專利名稱：人胚源性神經(jīng)干細胞分化誘導過程中的細胞克隆誘導分化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人胚源性神經(jīng)干細胞分化誘導過程中的細胞克隆誘導分化方法，其應用于人胚源性神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)細胞的正常成人腦脊液誘導過程。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細胞是一種具有自我更新及廣泛分化潛能的細胞，它處于分化的非終末狀態(tài)，可通過對稱或不對稱分裂出新的干細胞或分化潛能逐漸變小的子細胞，最終產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的3種主要細胞，即神經(jīng)元細胞、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。人胚來源的神經(jīng)干細胞除具有上述特點外，更以其與人體組織相容性好的的優(yōu)點成為神經(jīng)移植治療的理想細胞。目前誘導神經(jīng)干細胞體外分化的方法很多，最常用的是血清，而神經(jīng)干細胞在腦脊液中的存活和分化情況尚不明確。本發(fā)明通過神經(jīng)干細胞在腦脊液環(huán)境中的培養(yǎng)，為神經(jīng)干細胞的移植治療提供理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提出一種人胚源性神經(jīng)干細胞分化誘導過程中的細胞克隆誘導分化方法，其應用于人胚源性神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)細胞的正常成人腦脊液誘導過程，所述誘導過程應用正常成人腦脊液培養(yǎng)基(DMEM/F12+B27+30%腦脊液)將原代培養(yǎng)的人胚來源的神經(jīng)干細胞分化誘導為各類神經(jīng)細胞，在分化的不同時間對分化的細胞進行免疫細胞化學染色，計算各類神經(jīng)細胞的比例。最終分別占(10. 88士0.79)%、 (86. 70 士 1. 99) %，少突膠質(zhì)細胞很少只有0 % 2 %。具體的，本發(fā)明的人胚源性神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)細胞的正常成人腦脊液誘導過程包括如下步驟Sl 原代細胞的分離和培養(yǎng)取胚齡13周水囊引產(chǎn)的新鮮人胚胎，無菌條件下分離出胚胎大腦皮層組織，剝除腦膜及表面血管，在PBS液中漂洗3次，用細吸管反復吹打組織碎塊至完全散開，離心洗滌后吹打制成細胞懸液，經(jīng)100目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，制成單細胞懸液，加入含 B 27(1 50) (GibcoBRL)和 EGF (Serotec. )20ng/ml、bFGF (Chemicon) 20ng/ ml的DMEM/F12(1 1) (GibcoBRL)無血清培養(yǎng)基，臺盼藍染色計數(shù)活細胞，調(diào)整細胞濃度為IX 105/ml，將原代細胞種植于25cm2培養(yǎng)瓶(8ml細胞懸液/瓶)，37°C、5 % (X)2條件下靜置培養(yǎng)。S2:克隆誘導分化選取單細胞形成的克隆球，機械分離成單細胞懸液，種植于多個培養(yǎng)皿中，置入多聚賴氨酸包被的玻片，用含有正常成人腦脊液培養(yǎng)基(DMEM/ F12+B27+30%腦脊液)培養(yǎng)，觀察其生長分化情況，分別于1、3、7、14、21d行免疫細胞化學染色檢測。S3 免疫細胞化學染色將貼附有細胞的玻片取出用4%多聚甲醛固定，用SABC組織化學染色試劑盒分別檢測神經(jīng)微絲(neurofilament，NF)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、 feilc在分化細胞中的表達。S4 細胞計數(shù)免疫細胞化學染色NF(+)的細胞代表神經(jīng)元，GFAP (+)細胞代表星型膠質(zhì)細胞，Galc (+)細胞代表少突膠質(zhì)細胞，蘇木精復染成藍色的細胞代表總細胞數(shù)。