專利名稱：離子交換層析純化制備人輪狀病毒滅活疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制備病毒滅活疫苗的方法，特別是制備人輪狀病毒滅活疫苗的方法。
背景技術(shù)：
輪狀病毒(Rotavirus，RV )是引起嬰幼兒病毒性腹瀉最主要的病原體。由于沒(méi)有特異性的治療方法，疫苗預(yù)防接種就成為最經(jīng)濟(jì)有效的方法，但目前使用的減毒活疫苗在預(yù)防輪狀病毒感染中仍存在ー些問(wèn)題。因此，實(shí)現(xiàn)醫(yī)療目的使用的注射用滅活輪狀病毒疫苗有其特殊的意義。近期相關(guān)文獻(xiàn)輪狀病毒的純化一般采用CsCl密度梯度離心或者蔗糖密度梯度離心的方法來(lái)獲取高純度的病毒顆粒，“氯化銫密度梯度離心純化輪狀病毒” (文喻玲，趙慶歡，于洋，陳元鼎.中華現(xiàn)代內(nèi)科學(xué)雜志.2005年第3期.第195-197頁(yè))、
immunogenicity of a thermally inactivated rotavirus vaccine m mice" (Baommg Jiang, Yuhuan Wang, Jean-Francois Saluzzo, et al. Human Vaccines. 2008 March/ April ；4 (2):143-147.)但是，前者CsCl密度梯度離心對(duì)設(shè)備要求較高、成本昂貴；后者在蔗糖介質(zhì)中離心會(huì)對(duì)病毒顆粒造成損傷，易導(dǎo)致病毒喪失感染性，且由于蔗糖的高度黏稠和高滲透性會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，在樣品進(jìn)行感染性滴度分析前還需要將其除去。除上述問(wèn)題外，兩種方法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，其純化不易于放大，均處于用于實(shí)驗(yàn)室研究規(guī)模。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用超濾濃縮結(jié)合液相色譜的技術(shù)路線純化人輪狀病毒，_在提供ー種操作簡(jiǎn)便，易于エ業(yè)化放大，且保證純化產(chǎn)物的總蛋白去除率、抗原回收率、抗原性和免疫原性均具有較好的效果，適宜作為人輪狀病毒滅活疫苗生產(chǎn)的ー種純化工藝。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)，包括以下步驟
(1)病毒液的制備和濃縮
在Vero細(xì)胞上進(jìn)行病毒擴(kuò)增，規(guī)?；囵B(yǎng)45個(gè)轉(zhuǎn)瓶，細(xì)胞為致密單層時(shí)種毒，細(xì)胞密度為1. 33 X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2 X 850cm2/轉(zhuǎn)瓶=1. 1 X IO8個(gè)細(xì)胞/轉(zhuǎn)瓶；當(dāng)病毒増殖72h時(shí)收獲病毒，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，SOOOrpm離心20min取上清液收獲得到9. 8L含有病毒顆粒的病毒原液，病毒原液蛋白含量介于600ug/mL 700ug/mL，病毒感染性滴度為4. 01gCCID50 /mL以上；用截留分子量為IOOKDa的切向流超濾系統(tǒng)將9. 8L病毒原液超濾濃縮36倍至 0. 27L,以備進(jìn)入步驟(2);
(2)病毒的純化
(a) Q Sepharose Fast Flow(簡(jiǎn)稱QFF)離子交換層析純化
取20 ml病毒濃縮液以2ml/min的流速加入預(yù)先用10mM、pH 7. 60之PBS平衡好的裝有QFF填料的層析柱中，繼續(xù)用10mM、pH 7. 60之PBS以2ml/min的流速過(guò)柱，直至在QFF 離子交換層析圖譜OD^Onm處無(wú)吸收峰出現(xiàn)后開(kāi)始洗脫，洗脫采用lmol /L NaCl洗脫大于 5倍柱體積時(shí)間，收集洗脫時(shí)OMSOnm處吸收峰的樣品，其中，洗脫峰1為主要病毒抗原峰， 收集后-80°C保存?zhèn)溆茫?b)純化洗脫峰的透析脫鹽
將步驟(a)的洗脫峰樣品裝入預(yù)先處理好的透析袋中，之后將透析袋置于裝有10mM、 pH7. 20之PBS的玻璃容器內(nèi)，磁力攪拌器攪拌，透析袋旋轉(zhuǎn)速度為60 80次/min，4°C透折Mh，每他更換一次玻璃容器內(nèi)的緩沖液，經(jīng)透析后的樣品為澄清溶液，pH 7. 0 7. 40 ； (3)除菌過(guò)濾和滅活
用0.22 ym濾器過(guò)濾純化的病毒液，過(guò)濾后的病毒液按1:4000的比例加入福爾馬林，先置于56°C滅活半小吋，之后置于37°C滅活72小吋，雙抗體夾心ELISA檢測(cè)滅活后的純化輪狀病毒抗原含量和免疫原性，滅活后抗原量應(yīng)不低于20480EU/ml。
