專利名稱：Snx7基因調(diào)節(jié)胚胎肝臟細胞發(fā)育的方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及利用SNX7基因表達水平調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎肝臟細胞發(fā)育，以及含有該基因的表達產(chǎn)物和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝臟是包括人在內(nèi)的脊椎動物中最大的消化腺，它參與體內(nèi)多種物質(zhì)的消化，儲存，合成，分泌等過程，同時，它還是主要的解毒器官。肝臟相關(guān)的疾病是對人類健康的主要威脅之一。闡明肝臟的發(fā)育，功能及再生的分子機制是生物醫(yī)學領(lǐng)域面臨的一個重要問題。斑馬魚是研究脊椎動物肝臟發(fā)育的良好模型斑馬魚的體外發(fā)育以及早期胚胎的透明性使得能夠?qū)崟r連續(xù)觀察肝臟的發(fā)育過程；斑馬魚中成熟的正向和反向遺傳學技術(shù)使能夠快速有效地確定特定基因的體內(nèi)功能；斑馬魚早期的器官發(fā)育不需要通過血液循環(huán)提供的營養(yǎng)，而且斑馬魚的肝臟不參與胚胎期的造血過程，這非常有利于排除一個基因間接的對肝臟發(fā)育的影響，而研究它是否對肝臟發(fā)育起直接的調(diào)節(jié)作用。Sorting Nexins (SNXs)是一類具有PX結(jié)構(gòu)域的蛋白，這些蛋白中不同的PX結(jié)構(gòu)域能與不同磷酸化水平的磷脂酰肌醇結(jié)合并將相應(yīng)的SNX蛋白定位到細胞內(nèi)不同的內(nèi)膜系統(tǒng)上。在小鼠和人的基因組中，迄今已有超過30個SNX編碼基因被鑒定和克隆了。一系列的體外研究表明他們的主要功能是調(diào)節(jié)包括表皮生長因子受體(EGFR)等在內(nèi)的一系列細胞表面蛋白的內(nèi)吞及細胞內(nèi)蛋白的分選(sorting)過程。相對于分子與細胞水平已開展的工作，關(guān)于SNX基因在生物個體的胚胎發(fā)育及成體的生理功能方面的研究卻非常有限。基因敲降(knockdown)是反向遺傳學的一種常用技術(shù)，它通過人為抑制特定基因的表達產(chǎn)生的相關(guān)表型來研究該基因的生理功能。特別地，對于所采用的斑馬魚這種模式生物，基因敲降技術(shù)采用得非常普遍且擁有其他模式生物所不具備的優(yōu)勢。在斑馬魚中，是采用注射反義核苷酸Morpholino的方法來完成對特定基因表達的敲降的。斑馬魚作為一個較新的模式生物，其應(yīng)用的一個主要方面就是被用來進行早期器官發(fā)育的研究，與研究最多、應(yīng)用最廣的小鼠相比，斑馬魚作為發(fā)育學研究的模式生物具有以下特點斑馬魚非常便于飼養(yǎng)、人工繁育和品系保持，正常培養(yǎng)的雌雄魚每周都能夠交配，每次可產(chǎn)生數(shù)以百計的后代(受精卵)，這為大規(guī)模的篩選和運用統(tǒng)計學方法進行研究在短時間內(nèi)提供了大量的研究樣本。斑馬魚發(fā)育周期非常短，在受精之后M小時內(nèi)，幾乎所有的器官和系統(tǒng)都已經(jīng)開始發(fā)育，在受精之后的5天內(nèi)，所有的器官和系統(tǒng)都已經(jīng)具有了完整的功能，此時的幼體斑馬魚已經(jīng)具有各種完整地生理行為。斑馬魚的胚胎是在體外完成整個生理發(fā)育過程的，這不僅可以通過一部簡單的光學顯微鏡就能觀察到其發(fā)育全過程，而且與哺乳動物相比，其受精卵的發(fā)育過程由于獨立于母體，省去了一系列用來支持和提供養(yǎng)分的附屬結(jié)構(gòu)；斑馬魚早期發(fā)育的胚胎是完全透明的，從光學顯微鏡和解剖鏡下，能夠?qū)崟r清晰地觀察某一特定部位、系統(tǒng)、器官和組織的發(fā)育，能夠得以方便地全程監(jiān)控所感興趣的發(fā)育過程。