專利名稱：藏獒源犬細(xì)小病毒的分離鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藏獒源犬細(xì)小病毒的分離鑒定方法，屬于病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
藏獒生活在青藏高原，已有3000多年的育成歷史，主要分布于我國西部地區(qū)的西藏、青海和四川等省區(qū)，不僅是我國特有的珍貴犬種，而且也是我國人民引以驕傲和自豪的保種動(dòng)物。所以目前在所有品種的犬中只有藏獒的價(jià)格高居不下。盡管藏獒經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的自然和人工選擇以及嚴(yán)酷的生存環(huán)境使藏獒具備了非一般犬所具備的智力、體能、適應(yīng)性和抗病力，但是近年來，犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)對(duì)藏獒特別是藏獒幼犬的感染和危害越來越嚴(yán)重，其發(fā)病率和死亡率比一般的犬種更高，成為當(dāng)前危害藏獒養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的傳染病。雖經(jīng)注射過國產(chǎn)疫苗或進(jìn)口疫苗，但仍有部分藏獒得不到有效保護(hù)，甚至有一些患犬久治不愈最終死亡。這不僅使許多藏獒養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)上蒙受巨大的損失，而且導(dǎo)致藏獒的保種與市場(chǎng)開發(fā)受到極大的挑戰(zhàn)。目前國內(nèi)外對(duì)CPV分離鑒定的報(bào)道很多，但藏獒源CPV的分離鑒定卻鮮有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種藏獒源犬細(xì)小病毒的分離鑒定方法。藏獒源犬細(xì)小病毒的分離鑒定方法，包括以下步驟Al、病料采集與處理臨床上經(jīng)CPV膠體金試紙檢測(cè)為陽性的藏獒，將滅菌棉簽伸入發(fā)病藏獒肛門，擦拭直腸壁，沾取腸黏膜上皮，將棉簽頭置于1. 5ml EP管，加入無血清的DMEM至Iml ；反復(fù)凍融3次，每次化凍后在振蕩器上振蕩IImin后再進(jìn)行下一次凍融； 凍融后將液體轉(zhuǎn)入15ml離心管中，用無血清DMEM反復(fù)沖洗、振蕩棉簽頭3_4次，并將沖洗后的液體也轉(zhuǎn)入離心管中，最后加無血清DMEM至10ml，制成10%混懸液；8000rpm離心 10-15min ；取上清液，0. 22um微孔濾膜過濾后，置于_20°C備用；A2、病毒分離10%混懸液按1 30-1 60同步接毒F81細(xì)胞，加入含15% FBS的 DMEM后，置于37°C、5% CO2中2_4h，換液，PBS蕩洗細(xì)胞1_2次，加15% DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)Mh ； 每天觀察細(xì)胞，配制含F(xiàn)BS 15%和5%的DMEM，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況及時(shí)改變FBS的濃度； 長(zhǎng)滿一層后仍不出現(xiàn)CPE，按常規(guī)方法傳代，如傳至第5代仍無CPE，則視為病毒分離陰性； 細(xì)胞若出現(xiàn)大面積CPE時(shí)收細(xì)胞和上層培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，IOOOOrpm,離心10-15min ； 取出上清，調(diào)節(jié)PH值到7. 2-7. 5，加入乙二醇至最終濃度為8% (w/v)；置于4°C中濁后， llOOOrpm，濃縮2h，加入少量無血清DMEM溶解病毒團(tuán)塊，置于_20°C中備用；A3,PCR鑒定；根據(jù)GenBank上公布的CPV的VP2核酸序列分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增VP2片段的特異性引物一對(duì)P1、P2 ；擴(kuò)增VP2全基因的特異性引物一對(duì)P3、P4 ；擴(kuò)增的目的片段大小分別為825bp和1755bp ；由上海Invitrogen公司合成，引物序列為上游引物Pl :5，-AACGGATGGGTGGAAATCAC-3，；
下游引物P2 :5，-TAATAGTAGCTTCAGTAATA-3，；上游弓丨物P3 5，-CCAATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGAC-3，；下游引物P4 5，-AATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGA-3，。本發(fā)明從8份患病藏獒的直腸棉拭子中成功分離到6株CPV，分析比對(duì)其VP2全基因序列，均為CPV-2a。1978年首次發(fā)現(xiàn)CPV至今已有CPV-2，CPV_2a，CPV_2b，CPV_2c等亞型，國內(nèi)CPV仍以CPV-加流行為主。病毒由CPV-2進(jìn)化為CPV-加是由于VP2上四個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)(L87M，I101T, A300G, D305Y)發(fā)生了變異，本次分離的6個(gè)毒株在上述四個(gè)位點(diǎn)的變異情況與CPV-加的相同，說明CPV在藏獒中的流行情況與在國內(nèi)的流行情況一致。本發(fā)明嘗試了用直腸棉簽拭子法采樣，既能保證樣品的新鮮度、減少污染，又能及時(shí)采到樣品、節(jié)約采樣時(shí)間。


