專利名稱：Cav-1穩(wěn)定低表達的SMMC-7721細胞系及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到細胞生物學(xué)技術(shù)，具體涉及一種采用Cav-ISiRNA干擾技術(shù)構(gòu)建Cav-I穩(wěn)定低表達的SMMC-7721細胞系的方法。
背景技術(shù)：
窖蛋白(Caveolin)是構(gòu)成細胞膜上胞膜窖主要結(jié)構(gòu)的標志蛋白，由Caveolin基因家族編碼而成。Caveolin-I(Cav-I)基因是Caveolin基因家族的成員之一，是caveolae的主要結(jié)構(gòu)成分，參與許多細胞過程調(diào)節(jié)，包括細胞信號傳導(dǎo)的調(diào)控等。在乳腺癌中，Cav-I與ERa 36相互作用調(diào)節(jié)的膜起始雌激素信號通路可以控制乳腺細胞轉(zhuǎn)化；在神經(jīng)細胞中，Cav-I蛋白與動物發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，可能參與中樞可塑性的調(diào)節(jié)。Cav-I在一定時期分化的成纖維細胞，脂肪細胞，內(nèi)皮細胞中高度表達。有證據(jù)證明Cav-I在成纖維細胞中扮演著腫瘤抑制器的角色。腫瘤的發(fā)生是一個長期的、分階段的、多種基因參與的復(fù)雜過程。眾多研究表明Cav-I在正常組織中高表達，而在乳腺癌、肺癌、宮頸癌、卵巢癌和結(jié)腸癌中表達明顯下降，在甲狀腺濾泡狀癌中甚至無表達。但同時也有研究發(fā)現(xiàn)Cav-I在某些腫瘤組織中呈高表達，如Yang等研究發(fā)現(xiàn)在大鼠正常前列腺上皮細胞中Cav-I表達微弱；在原發(fā)性前列腺癌細胞中其表達加強。相關(guān)文獻顯示Cav-I是肝再生所必需的蛋白質(zhì)，在脂滴和新生細胞膜的形成中發(fā)揮著重要作用。肝細胞中的Cav-I可能同樣參與細胞的增殖調(diào)控及癌變過程。由此可見Cav-I與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、臨床表現(xiàn)及治療均有關(guān)系。但目前有關(guān)Cav-I在肝癌細胞中的作用及其機制尚未完全闡明。原因之一可能是肝癌細胞中內(nèi)源性的Cav-I具有干擾作用。因此消除內(nèi)源性的Cav-I的干擾將會為研究Cav-I在肝癌中的作用創(chuàng)造有利條件。已有文獻報道的Cav-I低表達的肝癌細胞有兩個來源。一種是通過構(gòu)建人Cav-IRNA干擾慢病毒載體的方式轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株SMMC-7721，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SMMC-77215天后，對其Cav-ImRNA表達水平的敲除率達90%。另一種是通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的Cav-I反義寡核苷酸瞬時轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞。但至今為止，在人肝癌細胞中尚未見到用siRNA干擾轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的方法通過藥物篩選使Cav-I基因沉默的報道。原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，全球范圍內(nèi)發(fā)病率居所有惡性腫瘤第五位，死亡率居第三位，全世界每年新發(fā)肝癌中42%出現(xiàn)在我國大陸。因此更好地建立一系列人肝癌細胞系將會為肝癌發(fā)病機理的研究和臨床治療提供必要的基礎(chǔ)。RNA干擾技術(shù)是近年來快速發(fā)展起來的一項基因沉默技術(shù)，RNA干擾也成轉(zhuǎn)錄后基因沉默，是由雙鏈RNAWouble-strandedRNA，dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制。