專利名稱：豬 MLC2 5^， 側翼啟動子區(qū) SNP 作為豬胴體性狀的遺傳標記及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及豬育種與豬的分子標記輔助選擇領域，具體涉及一種與豬的胴體性狀相關基因MLC25’側翼啟動子片段的克隆及其作為豬胴體性狀遺傳標記的應用。
背景技術：
人類對畜禽生產性能的選擇從無意識到有意識已有幾千年的歷史，而從表型選擇實踐到基因型選擇理論的探討僅是近幾十年的事情。在對畜禽生產性能進行選擇時，主要是依靠對其目標性狀的標記，而先前的生化免疫標記和細胞遺傳標記檢測位點數(shù)目有限、多態(tài)性貧乏。20世紀80年代以后，分子遺傳標記技術的誕生和逐步完善，使動物育種學家們又迅速把具有豐富多態(tài)的DNA分子標記應用到動物育種理論中。從而出現(xiàn)了以DNA分子標記技術為主的畜禽經濟性狀標記輔助選擇(marker assisted selection,MAS)育種。它 借助分子標記來選擇數(shù)量性狀的基因型，同時利用標記信息和個體表型信息，可以更為準確地估計育種值，提高選擇效率，大大加快育種進程。DNA分子標記是指能反應生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它能直接反映基因組DNA間的差異。從1974年Grozdicker首創(chuàng)了第一代分子標記至今，DNA分子標記先后產生了三代幾十個種類。第一代為RFLP，第二代為SSR、RAPD, AP-PCR、EST等,第三代為單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)。SNP是由美國麻省理工學院的 Lander ES 于 1996 年提出的(Lander ES. The new genomics globalviews ofbiology. Science. 1996,274:536-539)。SNP 是指同一位點的不同等位基因之間僅有個別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等。SNP標記在大多數(shù)基因組中存在較高的頻率、數(shù)量豐富，其有望成為最重要最有效的分子標記。根據(jù)SNP在基因中的位置可分為基因編碼區(qū) SNP(coding-region SNP, cSNP)、基因周邊 SNP(perigenic SNP, pSNP)以及基因間SNP(intergenic SNP, iSNP)三類。SNP在DNA分子上分布不均勻，在非轉錄區(qū)SNP頻率要高于轉錄區(qū)SNP頻率，這可能是受進化中選擇的壓力影響。轉錄區(qū)的SNP —般與蛋白的表達有關，而非轉錄區(qū)的SNP則可以調控基因的表達。所以這兩類SNP不僅都可以作為分子標記，還可能與一些動物的生產性狀有直接關系。啟動子是真核生物基因表達調控的順式作用元件，位于結構基因5'端上游區(qū)，含有基因表達調控網絡的重要信息，基因表達的強度以及特異性很大程度上決定于它。因此，研究功能基因5’側翼序列啟動子中的SNP可能有更重要的生物學功能，能夠影響基因的表達。MLC2 (myosin light chain 2)編碼肌球蛋白輕鏈2,是肌球蛋白的重要組分(肌球蛋白的凝聚狀態(tài)以及熱誘導時的凝膠特性對肉制品的質構、脂肪和水的結合能力等有很大影響)，對肌球蛋白的結構和功能顯示重要調節(jié)作用，在肌肉的發(fā)生過程中起著調控重鏈表達的作用。MLC2屬于肌鈣蛋白C超家族，能夠可逆的由肌球蛋白輕鏈磷酸酯酶MLCP脫磷酸化和Ca2+/CaM依賴的肌球蛋白輕鏈激酶MLCK磷酸化，參與調節(jié)肌動蛋白與肌球蛋白互作、Ca2+敏感性、葡萄糖轉運和影響肌肉性能的其他相關參數(shù)。另外，MLC2也是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶的底物，能被有絲分裂因子活化蛋白激酶(MAPK)激活，參與多種細胞信號途徑。Davoli等已將其定位于豬的3號染色體短臂(Davoli et al. Identificationof SNPs, mapping and analysis of allele frequencies in two candidate genes formeat production traits :the porcine myosin heavy chain 2B(MYH4)and the skeletalmuscle myosin regulatory light chain 2(HUMMLC2B). Anim Genet. 2003, 34 :221-225)，徐德全等從雜交親代大白豬與子代長大豬的背最長肌的消減cDNA文庫中篩選到其EST，利用電腦克隆和SMART等技術，獲得了其cDNA全長序列和全部內含子序列(GenBank登錄號分別為 AY754870 和 AY870651, Xu et al. Identification of a differential geneHUMMLC2B between Fl hybrids LandraceXYorkshire and their female parentsYorkshire. Gene, 2005, 352 :118-126)。但有關豬MLC2啟動子區(qū)SNP的研究至今還未見報道。因此在分子水平上研究豬MLC2基因啟動子區(qū)的SNP，分析其與豬胴體等經濟性狀關系，具有重要的意義