倒置顯微鏡下O0X)對分化的細胞隨機選擇6個獨立視野計數(shù)NF (+)的細胞數(shù)、GFAP (+)細胞數(shù)、Galc (+)細胞數(shù)及總細胞數(shù)，計算各系細胞比例并求其平均數(shù)。本發(fā)明的實驗結(jié)果表明，在最早期的分化當中神經(jīng)元占的比例較高，約為 27. 25%，正常成人腦脊液能誘導人胚來源的神經(jīng)干細胞分化成神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞，與在胎牛血清中的分化相比星型膠質(zhì)細胞比例增多，而其他類型細胞比例無顯著性差異。神經(jīng)干細胞在腦脊液中可以存活和分化，為神經(jīng)干細胞的移植治療提供理論依據(jù)。


通過下面結(jié)合附圖的詳細描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。其中圖1所示為本發(fā)明的人胚源性神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)細胞的正常成人腦脊液誘導方法的步驟示意圖。
具體實施例方式如圖1所示為本發(fā)明的人胚源性神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)細胞的正常成人腦脊液誘導方法的步驟示意圖，所述方法具體實施步驟如下Sl 原代細胞的分離和培養(yǎng)取胚齡13周水囊引產(chǎn)的新鮮人胚胎，無菌條件下分離出胚胎大腦皮層組織，剝除腦膜及表面血管，在PBS液中漂洗3次，用細吸管反復吹打組織碎塊至完全散開，離心洗滌后吹打制成細胞懸液，經(jīng)100目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，制成單細胞懸液，加入含 B 27(1 50) (GibcoBRL)和 EGF (Serotec. )20ng/ml、bFGF (Chemicon) 20ng/ ml的DMEM/F12(1 1) (GibcoBRL)無血清培養(yǎng)基，臺盼藍染色計數(shù)活細胞，調(diào)整細胞濃度為IX 105/ml，將原代細胞種植于25cm2培養(yǎng)瓶(8ml細胞懸液/瓶)，37°C、5 % (X)2條件下靜置培養(yǎng)。S2:克隆誘導分化選取單細胞形成的克隆球，機械分離成單細胞懸液，種植于多個培養(yǎng)皿中，置入多聚賴氨酸包被的玻片，用含有正常成人腦脊液培養(yǎng)基(DMEM/ F12+B27+30%腦脊液)培養(yǎng)，觀察其生長分化情況，分別于1、3、7、14、21d行免疫細胞化學染色檢測。S3 免疫細胞化學染色將貼附有細胞的玻片取出用4%多聚甲醛固定，用SABC 組織化學染色試劑盒分別檢測神經(jīng)微絲(neurofilament，NF)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、 feilc在分化細胞中的表達。S4細胞計數(shù)免疫細胞化學染色NF (+)的細胞代表神經(jīng)元，GFAP (+)細胞代表星型膠質(zhì)細胞，Galc (+)細胞代表少突膠質(zhì)細胞，蘇木精復染成藍色的細胞代表總細胞數(shù)。倒置顯微鏡下(20 X)對分化的細胞隨機選擇6個獨立視野計數(shù)NF (+)的細胞數(shù)、GFAP (+)細胞數(shù)、Galc (+)細胞數(shù)及總細胞數(shù)，計算各系細胞比例并求其平均數(shù)。