它的出現(xiàn)為分析基因功能和信號傳導(dǎo)通路以及基因治療方面都提供了一種新的研究手段，與傳統(tǒng)的反義核酸，基因剔除等技術(shù)相比，具有特異性強，針對性強，級聯(lián)放大等優(yōu)點。它將會成為攻克腫瘤、心血管病、傳染性疾病等疑難頑癥最銳利的武器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種Cav-I低表達的SMMC-7721細胞系的構(gòu)建方法。本發(fā)明采用Cav-ISiRNA干擾技術(shù)構(gòu)建Cav-I穩(wěn)定低表達的SMMC-7721細胞系，即SMMC-7721KD細胞系。SMMC-7721細胞購自于中國科學(xué)院上海細胞庫，它來自于一位50歲男性肝癌患者，由第二軍醫(yī)大學(xué)董榮春等人建立，貼壁生長，屬上皮細胞，具有致瘤性，該細胞的Cav-I表達很1 OCav-I是細胞膜上重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，對膜上多種生長因子受體和信號通路起調(diào)節(jié)作用，參與細胞的生長、分化、增殖和腫瘤發(fā)生的生理和病理過程。構(gòu)建Cav-ISiRNA的psiRNA-CAVl干擾質(zhì)粒，并進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞，然后對轉(zhuǎn)染后的細胞進行博萊霉素篩選，傳代，建立穩(wěn)定低表達的SMMC-7721KD細胞系，沉默SMMC-7721細胞中Cav-I的表達80%左右，并且Cav-I穩(wěn)定低表達。SMMC-7721KD細胞系可作為模型，進行Cav-I參與的一些腫瘤細胞的研究，Cav-I與肝癌的相關(guān)性及其機理研究。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)本發(fā)明的一方面在于Cav-l穩(wěn)定低表達的SMMC-7721細胞系的構(gòu)建方法，包括如下步驟(a)設(shè)計對應(yīng)Cav-I基因的shRNA的兩條單鏈DNA模板，其堿基序列為SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO 2 ；(b)構(gòu)建含有上述堿基序列 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 的 psiRNA-hHlzeo G2重組質(zhì)粒；(c)利用如步驟(b)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細胞SMMC-7721得到的重組細胞株；(d)將步驟(c)所得重組細胞株經(jīng)過kocin篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞M小時一次換液，四天傳代1次，傳至第七代時，Cav-I穩(wěn)定低表達，第八代細胞擴大培養(yǎng)，并凍存細胞，獲得陽性克隆細胞系；其中，上述Wkocin篩選培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基加10%新生牛血清，再加 100ug/L Zeocin ；(e)將步驟(d)篩選所得的陽性克隆細胞株利用Western Blotting方法和/或X射線照射聯(lián)合平板克隆形成實驗法檢測。在上述的構(gòu)建方法中，步驟(b)所述的構(gòu)建方法包括如下步驟(f)將轉(zhuǎn)錄模板核苷酸序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2在80°C退火2min，自然冷卻至35°C得到退火產(chǎn)物；(g)用T4DNA連接酶將步驟(f)所得產(chǎn)物與對質(zhì)粒psiRNA-hHlzeo G2進行Bbs I酶切后的線性化載體在16°C連接，過夜；(h)將步驟(g)獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli DH5a后，經(jīng)細胞培養(yǎng)、提取質(zhì)粒、測序鑒定結(jié)果如SEQ ID NO :3。本發(fā)明的另一方面在于利用上述構(gòu)建方法所獲得的Cav-I穩(wěn)定低表達的SMMC-7721 細胞系。