在較短的時間內(nèi)，斑馬魚研究的前驅(qū)科學家們已經(jīng)建立的一套系統(tǒng)的研究方法，并積累起了大量的研究數(shù)據(jù)。斑馬魚全基因組比對已經(jīng)接近完成，人和小鼠的絕大部分基因都能在斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫中找到其對應(yīng)的同源基因。眾多轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系已經(jīng)建立，目前具有的數(shù)千種轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系中幾乎涵蓋了所有組織器官，用熒光等標簽特異性標記了某一部位和器官的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系為發(fā)育學研究提供了強有力的工具。在斑馬魚胚胎中對某一特定基因進行敲降(knockdown)具有著其他模式生物無法比擬的優(yōu)勢，在這其中，Gene-tools公司所設(shè)計的morpholino反義寡核苷酸是應(yīng)用最廣的一種，通過將帶有與目標基因互不配對序列的morpholino反義寡核苷酸顯微注射到單細胞階段的斑馬魚受精卵，能夠非常方便地完成單個或是多個特定基因的瞬時敲降，morpholino反義寡核苷酸具有極好的水溶性與穩(wěn)定性，這樣的敲降雖是瞬時，但由于前述的斑馬魚發(fā)育過程的短暫，敲降的效果可相當穩(wěn)定地維持于斑馬魚早期胚胎發(fā)育的全過程。近幾年來，運用鋅指蛋白技術(shù)，已經(jīng)成功地完成了基因敲除(knockout)斑馬魚品系的構(gòu)建。肝臟發(fā)育的過程在多個模式生物系統(tǒng)中都做過很多的研究，相當多的基因被證明在肝臟形成和發(fā)育過程當中發(fā)揮著功能。它們當中的絕大多數(shù)都可以歸結(jié)到以下三種類型之一 1.信號通路分子，如FGF、BMP、Wnt、Hedgehog和RA信號通路相關(guān)的基因；2.轉(zhuǎn)錄因子，如feita和HNF家族的成員，Hhex, Proxl等等；3.表觀遺傳學相關(guān)的修飾基因如Dnmt 1/2，Hdac 1/3 和 Uhrfl 等等。在本發(fā)明研究中SNX7，一個原本被認為參與到細胞內(nèi)膜泡運輸和蛋白分選的基因家族成員，在斑馬魚胚胎肝臟發(fā)育的過程中起著關(guān)鍵性的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過觀察SNX7對肝臟細胞生長的影響作用，探索其調(diào)節(jié)肝臟細胞生長的機理，并最終為以SNX7為靶點設(shè)計、開發(fā)治療肝臟疾病的藥物。本發(fā)明的技術(shù)方案為如SEQ ID NO 1所示的SNX7基因調(diào)節(jié)胚胎肝臟細胞發(fā)育的方法，所述方法包括調(diào)整胚胎肝臟細胞中的SNX7基因的表達水平。優(yōu)選的，上述使用如SEQ ID NO :1所示的SNX7基因調(diào)節(jié)胚胎肝臟細胞發(fā)育的方法，所述胚胎肝臟細胞為斑馬魚胚胎肝臟細胞，所述方法包括調(diào)整斑馬魚胚胎肝臟細胞中的SNX7基因的表達水平。優(yōu)選的，上述使用如SEQ ID NO :1所示的SNX7基因調(diào)節(jié)胚胎肝臟細胞發(fā)育的方法，所述調(diào)整SNX7基因的表達水平為通過將外源人SNX7基因的mRNA導入斑馬魚胚胎肝臟細胞中來表達SNX7基因，所述調(diào)整SNX7基因的表達水平為使用基因敲降抑制斑馬魚胚胎肝臟細胞中SNX7基因的表達。