圖1為CPV分離株在F81細(xì)胞上的變化；a 正常的F81細(xì)胞；b :CPV_YA_ZA1在F81 細(xì)胞上出現(xiàn)的CPE ；c :CPV-YA-ZA2在F81細(xì)胞上出現(xiàn)的CPE ；d :CPV_YA_ZA4在F81細(xì)胞上出現(xiàn)的CPE ；e :CPV-YA-ZA5在F81細(xì)胞上出現(xiàn)的CPE ；f :CPV_CD_ZA1在F81細(xì)胞上出現(xiàn)的 CPE ；g CPV-LS-ZAl 在 F81 細(xì)胞上出現(xiàn)的 CPE ；圖 2 為 6 株分離病毒 PCR 結(jié)果；M :D-2000Marker ；1 =CPV-YA-ZAl ；2 :CPV-YA_ZA23 CPV-YA-ZA4 ；4 :CPV-YA-ZA5 ；5 =CPV-CD-ZAl ；6 =CPV-LS-ZAl ；圖3為6株分離病毒VP2全序列擴(kuò)增結(jié)果；M :D-2000Marker ；1 =CPV-YA-ZAl ；2 CPV-YA-ZA2 ；3 :CPV-YA-ZA4 ；4 :CPV-YA_ZA5 ；5 =CPV-CD-ZA 1 ；6 =CPV-LS-ZA 1 ；圖4為熱、酸和有機(jī)溶劑處理前后各分離株TCID5tl效價(jià)的比較。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。1材料與方法1. 1病料采集與處理臨床上經(jīng)CPV膠體金試紙(韓國BI0INDIST)檢測(cè)為陽性的藏獒，將滅菌棉簽伸入發(fā)病藏獒肛門，擦拭直腸壁，沾取腸黏膜上皮，將棉簽頭置于1. 5ml EP管，加入無血清的 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)至lml。反復(fù)凍融3次，每次化凍后在振蕩器上振蕩Ι-aiiin后再進(jìn)行下一次凍融。凍融后將液體轉(zhuǎn)入15ml離心管中，用無血清DMEM反復(fù)沖洗、振蕩棉簽頭3-4次，并將沖洗后的液體也轉(zhuǎn)入離心管中，最后加無血清DMEM至10ml， 制成10%混懸液。8000rpm離心10-15min。取上清液，0. 22um微孔濾膜過濾后，置于_20°C 備用。1. 2主要試劑F81貓腎傳代細(xì)胞(簡(jiǎn)稱為F81細(xì)胞)購于中科院上海細(xì)胞庫，Takara Ex Taq Polymerase (5U/ul)購于寶生物(大連)有限公司，DP438_magnetic viral DNA/RNA kit、 普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、Maker D2000購于天根生化科技，小牛血清(FBQ、L-谷氨酰胺、DMEM培養(yǎng)液購于GIBC0。1.3引物設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank上公布的CPV的VP2核酸序列分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增VP2片段(Pl，P2)和 VP2全基因(P3，P4)特異性引物各一對(duì)，擴(kuò)增的目的片段大小分別為825bp和1755bp ；由上海hvitrogen公司合成，引物序列為上游引物P1 5，-AACGGATGGGTGGAAATCAC-3，下游引物P2 5，-TAATAGTAGCTTCAGTAATA-3，上游引物P3 5，-CCAATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGAC-3，下游引物P4 5，-AATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGA-3，1. 4病毒分離10%混懸液按1 30-1 60同步接毒F81細(xì)胞，加入含15% FBS的DMEM(后簡(jiǎn)稱 15% DMEM)后，置于 37°C>5% CO2 中 2_4h，換液，PBS 蕩洗細(xì)胞 1-2 次，加 15% DMEM, m 續(xù)培養(yǎng)Mh。每天觀察細(xì)胞，配制含F(xiàn)BS 15%和5%的DMEM，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況及時(shí)改變 FBS的濃度。