發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于克隆豬MLC25’側翼啟動子區(qū)225bp的序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1(大白豬)和SEQ ID N0:2(梅山豬)所示。通過對2個豬種的上述序列進行Cluster W比對，尋找SNP位點，建立相應的SNP分型方法，分析其與與豬胴體性狀的關系，為豬的胴體性狀標記輔助選擇提供有用的遺傳標記。本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)選擇中國地方豬種梅山豬和外來的歐洲大白豬為實驗材料，從豬血液中提取基因組DNA，以豬MLC2基因的mRNA序列為種子，在豬的基因組中進行比對，根據(jù)其5’側翼序列設計如下引物正向引物F : 5 ’ TATCCTTCTGTCCTCCTG 3，，反向引物R : 5 ’ CTCTATGACCTTGGACTTG 3 ’。利用該引物進行PCR擴增，PCR產物回收、克隆、測序后，利用Cluster W進行序列比對。本發(fā)明提供了豬MLC25’側翼啟動子區(qū)即位于該225bp擴增片段內部的I處核苷酸多態(tài)性(SNP)，即在所述的序列表SEQ ID NO 1的53bp處存在一個C/A的突變，在序列表SEQ ID NO :2的53bp處存在一個A/C突變，上述等位基因的突變導致Hinf I酶切位點的改變。其SNP位點如圖2所示。本發(fā)明提供了檢測上述序列53bp處A/C變異的HinfI-RFLP基因型分型方法。進一步本發(fā)明提供了利用HinfI-RFLP方法確定不同基因型個體與豬胴體性狀之間的相關關系的關聯(lián)分析的應用。本發(fā)明進一步克隆了不同基因型大白豬和梅山豬的MLC2基因5’側翼啟動子901bp序列。分別構建重組質粒，轉染C2C12細胞，觀察不同基因型MLC2基因5’側翼啟動子序列在細胞中的活性。


序列表SEQ ID NO 1是所克隆到的大白豬MLC2基因5’側翼啟動子區(qū)的核苷酸序列，長度為225bp。序列表SEQ ID NO 2是所克隆到的梅山豬MLC2基因5’側翼啟動子區(qū)的核苷酸序列，長度為225bp。圖I是大白豬和梅山豬MLC2基因5’側翼啟動子區(qū)225bp片段的擴增條帶圖中M為DL2000Marker ；泳道1_3為以大白豬基因組DNA為模板的擴增條帶；泳道4_5為以梅山豬基因組DNA為模板的擴增條帶。圖2是大白豬和梅山豬MLC2基因5’側翼啟動子區(qū)225bp序列的比對結果和SNP位點。圖3是MLC25’側翼區(qū)HinfI-RFLP檢測結果瓊脂糖濃度為2% ;圖中泳道M為DL2000Maker ；

圖4是不同基因型大白豬和梅山豬的MLC2基因5’側翼901bp啟動子PCR擴增圖中M為DL2000Marker ;泳道1_3為以大白豬基因組DNA為模板的擴增條帶；泳道4_5為以梅山豬基因組DNA為模板的擴增條帶。圖5是用于分析不同基因型MLC2基因5’側翼啟動子活性的PGL3_basiC載體結構示意圖。圖6是不同基因型MLC2基因5’側翼啟動子轉染C2C12細胞的結果。
具體實施例方式實施例I利用苯酌■抽提法提取大白豬和梅山豬血液總DNA將現(xiàn)場所采大白豬(來自華中農業(yè)大學試驗豬場，為常規(guī)報道的品種，下同)新鮮血液加入0. 5M乙二胺四乙酸(即EDTA，購自武漢市江潤精細化工有限責任公司)作為抗凝劑(按血液量體積比的1/10)，并搖勻，防止凝血。白細胞分離(I) 4°C, 6000rpm,離心 IOmin,去血清。(2)加入2倍體積雙蒸水，輕輕搖勻沉淀lOmin，破碎紅細胞。(3) 40C，6OOOrpm,離心 lOmin，去上層紅細胞漿。(4)利用0. 9% NaCl洗漆沉淀,輕輕搖勻lOmin。(5)4°C,6000rpm,離心lOmin,棄上清,得到白細胞沉淀?？