圖1 為載體psiRNA-CAVl的酶切圖。其中A為psiRNA-CAVl電泳圖，M代表DL2000marker ； 1代表psiRNA-CAVl質(zhì)粒；B為質(zhì)粒酶切之后的電泳圖，1為環(huán)狀質(zhì)粒，2為使用I^st I產(chǎn)生的線性質(zhì)S^^bp ;3為使用I^st I和EcoR V酶切之后產(chǎn)生的兩個片段大約為 1265bp 和 1363bp。圖2 為細胞轉(zhuǎn)染后第3代，第5代，第6代，第7代，細胞中Cav-I表達下調(diào)的western blot結(jié)果圖；其中上圖為Cav-I和β -actin的western blot結(jié)果經(jīng)X光醫(yī)學(xué)膠片感光圖，C代表SMMC-7721對照，3、5、6、7代表SMMC-7721KD傳代的代數(shù)；下圖為對膠片進行計算機掃描定量分析，用掃描儀和凝膠成像系記錄相應(yīng)條帶的透射光積分吸光度值(IOD)，反映樣品的蛋白量。(β -Actin為內(nèi)參)。圖3 為瞬時轉(zhuǎn)染Cav-IsiRNA質(zhì)粒，SMMC-7721細胞中Cav-I的表達下降的western blot結(jié)果圖；其中上圖為SMMC-7721對照細胞和SMMC-7721KD細胞經(jīng)westernblot，Cav-I和β-actin X光醫(yī)學(xué)膠片感光圖，下圖為對膠片進行計算機掃描定量分析，用掃描儀和凝膠成像系記錄相應(yīng)條帶的透射光積分吸光度值(IOD)，反映樣品的蛋白量。(β-Actin 為內(nèi)參)。圖4 為X射線照射之后SMMC-7721細胞和SMMC-7721KD兩種細胞的平板克隆實驗克隆集落數(shù)目圖；其中0Gy，2Gy，4Gy，6Gy代表X射線不同輻射劑量的克隆集落，Gy為放射劑量單位。圖5 為X射線照射之后SMMC-7721細胞和SMMC-7721KD兩種細胞的平板克隆實驗統(tǒng)計的細胞存活曲線圖；其中縱坐標表示細胞存活率，橫坐標表示X射線放射劑量Gy。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述各限制性內(nèi)切酶Kds I, Pst I和EcoR V均購自于寶生物工程(大連)有限公司；Fast-Media TB 液體培養(yǎng)基含 kocin 100g/L，購自于美國 hvivogen 公司；Fast-Media 購自于 Invivogen，商品貨號 fas-zn-l ；質(zhì)粒psiRNA-hHlzeo G2 購自于美國 hvivogen 公司，商品貨號 psirnal-zll ；T4DNA連接酶購1自于寶生物工程(大連)有限公司；TaKaRa Code :D2011A ；IOXT4DNA連接酶緩沖液購自于寶生物工程(大連)有限公司；TaKaRa Code D2011A ；大腸桿菌GT116感受態(tài)細胞購自于美國hvivogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自于OMEGA公司，商品貨號D6948-02 ；0. 25%胰蛋白酶消化液稱取0. 25g胰蛋白酶粉，溶于100ml PBS溶液，完全溶解后過濾除菌，用7. 4% NaHCO3調(diào)pH為7. 4，密封后4°C保存；博來霉素(Zeocin)購自于hvitrogen，商品貨號RT250 ；lifpofectamine 2000Reagent 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒(內(nèi)含有 Opti-ΜΕΜ 和lifpofectamine 2000)購自于 Invitrogen，商品貨號 11668-019 ；新生牛血清購自Gibco ，商品貨號16010-142 ；