長(zhǎng)滿一層后仍不出現(xiàn)CPE，按常規(guī)方法傳代，如傳至第5代仍無CPE，則視為病毒分離陰性；細(xì)胞若出現(xiàn)大面積(70% 85%) CPE時(shí)收細(xì)胞和上層培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次， lOOOOrpm，離心 10_15min。取出上清，調(diào)節(jié) PH 值到 7. 2-7. 5，加入乙二醇(PEG, MW = 6，000) 至最終濃度為8% (w/v)。置于4°C中濁后，IlOOOrpm,濃縮濁，加入少量無血清DMEM溶解病毒團(tuán)塊，置于-20°C中備用。1.5PCR 鑒定1.5. IDNA 提取將1. 4中濃縮后病毒液200ul加入1. 5mlEP管中，按照Magnetic Viral DNA/RNA Kit說明書提取病毒DNA，進(jìn)行下一步PCR擴(kuò)增，或者置于-20°C保存，避免反復(fù)凍融。1. 5. 2VP2特異性片段的PCR擴(kuò)增采用25ul 體系進(jìn)行擴(kuò)增模板 DNA 1. Oul ；TaKaRa Ex Taq (5U/ul) 0. 125ul ； IOXEx Taq Buffer (Mg2+Plus) 2. 5ul ；dNTP Mixture (各 2. 5mM) 2ul ；上游引物(Pl)Iul ；下游引物(P2)lul ；加入滅菌水使反應(yīng)體系達(dá)到25ul。PCR程序?yàn)?6°C預(yù)變性180s，94°C變性30s ；52°C退火35s ；72°C延伸40s ；30個(gè)循環(huán)，最后延伸IOmin0 PCR結(jié)束后，1 %瓊脂糖凝膠電泳，觀察并記錄結(jié)果。1. 5. 3VP2全基因的PCR擴(kuò)增采用50ul 體系進(jìn)行擴(kuò)增模板 DNA2. 5ul ；TaKaRa Ex Taq(5U/ul)0. 25ul ； 10 X Ex Taq Buffer (Mg2+Plus) 5. Oul ；dNTP Mixture (各 2. 5mM) 4ul ；上游引物(P3)2ul ；下游引物 (P4)2ul ；加入滅菌水使反應(yīng)體系達(dá)到50ul。PCR程序?yàn)轭A(yù)變性96°C 180s，變性95°C 30s, 退火50°C 30s，延伸72°C 140s，35個(gè)循環(huán)，最后延伸lOmin。PCR完成后，在0. 8%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，觀察并將目的條帶切下，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)目的產(chǎn)物進(jìn)行回收后送由上海hvitrogen公司測(cè)序。1. 6 血凝試驗(yàn)(HA)無菌采集健康豬、牛、山羊、小鼠、狗、貓、兔等血液，以阿氏液為抗凝劑。用 PBS洗滌紅細(xì)胞3-5次制成紅細(xì)胞泥，最后加入含0.1% (w/v)牛血清白蛋白(bovine serumalbumin)的PBS，制成1 %紅細(xì)胞懸液(ν/ν)。按常規(guī)方法測(cè)定各分離毒株對(duì)上述動(dòng)物紅細(xì)胞的HA效價(jià)。1. 7TCID5Q 效價(jià)測(cè)定
將各分離株第5代細(xì)胞培養(yǎng)物(含10% FBS的DMEM)做倍比稀釋(Κ^-ΙΟ—6)。在 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期F81細(xì)胞IOOul (約1. 5 X IO4個(gè)/孔)。 再加入各個(gè)稀釋度病毒液lOOul，最后兩個(gè)孔加入10% FBS的DMEMlOOul做空白對(duì)照，同一細(xì)胞培養(yǎng)板上做8次重復(fù)。置于37°C中讓細(xì)胞貼壁和病毒吸附2- 后用PBS沖洗1-2遍， 再往每孔中加入10% FBS的DMEM200ul繼續(xù)培養(yǎng)。此后每天觀察CPE，至第5天判讀結(jié)果。 以 Reed-Muench 法計(jì)算 TCID5tl 效價(jià)。1. 8病毒理化性質(zhì)檢測(cè)將各分離株病毒進(jìn)行如下處理60°C水浴作用30min ；4°C, PH = 3的環(huán)境中作用 2h;48%氯仿4°C作用IOmin ；20%乙醚4°C過夜。然后再按1. 7的方法計(jì)算出各分離株 TCID5tl 效價(jià)。2 結(jié)果2. 1病毒分離采集的8份藏獒直腸棉拭子經(jīng)過處理，有6份在接種F81細(xì)胞后6_13d出現(xiàn)了較為明顯的CPE，即表現(xiàn)為細(xì)胞融合、變圓或者細(xì)胞變細(xì)變長(zhǎng)，呈現(xiàn)“拉網(wǎng)”病變(見圖1)，同批次空白對(duì)照細(xì)胞正常。各分離株依次被命名為CPV-YA-ZA1、CPV-YA-ZA2、CPV-YA-ZA4、 CPV-YA-ZA5, CPV-CD-ZA UCPV-LS-ZA 1。2. 2PCR鑒定及基因型結(jié)果2. 2. 1VP2特異性片段的擴(kuò)增結(jié)果用引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳后出現(xiàn)了與預(yù)期值 825bp大小相符的特異性條帶(圖幻。