侱NA 提取(I)在白細胞沉淀或肌肉組織磨碎漿液中，加入等體積lXSET(lml)，蛋白酶K(10mg/mL)至終濃度100 y g/mL，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度0. 5%，搖勻，55°C水浴搖床中溫育過夜消化。(2)在消化液中加入等體積的Tris飽和酹,輕輕搖勻15min,于4°C、IlOOOrpm離心lOmin，小心吸取上清液轉移至另一離心管中，注意標上相應的記號。(3)加等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(體積比25 24 I)，緩慢顛倒離心管IOmin,于低溫冷凍離心機中4°C、IlOOOrpm離心lOmin，小心吸取上清，轉移至另一個干凈的離心管中。(4)加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比24 : I),緩慢顛倒離心管lOmin，于低溫冷凍離心機中4°C、IIOOOrpm離心lOmin。
(5)將上清液吸入標記好的的離心管中，加入2倍體積的預冷無水乙醇，小心混勻后可見白色絮狀DNA沉淀。(6)用槍頭將DNA沉淀挑出，置于裝有對應號碼的EP管中，室溫下讓乙醇揮發(fā)干凈，加入適量的超純水溶解DNA。(7)在DNA濃度測定儀上測定其濃度與純度，并在I %瓊脂糖凝膠80伏電泳約2h，紫外燈下檢測DNA提取質量。實施例2 :豬MLC25’側翼啟動子區(qū)特異DNA片段的獲得及SNP檢測方法的建立選擇外來血緣豬“大白豬”和中國地方豬種“梅山豬”(來自華中農業(yè)大學試驗豬場，為常規(guī)報道的品種)為試驗材料，以豬MLC2基因(登錄號AY754870)的mRNA序列為種子，在豬的基因組中進行比對，根據(jù)其5’側翼序列設計如下引物正向引物 F : 5 ’ TATCCTTCTGTCCTCCTG 3， 反向引物R : 5 ’ CTCTATGACCTTGGACTTG 3 ’分別以大白豬(國外血緣豬品種)和梅山豬(中國地方豬品種)血液基因組DNA為模板，用上述引物對進行PCR擴增(見圖I)。PCR反應體系見表I。表IPCR反應體系
權利要求
1.豬MLC2基因5’側翼啟動子片段作為豬胴體性狀的遺傳標記，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示，在所述的SEQ ID NO 1的53bp處存在一個C/A的突變，在SEQ ID N0:2的53bp處存在一個Α/C突變，導致HinfI酶切位點的改變，引起HinfI-RFLP 多態(tài)性。
2.根據(jù)權利要求I所述的遺傳標記，其中克隆豬MLC2基因5’側翼啟動子片段所用引物的DNA序列如下所示 正向引物 F:5’ TATCCTTCTGTCCTCCTG 3’， 反向引物 R :5’ CTCTATGACCTTGGACTTG 3’。
3.一種篩選豬胴體性狀遺傳標記的方法，其特征在于，按照以下步驟 以豬MLC2基因的mRNA序列為種子，在豬的基因組中進行比對，以其5’側翼序列為靶序列設計引物，得到如權利要求2所示引物；從豬血液中提取基因組DNA，用權利要求2所示的引物在豬基因組DNA中進行PCR擴增，PCR產物純化和克隆測序，獲得如序列表SEQ IDNO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；通過序列比對，篩查SNP及其所在限制性內切酶識別位點，進行酶切分型，構建不同基因型的重組質粒，轉染細胞，觀察不同基因型的轉錄活性，分析不同基因型與豬胴體性狀的相關關系。
4.權利要求I所述的遺傳標記在豬胴體性狀標記輔助選擇中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于豬分子標記制備技術領域，具體涉及一種豬MLC2的5’側翼啟動子片段作為豬胴體性狀的遺傳標記及制備方法與應用。該遺傳標記具有如序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的序列的第53bp處分別存在一個C/A和A/C的突變，該等位基因的突變引起DraIII-RFLP的多態(tài)性。利用該遺傳標記對大白豬和梅山豬F2代進行了與豬胴體性狀的關聯(lián)分析，檢測了不同基因型的啟動子的轉錄活性。本發(fā)明還公開了該遺傳標記的分型檢測方法，為豬胴體性狀分子標記輔助選擇提供了新的遺傳標記和檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK102776273SQ201110445328
公開日2012年11月14日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權日2011年12月26日
發(fā)明者劉倩, 劉敏, 夏曉亮, 孫小瑞, 徐德全, 熊遠著 申請人:華中農業(yè)大學