實驗結(jié)果及分析如下人胚來源的神經(jīng)干細胞在體外懸浮生長，常聚集成球即神經(jīng)球(neurosphere)。 將生長良好的神經(jīng)球種植在經(jīng)多聚氨酸處理的培養(yǎng)皿中，在含有正常成人腦脊液培養(yǎng)基 (DMEM/F12+B27+30%腦脊液)中可發(fā)現(xiàn)神經(jīng)球貼壁現(xiàn)象。神經(jīng)球在新鮮正常成人腦脊液中的分化過程與在胎牛血清中的相似，只是貼壁時間較晚04 48h)，貼壁的神經(jīng)球有 50% 90%，未貼壁的神經(jīng)球?qū)⒅饾u死亡。貼壁的神經(jīng)球2天后，周圍即有細胞分化游出， 神經(jīng)球的直徑放射狀擴大，聚集著許多由神經(jīng)球中遷移出來的單極和多極細胞，形狀酷似神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。隨著時間延長，神經(jīng)球周圍游離出來的細胞越來越多，這些細胞通過突起與鄰近細胞形成聯(lián)系，3周以后這些細胞不再增多，呈穩(wěn)定狀態(tài)。免疫細胞化學顯示，含有正常成人腦脊液培養(yǎng)基中，從神經(jīng)球中游離分化出的細胞成單極或多極，細胞化學分別為NF(+)細胞、GFAP(+)細胞和細胞。其中NF(+) 細胞由開始時的06士3.40) %降至(10. 00士0. 74)%，GFAP⑴細胞數(shù)逐漸增多，從 (73. 53% 士3. 40)%升至(89. 83% ±1.96) %0 Galc (+)細胞在整個分化過程中均很少， 且在1周后才出現(xiàn)，約占0% 1.8%。NESTIN陽性細胞數(shù)成直線下降，貼壁神經(jīng)球細胞呈 Nestin抗原全陽性，使整個神經(jīng)球體成藍色(間接熒光染色)，14d時尚可見部分陽性細胞， 21d尚有少量Nestin表達，30d后Nestin染色幾無陽性表現(xiàn)。以上結(jié)果表明，在最早期的分化當中神經(jīng)元占的比例較高，約為27. 25%，正常成人腦脊液能誘導人胚來源的神經(jīng)干細胞分化成神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞，與在胎牛血清中的分化相比星型膠質(zhì)細胞比例增多，而其他類型細胞比例無顯著性差異。神經(jīng)干細胞在腦脊液中可以存活和分化，為神經(jīng)干細胞的移植治療提供理論依據(jù)。本發(fā)明并不局限于所述的實施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護范圍以權(quán)利要求書限定的范圍為準。
權(quán)利要求
1. 一種人胚源性神經(jīng)干細胞分化誘導過程中的細胞克隆誘導分化方法，其應用于人胚源性神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)細胞的正常成人腦脊液誘導過程，所述誘導過程包括步驟原代細胞的分離和培養(yǎng)、克隆誘導分化、免疫細胞化學染色以及細胞計數(shù)；其中所述克隆誘導分化的步驟具體為選取單細胞形成的克隆球，機械分離成單細胞懸液，種植于多個培養(yǎng)皿中，置入多聚賴氨酸包被的玻片，用含有正常成人腦脊液培養(yǎng)基(DMEM/F12+B27+30%腦脊液)培養(yǎng)，觀察其生長分化情況，分別于l、3、7、14、21d行免疫細胞化學染色檢測；。
全文摘要
本發(fā)明提出一種人胚源性神經(jīng)干細胞分化誘導過程中的細胞克隆誘導分化方法，其應用于人胚源性神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)細胞的正常成人腦脊液誘導過程，所述誘導過程包括如下步驟原代細胞的分離和培養(yǎng)；克隆誘導分化；免疫細胞化學染色；以及細胞計數(shù)。本發(fā)明應用正常成人腦脊液培養(yǎng)基將原代培養(yǎng)的人胚來源的神經(jīng)干細胞分化誘導為各類神經(jīng)細胞，在分化的不同時間對分化的細胞進行免疫細胞化學染色，計算各類神經(jīng)細胞的比例。其誘導人胚來源的神經(jīng)干細胞分化成神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞，與在胎牛血清中的分化相比星型膠質(zhì)細胞比例增多，而其他類型細胞比例無顯著性差異。神經(jīng)干細胞在腦脊液中可以存活和分化，為神經(jīng)干細胞的移植治療提供理論依據(jù)。
文檔編號C12N5/0735GK102533638SQ20111044791
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者陸華 申請人:陸華