表明各分離株的細(xì)胞培養(yǎng)物中存在CPV。2. 2. 2VP2全基因擴(kuò)增結(jié)果用引物P3、P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物在0. 8%瓊脂糖凝膠中電泳后出現(xiàn)了與預(yù)期值1755bp大小相符的特異性性條帶(圖幻，說明擴(kuò)增出VP2的全基因序列。將分離株所測(cè)得的序列與GenBank中CPV的VP2序列進(jìn)行比對(duì)，6個(gè)分離株均為CPV-加。2. 3分離株血凝試驗(yàn)結(jié)果各分離株細(xì)胞培養(yǎng)物與豬、牛、山羊、小鼠、狗、貓、兔紅細(xì)胞進(jìn)行凝集反應(yīng)，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分離株對(duì)豬紅細(xì)胞能很好的凝集，對(duì)貓紅細(xì)胞有一定凝集能力，但對(duì)其他動(dòng)物的紅細(xì)胞基本不凝集。表1各分離株血凝結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種藏獒源犬細(xì)小病毒的分離鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟 Al、病料采集與處理臨床上經(jīng)CPV膠體金試紙檢測(cè)為陽性的藏獒，將滅菌棉簽伸入發(fā)病藏獒肛門，擦拭直腸壁，沾取腸黏膜上皮，將棉簽頭置于1. 5ml EP管，加入無血清的DMEM 至Iml ；反復(fù)凍融3次，每次化凍后在振蕩器上振蕩Ι-aiiin后再進(jìn)行下一次凍融；凍融后將液體轉(zhuǎn)入15ml離心管中，用無血清DMEM反復(fù)沖洗、振蕩棉簽頭3_4次，并將沖洗后的液體也轉(zhuǎn)入離心管中，最后加無血清DMEM至10ml，制成10%混懸液；8000rpm離心10_15min ；取上清液，0. 22um微孔濾膜過濾后，置于-20°C備用；A2、病毒分離10%混懸液按1 30-1 60同步接毒F81細(xì)胞，加入含15%FBS的DMEM 后，置于37°C、5% CO2中2-4h，換液，PBS蕩洗細(xì)胞1_2次，加15% DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)Mh ；每天觀察細(xì)胞，配制含F(xiàn)BS 15%和5%的DMEM，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況及時(shí)改變FBS的濃度；長(zhǎng)滿一層后仍不出現(xiàn)CPE，按常規(guī)方法傳代，如傳至第5代仍無CPE，則視為病毒分離陰性；細(xì)胞若出現(xiàn)大面積CPE時(shí)收細(xì)胞和上層培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，IOOOOrpm,離心10-15min ；取出上清，調(diào)節(jié)PH值到7. 2-7. 5，加入乙二醇至最終濃度為8 % (w/v)；置于4°C中2h后，1 IOOOrpm, 濃縮2h，加入少量無血清DMEM溶解病毒團(tuán)塊，置于_20°C中備用；A3、PCR鑒定；根據(jù)GenBank上公布的CPV的VP2核酸序列分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增VP2片段的特異性引物一對(duì)P1、P2 ；擴(kuò)增VP2全基因的特異性引物一對(duì)P3、P4 ；擴(kuò)增的目的片段大小分別為825bp和1755bp ；由上海Invitrogen公司合成，引物序列為 上游引物 Pl :5’ -AACGGATGGGTGGAAATCAC-3， 下游引物 P2 :5’ -TAATAGTAGCTTCAGTAATA-3’ 上游引物 P3 :5’ -CCAATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGAC-3， 下游引物 P4 :5，-AATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGA-3，。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種藏獒源犬細(xì)小病毒的分離鑒定方法，包括以下步驟A1、病料采集與處理；A2、病毒分離；A3、PCR鑒定；本發(fā)明嘗試了用直腸棉簽拭子法采樣，既能保證樣品的新鮮度、減少污染，又能及時(shí)采到樣品、節(jié)約采樣時(shí)間。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102533670SQ20111044261
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者卿佰春, 張恒, 彭廣能, 李思琪, 梁璐琪, 王英柱, 符華林, 舒龍, 鐘志軍, 魏勝男 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)