所述方法進(jìn)ー步是檢測(cè)純化前后感染性滴度、抗原量及總蛋白去除率，包括 用熒光灶法測(cè)定病毒純化前后感染性滴度和抗原量如表1 表1純化前后病毒樣品的感染性滴度和抗原量檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.離子交換層析純化制備人輪狀病毒滅活疫苗的方法，包括以下步驟(1)病毒液的制備和濃縮在Vero細(xì)胞上進(jìn)行病毒擴(kuò)增，規(guī)?；囵B(yǎng)45個(gè)轉(zhuǎn)瓶，細(xì)胞為致密單層時(shí)種毒，細(xì)胞密度為1. 33 X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2 X 850cm2/轉(zhuǎn)瓶=1. 1 X IO8個(gè)細(xì)胞/轉(zhuǎn)瓶；當(dāng)病毒増殖72h時(shí)收獲病毒，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，SOOOrpm離心20min取上清液收獲得到9. 8L含有病毒顆粒的病毒原液，病毒原液蛋白含量介于600ug/mL 700ug/mL，病毒感染性滴度為4. 01gCCID50 /mL以上；用截留分子量為IOOKDa的切向流超濾系統(tǒng)將9. 8L病毒原液超濾濃縮36倍至 0. 27L,以備進(jìn)入步驟(2);(2)病毒的純化(a)Q Sepharose Fast Flow(簡(jiǎn)稱QFF)離子交換層析純化取20 ml病毒濃縮液以2ml/min的流速加入預(yù)先用10mM、pH 7. 60之PBS平衡好的裝有QFF填料的層析柱中，繼續(xù)用10mM、pH 7. 60之PBS以aiil/min的流速過(guò)柱，直至在QFF 離子交換層析圖譜OD^Onm處無(wú)吸收峰出現(xiàn)后開(kāi)始洗脫，洗脫采用lmol /L NaCl洗脫大于 5倍柱體積時(shí)間，收集洗脫時(shí)OMSOnm處吸收峰的樣品，其中，洗脫峰1為主要病毒抗原峰， 收集后-80°C保存?zhèn)溆茫?b)純化洗脫峰的透析脫鹽將步驟(a)的洗脫峰樣品裝入預(yù)先處理好的透析袋中，之后將透析袋置于裝有10mM、 pH7. 20之PBS的玻璃容器內(nèi)，磁力攪拌器攪拌，透析袋旋轉(zhuǎn)速度為60 80次/min，4°C透折Mh，每他更換一次玻璃容器內(nèi)的緩沖液，經(jīng)透析后的樣品為澄清溶液，pH 7. 0 7. 40 ；(3)除菌過(guò)濾和滅活用0.22 ym濾器過(guò)濾純化的病毒液，過(guò)濾后的病毒液按1:4000的比例加入福爾馬林，先置于56°C滅活半小吋，之后置于37°C滅活72小吋，雙抗體夾心ELISA檢測(cè)滅活后的純化輪狀病毒抗原含量和免疫原性，滅活后抗原量應(yīng)不低于20480EU/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是檢測(cè)純化前后感染性滴度、抗原量及總蛋白去除率，包括用熒光灶法測(cè)定病毒純化前后感染性滴度和抗原量如表1 表1純化前后病毒樣品的感染性滴度和抗原量檢測(cè)結(jié)果
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是檢測(cè)純化過(guò)程中病毒液的SDS-PAGE和 Western-blot =SDS-PAGE結(jié)果顯示，與超濾濃縮液相比，QFF純化目的峰樣品蛋白條帶數(shù)明顯減少，未見(jiàn)明顯雜蛋白條帶；相對(duì)應(yīng)的Western-blot結(jié)果顯示，蛋白條帶為輪狀病毒特異性蛋白條帶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是檢測(cè)病毒在純化過(guò)程中的基因組帶型電泳，結(jié)果顯示病毒在純化過(guò)程中，基因組帶型未發(fā)生變異，帶型穩(wěn)定。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是檢測(cè)病毒在純化過(guò)程中的基因組帶型電泳， 結(jié)果顯示病毒在純化過(guò)程中，基因組帶型未發(fā)生變異，帶型穩(wěn)定。
全文摘要
離子交換層析純化制備人輪狀病毒滅活疫苗的方法，涉及病毒制備滅活疫苗的方法。本發(fā)明包括濃縮病毒收獲液，經(jīng)QsepharoseFastFlow離子交換柱層析純化，純化產(chǎn)物透析脫鹽，過(guò)濾除菌滅活等得到人輪狀病毒滅活疫苗；進(jìn)一步進(jìn)行純度、總蛋白去除率和感染性滴度檢測(cè)，并進(jìn)行抗原性、免疫原性檢測(cè)及基因組帶型穩(wěn)定性檢測(cè)。本發(fā)明純化后病毒收獲液總蛋白去除率為99.69%，病毒純化前后感染性滴度分別為4.25lgCCID50/ml和7.0lgCCID50/ml，純化的病毒滅活后病毒基因組帶型未發(fā)生變異，保持了良好的抗原性和免疫原性。
文檔編號(hào)C12N7/02GK102552898SQ20111043113
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者吳晉元, 孫茂盛, 張光明, 易山, 李鴻鈞, 楊星 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所