無血清培養(yǎng)基即RPMI-1640培養(yǎng)基，購自于Gibco ，商品貨號31800-014 ；配制方法一袋培養(yǎng)基(10. 4g)溶于IL雙蒸水，加入碳酸氫鈉2克，溶解，過濾，4度保存。雙倍血清培養(yǎng)基RPMI_1640培養(yǎng)基加20%新生牛血清；正常血清培養(yǎng)基RPMI_1640培養(yǎng)基加10%新生牛血清；kocin篩選培養(yǎng)基RPMI_1640培養(yǎng)基加10%新生牛血清，再加kocin，使其工作濃度為100ug/L ；聚偏二氟乙烯膜PVDF膜；PS-9型半干式轉(zhuǎn)移電泳儀大連竟邁生物科技有限公司；Cav-I—抗購自于 cell signaling，商品貨號 3238 ；β -actin 一抗購自于武漢博士德生物工程有限公司，商品貨號BM1453 ；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG:購自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，商品貨號ZB2305 ；辣根酶標記山羊抗兔IgG:購自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，商品貨號ZB2301 ；BeyoECL Plus超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，購自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，商品貨號P0018 ；苯甲基磺酰氟(PMSF)購自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，商品貨號ST506 ；RIPA 裂解液配制:5mol/L NaCl 終濃度 0. 15mol/L, TritonX-100 終濃度 1 %，Deoxycholic acid Sodium Salt 終濃度 1 %，SDS 終濃度 0. 10%, Tris-HCl (PH7. 4)終濃度10mmol/Lo 使用前加 PMSF。IOOmmol/L PMSF :0. 1742g PMSF 溶于 IOml 的異丙醇中，4°C保存。IXPBS 緩沖液稱取 NaCl 8. 5g, KCl 0. 2g, Na2HPO4 · 12H20 2. 85g, KH2PO4O. 27g,溶于600ml ddH20中，調(diào)節(jié)pH至7. 2-7. 4后再加ddH20定容至1000ml，過濾除菌，4°C保存。PBST 緩沖液IXPBS 緩沖液加入 Tween-20，Tween-20 濃度為 0. 1%。實施例1細胞株的構(gòu)建一 . Cav-I特異性shRNA轉(zhuǎn)錄模板的設(shè)計根據(jù)載體酶切位點的要求和hvivogen公司提供的網(wǎng)上設(shè)計軟件，設(shè)計出1對小干擾RNA的轉(zhuǎn)錄模板。對應(yīng)在Cav-I基因上的位置(GenBank BT007143)，其具體序列為SEQID NO :1和SEQ ID NO :2 (siRNA靶點GC百分比為38. 10%，位點為400)。并送至大連寶生物公司合成。二. Cav-1特異性s iRNA表達載體的構(gòu)建將轉(zhuǎn)錄模板核苷酸序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2在80°C退火2min，自然冷卻至35°C得到退火產(chǎn)物；Bbs I (雙酶切位點)對質(zhì)粒psiRNA-hHlzeo G2進行雙酶切，瓊脂糖凝膠(瓊脂糖濃度10g/L)電泳回收大片段(2905bp)；T4DNA連接酶連接回收片段和退火產(chǎn)物，16°C連接，過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌GTl 16感受態(tài)細胞。用轉(zhuǎn)化后菌體涂布具有kocin (100g/L)抗性的i^ast-Media 瓊脂平板，37°C過夜培養(yǎng)。
挑取單克隆，在含kocin 100g/L的i^ist-Media TB液體培養(yǎng)基中擴增，并用OMEGA公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。所得質(zhì)粒用I^st I單酶切或I^st I和EcoRV雙酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度10g/L)，分別產(chǎn)生出大小為^^bp的線性質(zhì)粒和大小約1265bp及1363bp的DNA片段，證明連接正確(圖1A，1B)，進一步測序，測序結(jié)果如SEQ ID NO :3，證實序列完全正確。