優(yōu)選的，上述使用如SEQ ID NO :1所示的SNX7基因調(diào)節(jié)胚胎肝臟細胞發(fā)育的方法，所述將外源人SNX7基因的mRNA導入斑馬魚胚胎肝臟細胞中來表達SNX7基因方法包括使用體外轉(zhuǎn)錄的方式合成外源人SNX7基因的mRNA。本發(fā)明另一個技術(shù)方案為SEQ ID NO 1所示的SNX7基因在調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎肝臟細胞生長的應(yīng)用。本發(fā)明另一個技術(shù)方案為如SEQ ID NO 1所示的SNX7基因制備調(diào)節(jié)胚胎肝臟細胞生長發(fā)育的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明另一個技術(shù)方案為SEQ ID NO 1所示的SNX7基因在制備調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎肝臟細胞生長發(fā)育的藥物中的應(yīng)用。SNX7基因治療的制備方法，可按照基因藥物領(lǐng)域的方法進行制備。SNX7將通過直接注射的方法給藥。本發(fā)明證實了 SNX7調(diào)節(jié)斑馬魚肝臟細胞生長的作用，提供了 SNX7基因新作用或新藥物的應(yīng)用方式。


圖1 為人和斑馬魚SNX基因家族進化譜系示意圖；圖2 多個SNX基因在斑馬魚胚胎的肝臟中有著特異的高表達；圖3 斑馬魚組織特異性標記探針的原位雜交結(jié)果；圖4 斑馬魚內(nèi)胚層及肝臟發(fā)育標記基因的原位雜交結(jié)果；圖5 :SNX7基因在小鼠不同組織和器官中表達譜。
具體實施例方式斑馬魚作為一個新興的模式生物被研究的過程當中，其作為研究器官發(fā)育模型的一個特點越來越受到關(guān)注并被廣泛應(yīng)用到一些對于小鼠模型產(chǎn)生致死效應(yīng)的基因的研究當中。在小鼠的研究當中，如果遇到所感興趣的基因的突變或是敲除引起了胚胎早期的致死效應(yīng)(lethality)，那么在小鼠模型中這個基因的研究就要不幸地畫上句號了。但同樣的基因在斑馬魚中的突變可能就不會產(chǎn)生致死效應(yīng)，這是由于斑馬魚早期發(fā)育所需的養(yǎng)料都來源于母體的卵黃，而斑馬魚胚胎早期發(fā)育所需的氧氣也可以通過簡單的擴散而主要不是由循環(huán)系統(tǒng)來實現(xiàn)，這樣就使本發(fā)明能夠在斑馬魚中對某個在小鼠胚胎發(fā)育中引起致死效應(yīng)的基因的功能來進行研究成為可能，在已經(jīng)報道過的文獻中，已經(jīng)有不少成功的范例，這表明對斑馬魚作為模式動物能夠完善和拓展在小鼠等其他模式生物中的進行的研究。具體到肝臟發(fā)育的研究中，在小鼠中，肝臟的發(fā)育過程包含了管脈系統(tǒng)的形成、造血功能的啟動和肝實質(zhì)的形成等幾個相對獨立而又緊密聯(lián)系的過程，這個精密程序的任何一部分出現(xiàn)問題都極有可能導致整體胚胎的致死效應(yīng)，而一旦產(chǎn)生了致死效應(yīng)就無法再進行進一步的研究。但在斑馬魚中，造血功能的發(fā)生不發(fā)生在早期胚胎的肝臟中，同時肝臟本身的發(fā)育也不依賴血管系統(tǒng)的生成，斑馬魚胚胎的肝臟能在沒有循環(huán)系統(tǒng)出現(xiàn)的前提下獨立發(fā)育數(shù)天之久，這就使本發(fā)明研究某一個獨立作用于肝臟本身發(fā)育的基因成為現(xiàn)實。實施例一、通過生物信息學的方法，本發(fā)明從斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫中篩選出了和目前已知的人類Sorting Nexin基因家族相對應(yīng)的所有同源基因，并通過蛋白序列分析繪出了反映SNX基因家族各成員之間親緣和進化關(guān)系的譜系圖，請參閱圖1為人和斑馬魚SNX基因家族進化譜系示意圖。