0.3 g，加3 m I研磨液(含1% PS的DMEM)在冰上研磨成I :10的懸液。吸取0. 02ml懸液，注射到2 3日齡的BALB/C鼠腦內(nèi)；正常飼養(yǎng)21天或發(fā)病后無菌取鼠的心、腦、肺、腎組織，用RT-PCR檢測(cè)為陽性后，用腦組織勻漿液重新接到新生乳鼠腦內(nèi)，以這樣的方法進(jìn)行8代擴(kuò)增，取心、腦、肺、腎等組織于_80°C保存。(2)同時(shí)將b步驟中含有病毒組織按培養(yǎng)基原液(I :1000)勻漿后取IOOii L接種在Vero E6細(xì)胞，在Vero E6細(xì)胞上盲傳3代后，通過IFA檢測(cè)為陽性，核酸鑒定亦為HV004
基因型。(3)對(duì)HV004病毒株序列測(cè)定和系統(tǒng)進(jìn)化分析
對(duì)部分S片611nt (558-1168nt)以及M片段1353nt (51_1404nt)進(jìn)行了擴(kuò)增，并進(jìn)行了同源性分析。M片段與其他HTN型漢坦病毒的堿基以及推斷的氨基酸同源性分別為82. 8%-90. 6%和92. 6%_97. 6%，而與其他型別的漢坦病毒的堿基同源性低于70%。通過部分S片段的分析，也可得到相似的結(jié)果。S、M兩個(gè)基因的進(jìn)化分枝均為一個(gè)新的獨(dú)立分枝，即HTNV-#10。以上結(jié)果說明該分離的病毒與HTN型漢坦病毒的同源性更高，屬HTNV型漢坦病毒。分析HV004的分子特性，以及它能在Veix) E6細(xì)胞和乳鼠體內(nèi)傳代增毒，說明HV004可適用于制備腎綜合征出血熱滅活疫苗。該病毒已于2011年12月7日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia :武漢市武昌珞珈山郵編430072)保藏，分類命名為漢坦病毒(Hantavirus) HV004，保藏號(hào)為 CCTCC No. v201139。實(shí)施例2病毒疫苗的制備
I、單價(jià)疫苗的制備
(I)將HV004經(jīng)BALB/C乳鼠腦組織連續(xù)傳8代，收獲發(fā)病鼠腦，研磨成勻漿，加硫酸魚精蛋白(終濃度為lmg/ml )，初步去除組織DNA，外源DNA含量不大于IOng/劑量。(2)經(jīng)蔗糖密度梯度區(qū)帶離心11萬g離心2. 5h，取在30%與45%以及45%與60%之間一條明亮的帶，純化病毒顆粒。病毒滴度為6. 5 lgCCID50/ml ;細(xì)菌檢查和支原體檢查為陰性，采用IFA法測(cè)定病毒滴度為I :1024。(3)用 2%V/V HEPES lmol/L pH7. 5 和 0. 14%W/V NaHC03 在 4°C調(diào)純化病毒原液pH至7. 4，逐滴加入10%W/V BPL，使其最終濃度為1/4000。滅活24h，將滅活的病毒液再經(jīng)37°C水解2小時(shí)，置2 8°C保存，應(yīng)不超過30日(15日)。同時(shí)做病毒毒力回復(fù)實(shí)驗(yàn)為陰性。(4)測(cè)定蛋白含量彡200ug/ml，ELISA測(cè)定抗原量為I :4096。(5)漢坦病毒按抗原量為I :128稀釋將高壓滅菌的Al (OH) 3按10%比例加入濃縮、純化后的病毒液中，并按0. 02% (W/V)的比例加入柳硫汞制備得Al (OH)3佐劑滅活疫苗。且總蛋白含量不超過40呢/劑。
2、多價(jià)疫苗的制備
方法同單價(jià)疫苗的制備，具體如下
(I) II型病毒株Hubei- I株(SE0型)的制備時(shí)同HV004病毒株。(2)病毒滴定病毒滴度為6. 5 lgCCID50/ml ;細(xì)菌檢查和支原體檢查為陰性，采用IFA法測(cè)定病毒抗原為I :1024。(3)用 2%V/V HEPES lmol/L ρΗ7· 5 和 O. 14%W/V NaHC03 在 4°C調(diào)純化病毒原液pH至7. 4，逐滴加入10%W /V BPL，使其最終濃度為1/4000。滅活24h，將滅活的病毒液再經(jīng)37°C水解2小時(shí)，置2 8°C保存，應(yīng)不超過30日(15日)。同時(shí)做病毒毒力回復(fù)實(shí)驗(yàn)為陰性。(4)測(cè)定蛋白含量彡200ug/ml, ELISA測(cè)定抗原量為I :4096。(5)將I型和II型漢坦病毒單價(jià)原液分別按抗原量為I :128稀釋后等量混合，且總蛋白含量不超過4(^g/劑含量10%A1 (OH) 3佐劑即為疫苗。實(shí)施例3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
以下以單價(jià)疫苗為例作詳細(xì)說明
I、疫苗安全性實(shí)驗(yàn) (I)動(dòng)物過敏實(shí)驗(yàn)研究
取樣品10ml，同時(shí)以小牛血清作為對(duì)照，皮下接種三只豚鼠，豚鼠選用250-350g之間。每只接種lml，間隔一周后進(jìn)行第二次注射，每只皮下I ml，使豚鼠致敏，致敏三周后再以相同樣品靜脈注射每只O. 5ml，觀察豚鼠無過敏性反應(yīng)出現(xiàn)。(2)異常毒性實(shí)驗(yàn)
異常毒性試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)行Balb/C和豚鼠兩種動(dòng)物試驗(yàn)，試驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)達(dá)到清潔級(jí)別。小鼠選用體重18-22g，豚鼠選用250-350g之間。注射前分別稱取小鼠和豚鼠的體重，每只小鼠O. 5ml檢品，豚鼠每只5. 0ml，觀察7天體重變化與正常組無較大差別。2、疫苗免疫性實(shí)驗(yàn)
接種方法于0，7，14，21d皮下給予①正常對(duì)照組pbs組②高劑量疫苗組(10ug/ml)③中劑量疫苗組(5ug/ml)④低劑量疫苗組(2. 5ug/ml)。于第60天檢測(cè)細(xì)胞免疫和體液免疫水平