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為psiRNA-CAVl。圖1 為載體psiRNA-CAVl的酶切圖。其中A為psiRNA-CAVl電泳圖，M代表DL2000marker ； 1代表psiRNA-CAVl質(zhì)粒；B為質(zhì)粒酶切之后的電泳圖，1為環(huán)狀質(zhì)粒，2為使用I^st I產(chǎn)生的線性質(zhì)S^^bp ;3為使用I^st I和EcoR V酶切之后產(chǎn)生的兩個片段大約為 1265bp 和 1363bp。三.轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒載體psiRNA-CAVl瞬時轉(zhuǎn)染正常人肝癌細胞SMMC7721細胞，并篩選Cav-I穩(wěn)定低表達的SMMC-7721KD細胞系。(1)將生長狀態(tài)良好的SMMC-7721細胞，0. 25%胰蛋白酶消化液消化，制成細胞懸液，接種至六孔板中，按5 X IO5個/孔，37°C，5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，使其貼壁，待細胞生長融合至80 % 90 %，備用。(2)取兩個1. 5ml離心管，分別標記為1號管和2號管，其中1號管按每孔250ul的Opti-MEM，再加入^g/孔的質(zhì)粒psiRNA-CAVl，2號管按每孔250ul的Opti-MEM，再加入IOul的lifpofectamine^OOO，靜置5min。將2管中的混合液加入1管中混合，靜置20min。(3)轉(zhuǎn)染孔的細胞換無血清培養(yǎng)基anl，將1、2混合液添加到六孔板的轉(zhuǎn)染孔中。37°C,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，轉(zhuǎn)染孔加入雙倍血清培養(yǎng)基anl。37°C,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)48h，加入kocin終濃度為100Ug/L的kocin篩選培養(yǎng)基進行篩選用Zeocin篩選培養(yǎng)基，細胞M小時一次換液，四天一次傳代，每次傳代收集細胞，直至傳至第七代時，Cav-I的低表達基本穩(wěn)定，第八代細胞擴大培養(yǎng)，并凍存細胞，將該細胞系命名為SMMC-7721KD。如圖2 細胞轉(zhuǎn)染后第3代，第5代，第6代，第7代，細胞中Cav-I表達下調(diào)的western blot結(jié)果圖；其中上圖為Cav-I和β -actin的western blot結(jié)果經(jīng)X光醫(yī)學(xué)膠片感光圖，C代表SMMC-7721對照，3、5、6、7代表SMMC-7721KD傳代的代數(shù)；下圖為對膠片進行計算機掃描定量分析，用掃描儀和凝膠成像系記錄相應(yīng)條帶的透射光積分吸光度值(IOD)，反映樣品的蛋白量。(β -Actin為內(nèi)參)。結(jié)果表明在轉(zhuǎn)染后第3代，細胞中Cav-I的表達開始略微下降，在傳至5代、6代時，Cav-I的表達明顯下降，并且在第7代時Cav-I的低表達趨于穩(wěn)定。實施例2細胞株的鑒定四.siRNA干擾效率檢測Western Blot檢測Cav-1的表達SMMC_7721KD每次傳代收集的細胞(第3代，5代，6代，7代)用RIPA裂解緩沖液提取細胞總蛋白，用Bradford法(BradfordM AnaL. Biochem,1976,72 :248 254)對蛋白進行定量后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的PBST溶液在室溫搖床上封閉lh。與相應(yīng)第一抗體結(jié)合(Cav-Ι—抗購自于cell signaling，商品貨號3238，