人的Sorting Nexin(SNX)基因目前發(fā)現(xiàn)了 33個，根據(jù)結(jié)構(gòu)特點，Sorting Nexin家族蛋白可以分為三類。第一類SNXPX，即只具有PX結(jié)構(gòu)域。SNXPX這個大類包括6個SNX，即 SNX3、SNX10、SNX12、SNX22、SNX23 及 SNX24。第二類SNXPX_BAR。SNXPX-BAR 這個大類包括 SNX 家族中已知的 SNX1、SNX2、SNX4、SNX5、SNX6、SNX7、SNX8、SNX9、SNX18，與新的家族基因SNX30、SNX32、SNX33。BAR(Bin/amphiphysin/Rvs)結(jié)構(gòu)域具有形成而二聚體的能力，還可以誘導膜的彎曲化。因此，SNXPX-BAR這一類SNX蛋白可能因為其參與調(diào)節(jié)膜轉(zhuǎn)運而成為一類特殊的SNX。第三類SNXPX-other。這類包括17個SNX基因，既已知的SNX11、SNX13、SNX14、SNX15、SNX16、SNX17、SNX19、SNX20、SNX21、SNX25、SNX 26、SNX27、SNX28、SNX29 及新家族基因SNX31。在SNX家族蛋白中，包含有各式各樣的結(jié)構(gòu)域，例如SNX9/SNX18/SNX 33還有一個SH3結(jié)構(gòu)域，SNX27含有PDZ結(jié)構(gòu)域和RA結(jié)構(gòu)域。通過生物信息學的方法，本發(fā)明找出了在斑馬魚已知的基因組中和人的SNX對應(yīng)的基因。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，絕大部分的SNXs在斑馬魚中都可以找到，不僅如此，有8個SNXs (1，8，9，10，18，19，27，28)在斑馬魚中都有兩個亞型，同時，有3個SNXs (22，31，32)在斑馬魚的基因文庫中暫未發(fā)現(xiàn)同源基因，這有可能是由于目前斑馬魚的基因組數(shù)據(jù)尚不完整，相對應(yīng)的基因序列數(shù)據(jù)尚未公布。對人和斑馬魚的所有SNX的蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，人和斑馬魚的SNXs在序列上有著相當高的同源性，人SNX7基因序列如SEQ IDNO :1所示，斑馬魚SNX7基因序列如SEQ ID NO :2ο二、用原位雜交的方法對所有SNX基因的表達進行篩查，原位雜交(In-situhybridization)結(jié)果顯示SNX家族的多個基因在肝臟和消化道中有特異性的表達，請參閱圖2，其顯示多個SNX基因在斑馬魚胚胎的肝臟中有著特異的高表達。本發(fā)明合成了斑馬魚中已知的所有SNX基因(共38個)，對3天的野生型斑馬魚胚胎進行原位雜交染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有10個以上的SNX基因特異性表達在3天斑馬魚胚胎的內(nèi)胚層消化系統(tǒng)中，至少有6個SNX基因特異性地表達在3天斑馬魚胚胎的肝臟中SNXla，SNX3, SNX7, SNX17, SNX25, SNX29 (請參閱圖 2 中的 A-F)。其中，SNXla,SNX 3 和 SNX7 在肝臟和腸道中特異地高表達；SNX17在肝臟，眼和腦中表達但似乎并不表達在腸道中，而SNX25則在眼和腦中表達量尤甚于在肝臟和腸道中。如此多的SNX特異性地高表達在斑馬魚胚胎肝臟發(fā)育的早期，提示本發(fā)明這些SNX基因很有可能參與到斑馬魚的胚胎早期肝臟發(fā)育過程。