(I)ELISA檢測(cè)血清特異性IgG抗體的水平。在490nm下讀取的OD值高劑量組明顯高于PBS組且差異顯著(/7〈0. 001)，低劑量組與PBS組無明顯差異Co>0. 05)(見圖I)。(2)無菌取感小鼠脾臟常規(guī)法制備脾淋巴細(xì)胞懸液。以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X 106/ml，加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μ /孔，每組每個(gè)樣品做六個(gè)復(fù)孔，前三個(gè)復(fù)孔每孔加入含10%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液100 μ ，作為對(duì)照組，后三個(gè)復(fù)孔每孔加入含5 μδ/πι1刀豆蛋白及10%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液100 μ 孔，作為試驗(yàn)孔。置37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，在終止培養(yǎng)前4小時(shí)加20 μ /孔的ΜΤΤ，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h后離心，棄上清。每孔加100 μ 的DMS0，振蕩混勻后在酶標(biāo)儀490 nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)其每孔的吸光度值(0D值)。脾細(xì)胞增值率用刺激率(SI)表示SI=試驗(yàn)孔OD均值/對(duì)照孔OD均值。圖二所示為高劑量組SI大于PBS組(/7〈0. 01)。(3)胞內(nèi)Y干擾素染色從不同免疫組動(dòng)物體內(nèi)取出腹股溝淋巴結(jié)和脾臟制成單細(xì)胞懸液(效應(yīng)T細(xì)胞)。從同種背景的陰性對(duì)照小鼠分離脾臟細(xì)胞，感染漢坦病毒以用作靶細(xì)胞。用淋巴細(xì)胞刺激試驗(yàn)和胞內(nèi)r干擾素染色評(píng)價(jià)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。表一所示為不同組⑶3+⑶8+陽性T細(xì)胞百分百。*代表高劑量組⑶3+⑶8+T細(xì)胞高于PBS組(/7〈0. 05)。表I不同組⑶3+⑶8+陽性T細(xì)胞％
權(quán)利要求
1.漢坦病毒GYafliarirw1Se1S) HV004 株，其保藏號(hào)為CCTCC No. v201139。
2.權(quán)利要求I所述病毒在制備腎綜合征出血熱疫苗中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求I所述病毒制備的疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其包括權(quán)利要求I所述的滅活病毒HV004和佐劑。
5.ー種雙價(jià)疫苗，其包括權(quán)利要求I所述的滅活病毒HV004以及漢坦病毒Hubei- I株。
6.ー種制備權(quán)利要求3或4所述疫苗的方法，其特征在于，將權(quán)利要求I所述病毒在乳鼠腦組織連續(xù)傳代，收獲8代以內(nèi)發(fā)病鼠腦，研磨成勻漿，經(jīng)滅活純化處理，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，將發(fā)病鼠腦研磨成勻漿后，取上清加硫酸魚精蛋白至終濃度為lmg/ml，經(jīng)蔗糖密度梯度區(qū)帶離心11萬g離心2. 5h，取在30%與45%以及45%與60%之間一條明亮的帶，用逐滴加入10%W/V BPL,使其最終濃度為1/4000，加入10%V/V Al (OH)3 膠體佐劑。
8.ー種制備權(quán)利要求5所述雙價(jià)疫苗的方法，其特征在于，將權(quán)利要求I所述病毒和分別在乳鼠腦組織連續(xù)傳代，收獲發(fā)病鼠腦，研磨成勻漿，等量混合，經(jīng)滅活純化處理，即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，將發(fā)病鼠腦研磨成勻漿后，取上清加硫酸魚精蛋白至終濃度為lmg/ml，經(jīng)蔗糖密度梯度區(qū)帶離心11萬g離心2. 5h，取在30%與45%以及45%與60%之間一條明亮的帶，用逐滴加入10%W/V BPL，使其最終濃度為1/4000，加入10%V/V Al (OH)3 膠體佐劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腎綜合征出血熱疫苗及其制備方法。該疫苗是漢坦病毒(Hantaviruses)HV004株的滅活病毒，其保藏號(hào)為CCTCCNo.v201139。用該滅活病毒，可以有效防治腎綜合征出血熱(HFRS)。此外，本發(fā)明還公開了一種雙價(jià)疫苗，其包括滅活病毒HV004和漢坦病毒Hubei-Ⅰ株。實(shí)驗(yàn)表明該雙價(jià)疫苗具有顯著防治HFRS的效果。本發(fā)明還提供了上述疫苗的制備方法，包括病毒的增殖以及滅活純化等步驟。本發(fā)明為HFRS的防治提供了有效途徑，對(duì)控制該病的流行具有重要作用。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102618504SQ20111042617
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者侯煒, 凌佳馨, 劉東瀛, 劉媛媛, 張一卉, 張?jiān)? 李金林, 楊占秋, 熊海蓉, 王繼麟, 羅凡, 肖紅, 魯力 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)