7β -actin 一抗購自于武漢博士德生物工程有限公司，商品貨號BM1453)，4°C孵育過夜；次日用PBST漂洗3次洗去一抗，再與對應(yīng)的辣根過氧化物酶標記的第二抗體(Cav-Ι抗兔，用辣根酶標記山羊抗兔IgG ； β -actin抗鼠，用辣根酶標記山羊抗鼠IgG)于室溫搖床中孵育池；PBST漂洗3次，PBS 1次，洗去二抗；ECL顯色后，在暗室中進行膠片感光；室溫顯影3min，定影aiiin，計算機掃描定量分析，用掃描儀和凝膠成像系記錄相應(yīng)條帶的透射光積分吸光度值，如圖3 為瞬時轉(zhuǎn)染Cav-IsiRNA質(zhì)粒，SMMC-7721細胞中Cav-I的表達下降的western blot結(jié)果圖；其中上圖為SMMC-7721對照細胞和SMMC-7721KD細胞經(jīng)westernblot，Cav-I和β-actin X光醫(yī)學(xué)膠片感光圖，下圖為對膠片進行計算機掃描定量分析，用掃描儀和凝膠成像系記錄相應(yīng)條帶的透射光積分吸光度值(IOD)，反映樣品的蛋白量。(β-Actin 為內(nèi)參)。結(jié)果表明建立Cav-I穩(wěn)定地表達的SMMC-7721細胞后，檢測細胞中Cav-I的表達。與對照人正常肝癌細胞SMMC7721細胞相比，SMMC-7721KD中psiRNA_CAVl的干擾效率為80%左右。五.SMMC-7721KD功能檢測——克隆形成率檢測放射之后細胞的增殖能力平板克隆形成實驗指數(shù)生長期的SMMC-7721細胞和SMMC-7721KD細胞，用0. 25%胰蛋白酶消化液消化、制成細胞懸液、臺盼藍染色計數(shù)后梯度稀釋至所需濃度，以200個/皿的密度接種細胞于直徑6cm培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后照射。使照射后每孔的克隆形成數(shù)在50到200個之間。細胞輻射處理X射線能量為8MeV，劑量率為3Gy/min。源皮距為100cm (即SSD =100cm)。照射野隨所選用的細胞培養(yǎng)板大小而調(diào)整。每個劑量點設(shè)3個重復(fù)樣品。細胞貼壁后按067、167、267、367、467、667，7個劑量給予照射，然后置于371、5(%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 14天。培養(yǎng)7天以后每日進行觀察，待發(fā)現(xiàn)有較大細胞克隆集落時，將培養(yǎng)皿取出，倒掉培養(yǎng)液，加入PBS液輕洗細胞后再棄去。用甲醇固定細胞5min，加0.4%結(jié)晶紫染液染色10-15min，棄去染液，用雙蒸水輕輕沖洗培養(yǎng)皿3次，自然風(fēng)干，如圖4 為X射線照射之后SMMC-7721細胞和SMMC-7721KD兩種細胞的平板克隆實驗克隆集落數(shù)目圖；其中0Gy，2Gy，4Gy，6Gy代表X射線不同輻射劑量的克隆集落，Gy為放射劑量單位。顯微鏡下計數(shù)含50個細胞以上的克隆數(shù)。按以下公式計算各劑量的存活分數(shù)，并繪制細胞存活曲線，如圖5，即X射線照射之后SMMC-7721細胞和SMMC-7721KD兩種細胞的平板克隆實驗統(tǒng)計的細胞存活曲線圖；其中縱坐標表示細胞存活率，橫坐標表示X射線放射劑量Gy。存活曲線最具特征的部位在2Gy，直接反映放射敏感性。對兩種細胞在2Gy照射劑量時的存活分數(shù)SF2進行統(tǒng)計學(xué)分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(配對t檢驗，P < 0. 05)。結(jié)果表明隨著照射劑量的增加，兩種細胞的存活率都逐漸下降，其中SMMC-7721KD細胞的存活率下降的較SMMC-7721細胞更為明顯。這提示我們Cav-I的低表
達能夠增強細胞的放射敏感性。
細胞存活分數(shù)=胃齊翻勺鋪誦
-X 100%
某劑量下種植的細胞數(shù)X OGy組集落形成率結(jié)果表明經(jīng)過X射線照射之后兩種細胞的克隆形成率隨著照射劑量的增加逐漸下降，并且SMMC-7721KD細胞的克隆形成率明顯低于正常的SMMC-7721細胞。依據(jù)本發(fā)明所述方法構(gòu)建的Cav-I穩(wěn)定低表達的SMMC-7721細胞系SMMC-7721KD，經(jīng)過psiRNA-CAVl干擾人正常的肝癌細胞SMMC-7721，Western Blot檢測其對SMMC-7721細胞中Cav-I的干擾效率可達80%左右；經(jīng)過X射線照射之后，細胞的克隆形成率降低，凋亡細胞數(shù)增加。這提示我們Cav-I基因沉默可以抑制人肝癌細胞SMMC-7721細胞的生長。