本發(fā)明進一步觀察了在更早時期的胚胎中SNX7的表達在48小時(請參閱圖2中的I)，就已經(jīng)可以看到SNX7在肝臟部位的清晰表達，此外，耳囊，眼中也有表達；而在更早的18體節(jié)(約18小時)的胚胎中，SNX7表現(xiàn)出在整個胚胎中廣泛的表達(此時肝臟還未開始形成)，由于此時胚胎還基本未合成自身的mRNA，提示本發(fā)明在母體卵細胞中，SNX7就有著相當?shù)暮俊Ｈ?、針對SNX7基因，分別設(shè)計morpholino反義寡核苷酸對其進行敲降(knockdown)實驗，人為加入的人SNX7mRNA能夠特異性地逆轉(zhuǎn)由注射SNX7-morpholino而產(chǎn)生的肝臟的缺陷和發(fā)育異常。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)SNX7能夠強烈地抑制斑馬魚胚胎肝臟的發(fā)育，而SNX7的mRNA能夠特異性地挽救和逆轉(zhuǎn)這種肝臟發(fā)育缺失的表型，有力地佐證了本發(fā)明所觀察到的肝臟發(fā)育異常的表型是特異性地由SNX7單個基因表達的下調(diào)所引起。請參閱圖3組織特異性標記探針的原位雜交結(jié)果。Morpho 1 ino是Gene-too 1 s公司設(shè)計的一種改造了糖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，它通過與目的基因序列互補結(jié)合而能夠很容易地插入RNA的二級結(jié)構(gòu)中，根據(jù)作用的原理，morpholino可以分為兩種設(shè)計成與基因5'端翻譯起始位點結(jié)合的morpholino能夠通過阻止翻譯起始復合體的形成而阻斷翻譯過程；而設(shè)計成與跨某個外顯子和相鄰內(nèi)含子區(qū)域結(jié)合的morpholino則能夠干擾mRNA前體的剪接成熟過程產(chǎn)生剪接錯誤的mRNA從而阻斷目標基因的表達。對于那些通過成熟過程中多樣化剪接而產(chǎn)生含有不同外顯子和內(nèi)含子組合的不同亞型的基因，本發(fā)明可以通過設(shè)計特異性阻斷某個外顯子-內(nèi)含子區(qū)域剪接的morpholino來阻斷某個特定亞型的表達。根據(jù)morpholino反義寡核苷酸的作用機制，其導致目標基因mRNA序列紊亂的結(jié)果可以預測，因此本發(fā)明可以通過RT-PCR擴增的方法檢測morpholino的作用效果。分別提取正常胚胎和注射SNX7-m0rph0lin0胚胎的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SNX7的引物PCR對SNX7的表達進行檢測。(請參閱圖3中的A、B)與正常的SNX7(WT)相比，分別注射了兩個SNX7-m0rph0lin0的胚胎MOl和M02中，SNX7片段長度有了明顯的改變，測序的結(jié)果顯示，MOl注射的斑馬魚胚胎中SNX7多出來原本屬于內(nèi)含子1的序列，而M02注射的斑馬魚胚胎中SNX7多出來原本屬于內(nèi)含子2的序列，這與設(shè)計該兩條morpholino時預計的作用位點一致。對注射了 SNX7-m0rph0lin0的斑馬魚胚胎進行鏡下顯示，從注射之后第1天至第5天，胚胎的整體大小、形態(tài)、發(fā)育階段和行動力與未注射morpholino的胚胎相比，都沒有明顯的差異，各淺表的器官和系統(tǒng)發(fā)育也未見顯著異常和缺失，提示胚胎的發(fā)育基本正常。本發(fā)明用一系列的組織特異性的標記探針(marker)對野生型及SNX7-morpholino注射的斑馬魚3天胚胎進行原位雜交實驗。銅藍蛋白(Ceruloplasmin，CP)是一種由肝細胞產(chǎn)生的攜帶有6個銅原子的氧化還原酶，一般被用作標記肝臟細胞，銅藍蛋白探針原位雜交的結(jié)果清楚地顯示，注射了 SNX7-m0rph0lin0的斑馬魚胚胎(請參閱圖3中的C)，3天時其肝臟發(fā)育發(fā)生了明顯的缺陷，與未注射SNX7-m0rph0lin0的野生型胚胎(請參閱圖3中的B)相比，肝臟的大小僅為野生型的1/3不足。而標記胰臟內(nèi)分泌腺β細胞的組織特異性探針胰島素αnsUlin，inS，請參閱圖3中的E、F)，標記胰臟內(nèi)分泌腺a細胞的組織特異性探針胰高血糖素(Clucagon，glu，請參閱圖3中的G、H)，標記胰臟外分泌腺的組織特異性探針胰蛋白酶(Trypsin，try，請參閱圖3中的I、J)以及在耳囊、視網(wǎng)膜和內(nèi)胚層器官鰾中表達的探針Wnt2(請參閱圖3中的K、L)，這些在來源于內(nèi)胚層的消化道不同器官組織特異性標記的探針在SNX7-m0rph0lin0注射和野生型的斑馬魚胚胎中的表達均沒有明顯的差異。為了進一步確認這樣的缺失和異常的表型是由于SNX7的表達異常所致，本發(fā)明進行了斑馬魚SNX7挽救實驗，即通過體外轉(zhuǎn)錄的方式合成了人SNX7的mRNA，在注射了 SNX7-m0rph0lin0之后，立即再次注射SNX的mRNA至同一胚胎，對這樣的胚胎進行觀察發(fā)現(xiàn)，胚胎在注射之后1-3天形態(tài)和發(fā)育均正常，取3天的胚胎固定進行原位雜交顯示，在先后注射了 SNX7的morpholino和mRNA之后，肝臟特異性marker銅藍蛋白(CP)的表達與正常的胚胎幾乎看不出有明顯差異，肝臟的大小大大超過只注射了 SNX7-m0rph0lin0敲降SNX7表達的胚胎和未經(jīng)處理的野生型胚胎相仿(請參閱圖3中的D)。這個實驗有力地證明了，人為加入的人SNX7mRNA能夠特異性地逆轉(zhuǎn)由注射SNX7-m0rph0lin0而產(chǎn)生的肝臟的缺陷和發(fā)育異常，即本發(fā)明所觀察到的斑馬魚胚胎肝臟發(fā)育異常確系由于SNX7的異常表達(敲降)引起。四、SNX7基因特異地作用于肝母細胞特化形成肝細胞的階段用斑馬魚肝臟發(fā)育不同階段所特異性表達的標記基因?qū)Σ煌瑫r期的SNX7敲降和野生型的斑馬魚胚胎進行原位雜交染色，發(fā)現(xiàn)SNX7只作用于斑馬魚肝臟發(fā)育的某一特定階段，時間約為受精之后的30小時至48小時之間，結(jié)合文獻報道的斑馬魚肝臟發(fā)育模型，SNX7應(yīng)作用于肝母細胞生長和特化為肝細胞的發(fā)育階段。通過檢測細胞分裂增殖的磷酸化組蛋白H3染色，比較不同時期的SNX7敲降和未經(jīng)處理的正常胚胎，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)SNX7敲降所介導的斑馬魚肝臟發(fā)育過程的抑制不是通過抑制肝細胞的增殖來實現(xiàn)的。通過檢測細胞凋亡的TUNEL染色，比較不同時期的SNX 7敲降和未經(jīng)處理的正常胚胎，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)SNX7的敲降能夠顯著地促進某一特定發(fā)育過程(約受精后30小時至48小時)中的肝臟細胞的凋亡。為了探究SNX7究竟是在這其中的哪個或是哪幾個過程中起作用，本發(fā)明用原位雜交的方法對一系列內(nèi)胚層和肝臟發(fā)育的標記基因(marker)的表達情況進行分析。請參閱圖4，foxA3和gata6是內(nèi)胚層廣泛表達(pan-endodermal)的標記基因，它們影響著早期內(nèi)胚層的發(fā)育和分化，并在肝臟發(fā)育的第一個過程，即內(nèi)胚層細胞特化為肝母細胞的過程中起著不可替代的關(guān)鍵作用。用上述兩個基因的探針對30小時的斑馬魚胚胎進行原位雜交本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，盡管SNX7特異性敲降的胚胎表現(xiàn)出腦部和整體軀干的發(fā)育略微延遲，但胚胎整體形態(tài)基本正常，標記基因foxA3和gata6的表達水平和空間分布與野生型的胚胎相比，并無明顯的區(qū)別(請參閱圖4中的A-D)。