經(jīng)文獻檢索，這是第一個Cav-I基因沉默的人肝癌SMMC-7721細胞，其用途如下研究Cav-I在人類肝癌細胞發(fā)生和發(fā)展過程中的影響和其作用機制可以以正常的SMMC-7721細胞為對照，以SMMC-7721KD細胞為實驗組，探討Cav-I在肝癌細胞生長，增殖及分化過程中的作用和相關(guān)機理。研究Cav-I在肝癌細胞放射后，對肝癌細胞DNA損傷饑細胞周期和增殖能力的影響作用機制研究人肝癌的發(fā)病機理和治療探討Cav-I基因沉默導(dǎo)致肝癌細胞凋亡的信號通路；探討Cav-I在在肝癌細胞中的生物學(xué)功能，為臨床肝癌的治療尋找新的方法。
權(quán)利要求
1.Cav-I穩(wěn)定低表達的SMMC-7721細胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟(a)設(shè)計對應(yīng)Cav-I基因的shRNA的兩條單鏈DNA模板，其堿基序列為SEQID NO 1和SEQ ID NO 2 ；(b)構(gòu)建含有上述堿基序列SEQID NO 1和SEQ ID NO 2的psiRNA-hHlzeo G2重組質(zhì)粒；(c)利用如步驟(b)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細胞SMMC-7721得到的重組細胞株；(d)將步驟(c)所得重組細胞株經(jīng)過kocin篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞M小時一次換液，四天傳代1次，傳至第七代時，Cav-I穩(wěn)定低表達，第八代細胞擴大培養(yǎng)，并凍存細胞，獲得陽性克隆細胞系；其中，上述Wkocin篩選培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基加10%新生牛血清，再加 100ug/L Zeocin ；(e)將步驟(d)篩選所得的陽性克隆細胞株利用WesternBlotting方法和/或X射線照射聯(lián)合平板克隆形成實驗法檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(b)所述的構(gòu)建方法包括如下步驟(f)將轉(zhuǎn)錄模板核苷酸序列SEQID NO :1和SEQ ID NO :2在80°C退火2min，自然冷卻至35°C得到退火產(chǎn)物；(g)用T4DNA連接酶將步驟(f)所得產(chǎn)物與對質(zhì)粒psiRNA-hHlzeoG2進行Kds I酶切后的線性化載體在16°C連接，過夜；(h)將步驟(g)獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5a后，經(jīng)細胞培養(yǎng)、提取質(zhì)粒、測序鑒定結(jié)果如SEQ ID NO :3。
3.如權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法所獲得的Cav-I穩(wěn)定低表達的SMMC-7721細胞系。
全文摘要
本發(fā)明公開一種Cav-1低表達的SMMC-7721KD細胞系的構(gòu)建方法。具體采用Cav-1SiRNA干擾技術(shù)構(gòu)建Cav-1穩(wěn)定低表達的SMMC-7721KD細胞系。經(jīng)過設(shè)計引物、擴增目的片段，構(gòu)建Cav-1SiRNA重組質(zhì)粒，進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，然后對轉(zhuǎn)染后的細胞進行博萊霉素篩選，傳代，建立穩(wěn)定低表達的SMMC-7721KD細胞系，最終獲得陽性重組細胞系，能夠沉默SMMC-7721細胞中Cav-1的表達80％左右，并且Cav-1穩(wěn)定低表達。Cav-1穩(wěn)定低表達的SMMC-7721細胞系可作為模型，進行Cav-1參與的一些腫瘤細胞的研究，Cav-1與肝癌的相關(guān)性及其機理研究。
文檔編號C12N15/85GK102559755SQ201110455368
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者劉艷, 史丹, 王洋, 鄒偉 申請人:遼寧師范大學(xué)