proxl和hhex是最早表達在肝臟發(fā)育過程中的兩個基因，它們的表達貫穿斑馬魚胚胎肝臟發(fā)育的全過程，在肝臟發(fā)育的第一個階段，對于肝母細胞的形成過程是必須的，它們的正常表達也是肝母細胞形成的標志。本發(fā)明的實驗結(jié)果顯示，這兩個基因的表達在在受精后30小時的SNX7敲降胚胎和野生型的胚胎相比，也沒有發(fā)生顯著變化(請參閱圖3中的E-H)，這提示本發(fā)明在SNX7敲降的胚胎中，肝母細胞的產(chǎn)生過程和形成的數(shù)量沒有發(fā)生太大的改變。但是，隨著肝臟發(fā)育過程的進行，從受精后30小時到72小時，野生型胚胎的proxl表達有了顯著地增長，在72小時的胚胎中，proxl的表達更是描繪出了一個位于身體中軸線稍偏左的完整肝臟的輪廓(請參閱圖4中的I、K)，但與此同時，在SNX7敲降的斑馬魚胚胎中proxl的表達卻沒有觀察到相應(yīng)的增加，在受精后48小時和72小時的表達量與30小時相比，幾乎沒有增加(請參閱圖4中的J、L)。與此同時，本發(fā)明觀察到，proxl在其他部位的表達，包括同樣位于內(nèi)胚層消化道的胰臟和眼部，在48小時和72小時SNX7敲降的胚胎中卻幾乎完全正常，因此本發(fā)明可以得出初步結(jié)論SNX7對于proxl表達的調(diào)控特異性地發(fā)生在肝臟當中。同樣的結(jié)果也發(fā)生在在對受精后48小時和72小時的foxA3和gata6的觀察中。以上的結(jié)果有力地證明SNX7對于肝母細胞的形成過程并不必須，但對于隨后肝母細胞的生長和特化為肝細胞的過程卻是必不可少的。五、SNX7功能在進化上的保守性請參閱圖5，本發(fā)明運用熒光實時定量PCR方法對SNX7在信使RNA水平上在成體小鼠組織中進行了分析，在內(nèi)胚層來源的多個內(nèi)臟器官中，SNX7在肝臟中的含量是最豐富的。此外，如前文所示，本發(fā)明用人SNX7信使RNA能夠成功地挽救斑馬魚中的SNX7缺失表型，這提示SNX7的功能在進化上是高度保守的。這也就意味著SNX7抗凋亡的功能很有可能發(fā)生在高等哺乳類體內(nèi)并可能參與其他的生理和病理過程。本發(fā)明也從已有的數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)SNX7在多種人體組織中有著相比對應(yīng)正常組織十幾倍甚至幾十倍的高表達。自從1996年第一個SNX基因被發(fā)現(xiàn)以來，對于SNX家族基因的主要研究成果是在細胞水平證實了它們調(diào)節(jié)細胞膜表面多種分子的內(nèi)吞以及細胞內(nèi)蛋白的分選過程，而關(guān)于SNX基因在發(fā)育及生理過程中的功能目前還知之甚少。本研究是第一次利用斑馬魚這種模式生物，從器官發(fā)育和完整生物體的宏觀角度，系統(tǒng)地對整個SNX基因家族的功能進行研究。斑馬魚以其在胚胎早期發(fā)育研究中的獨特優(yōu)勢，成為了研究SNX基因家族在器官發(fā)育水平功能的理想模型。通過大量早期的篩查工作，我們發(fā)現(xiàn)了 SNX基因家族對于斑馬魚早期胚胎發(fā)育的多個器官和系統(tǒng)具有重要而特異性地調(diào)控作用，在這其中，SNX7對肝臟發(fā)育的表型就是特別值得關(guān)注的一個，通過一系列胚胎水平操作和實驗，我們總結(jié)出了 SNX 7對于斑馬魚肝臟早期發(fā)育的作用規(guī)律，而進一步的生理生化方法的研究，則勾勒出SNX7可能的作用機理。更為深入的研究有助于我們將SNX 7置于其在調(diào)控肝臟發(fā)育的復雜信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的正確位置，發(fā)現(xiàn)其與目前已知的調(diào)節(jié)器官發(fā)育的各個信號通路的聯(lián)系，這對于我們進一步闡明肝臟發(fā)育和分化的分子機制，將來對于肝臟疾病的機理探究和所采取治療方案的分子基礎(chǔ)，以及對于其他參與不同器官和系統(tǒng)發(fā)育過程的SNX家族成員的生理功能的揭示，都有著開拓和啟示性意義。 以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.如SEQID NO :1所示的SNX7基因調(diào)節(jié)胚胎肝臟細胞發(fā)育的方法，其特征在于，所述方法包括調(diào)整胚胎肝臟細胞中的SNX7基因的表達水平。
2.如SEQID NO :1所示的SNX7基因調(diào)節(jié)胚胎肝臟細胞發(fā)育的方法，其特征在于，所述胚胎肝臟細胞為斑馬魚胚胎肝臟細胞，所述方法包括調(diào)整斑馬魚胚胎肝臟細胞中的SNX7基因的表達水平。
3.如權(quán)利要求2所述SNX7基因調(diào)節(jié)胚胎肝臟的發(fā)育的方法，其特征在于，所述調(diào)整SNX7基因的表達水平為通過將外源人SNX7基因的mRNA導入斑馬魚胚胎肝臟細胞中來表達SNX7基因，所述調(diào)整SNX7基因的表達水平為使用基因敲降抑制斑馬魚胚胎肝臟細胞中SNX7基因的表達。
4.如權(quán)利要求2所述SNX7基因調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎肝臟細胞發(fā)育的方法，其特征在于，所述將外源人SNX7基因的mRNA導入斑馬魚胚胎肝臟細胞中來表達SNX7基因方法包括使用體外轉(zhuǎn)錄的方式合成外源人SNX7基因的mRNA。
5.如SEQID NO :1所示的SNX7基因在調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎肝臟細胞發(fā)育的應(yīng)用。
6.如SEQID NO :1所示的SNX7基因制備調(diào)節(jié)胚胎肝臟細胞發(fā)育的藥物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所示的SNX7基因制備調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎肝臟細胞發(fā)育的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明通過觀察SNX7對肝臟細胞生長的影響作用，探索其調(diào)節(jié)肝臟細胞生長的機理，并最終為以SNX7為靶點設(shè)計、開發(fā)治療肝臟疾病的藥物。本發(fā)明的技術(shù)方案為使用如SEQ ID NO1所示的SNX7基因調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎肝臟細胞發(fā)育的方法，所述方法包括調(diào)整斑馬魚胚胎肝臟細胞中的SNX7基因的表達水平。以及使用SEQ IDNO1在制備調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎肝臟細胞生長發(fā)育的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明證實了SNX7調(diào)節(jié)斑馬魚肝臟細胞生長的作用，提供了SNX7基因新作用或新藥物的應(yīng)用方式。
文檔編號C12Q1/68GK102559761SQ20111044502
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者夏健紅, 彭梅秀, 徐良亮, 殷文廣, 舒曉東, 裴端卿 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院