專利名稱：一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子的固相合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子CTranscription Activator Like Effectors,TALE)的固相合成方法，特別涉及一種由短小重復(fù)TALE單體(TALE monomer)的 DNA序列組裝成長鏈TALE的大規(guī)模、低成本、高效率合成方法。
背景技術(shù)：
在后基因組時代，我們迫切需要高效的基因操縱、合成等新型的生物工程技術(shù)。比如，我們常常需要抑制或沉默一個基因的表達。傳統(tǒng)的基因敲除(Gene Knockout)技術(shù)依賴于細胞內(nèi)自然發(fā)生的同源重組，其效率非常低，通常為KTf^l5RNAi技術(shù)雖然簡單易行， 但是又很難獲得百分之百的抑制效果。除了抑制或沉默特定的基因，我們常常還需要針對特定基因，進行某幾個堿基，甚至某一段序列的修改。同樣只依賴于同源重組技術(shù)，很難獲得理想的效果。TALE (Transcription Activator Like Effectors)首先是植物病原菌黃單胞菌 (Xanthomonas)上發(fā)現(xiàn)的，特異性地結(jié)合到DNA，在該病原菌感染過程中對植物基因進行調(diào)控。簡單講，TALE是由4個或以上特異性識別DNA的串聯(lián)“蛋白模塊”和兩側(cè)的N-末端及C-末端序列組成，而每個“蛋白模塊”包含34個氨基酸，其中第12和13位氨基酸是靶向識別的關(guān)鍵位點，被稱作重復(fù)可變的雙氨基酸殘基O^peat variable diresidue，或者 RVDs)。TALE識別DNA的機制在于DNA靶點上的一個核苷酸被一個重復(fù)序列上的RVD識別。理論上，針對A、T、G、C任何一個堿基，都能找到與之特定結(jié)合的RVDs。因此，對任何一段DNA序列，我們可以方便的設(shè)計、合成出對應(yīng)蛋白模塊組成的TALE。需要指出的問題是，1)雖然針對A、T、G、C都可以設(shè)計出對應(yīng)的RVD，但是，它們之間的對應(yīng)關(guān)系還有待于進一步優(yōu)化；2)設(shè)計合成的TALE能否高效地靶向結(jié)合基因組上的預(yù)期位置，還決定于很多其它因素；3)蛋白模塊的組成也有進一步優(yōu)化的空間。雖然TALE還有很多問題有待于深入研究加以解決，但是這并不妨礙它的應(yīng)用。一個最大的應(yīng)用前景是TALEN。TALEN是一個融合蛋白，由某段識別特異性DNA序列的TALE 與能在DNA序列上產(chǎn)生雙鏈斷裂(double strand break, DSB)的內(nèi)切核酸酶(Nuclease) 融合而成。TALEN是異源二聚體分子(即兩單位的TALE-Nuclease共同作用)，能夠在兩個相隔較近的特異識別序列間切割DNA。TALEN產(chǎn)生的DSB能夠通過以下兩種途徑進行修復(fù)1)非同源末端連接(Non HomologousEnd Joining,NHEJ) :NHEJ是以自然修復(fù)機制，能被用來引入核苷酸缺失以便失活或敲除一個特異性的靶基因；幻同源重組(Homologous Recombination,HR) :DSB促進同源重組，在一個DNA模版存在下，能夠產(chǎn)生特異性DNA序列改變，也能夠?qū)NA模版整合到 DNA序列上。NHEJ途徑可以用于基因沉默，而HR可用于修改基因(Gene Editing)，或者基因敲入(GeneKnock-in)。無論是哪種途徑，TALEN產(chǎn)生的修復(fù)與單純依賴于同源重組相比， 基因發(fā)生重組的效率大大提高，這為我們從事基因組訂制化(genome customization)提供方便的技術(shù)手段，為開發(fā)出更簡易的新型基因組靶向修飾技術(shù)帶來了新希望。
TALE 另外一個大的應(yīng)用前景是 TALEA(transcription activator-like (TAL) effectoractivator)。TALEA是一個融合蛋白，將識別特異DNA序列的TALE與轉(zhuǎn)錄因子激活區(qū)域VP64(VP64 Activation Domain)融合，可構(gòu)建成識別啟動子上特異DNA序列的轉(zhuǎn)錄激活因子TALEA。該融合蛋白將結(jié)合基因啟動子附近的特異DNA序列，并通過VP64激活區(qū)域與Polymerase II結(jié)合，從而激活基因的轉(zhuǎn)錄，提高了內(nèi)源目標基因的表達。TALE技術(shù)已經(jīng)開始在生命科學(xué)領(lǐng)域嶄露頭角。2011年，法國和美國兩個小組合作，利用TALEN技術(shù)，在大鼠中敲除失活I(lǐng)gM功能，效率高達60 %。2011年，包括中國在內(nèi)的幾個小組，利用TALEN技術(shù)，在斑馬魚中，敲除失活hey2等基因，效率也達到了 30%以上。TALE是一組重復(fù)蛋白模塊組成。按照現(xiàn)有的合成制備方法，需要大量的酶切、鏈接以及產(chǎn)物純化等操作，不僅耗時長( 3周)，而且需要大量的勞動力，不適合于大規(guī)模應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是為了解決上述技術(shù)問題，提供一種新型TALE合成組裝的方法， 利用固相組裝合成方法便于清洗底物、純化產(chǎn)物的特性，在固相界面上完成TALE連接單元的循環(huán)連接組裝。流程可概括為首先將一段核酸適配序列(DNA linker)固定化到固相載體界面上，如果核酸適配序列帶有3’ -粘性末端，可以與帶5’ -粘性末端的TALE連接單元在DNA連接酶的作用下連接，隨后洗脫未連接的底物，再用限制性內(nèi)切酶將連接到固相載體上DNA剪切重新生成3’ -粘性末端，再連接新的TALE連接單元。如此反復(fù)上述步驟，可將TALE連接單元一步步組裝到期望長度，最后再用另一種限制性內(nèi)切酶將組裝好的 TALE序列從固相界面上剪切下來，通過電泳分離純化后，克隆到不同的表達載體(TALEN或者TALEA)上。整個組裝流程可參考圖示意圖5。在本發(fā)明中，術(shù)語“固定化”(immobilize)指的是核酸分子(包括但不限于DNA探針、RNA等)通過化學(xué)基團(如氨基-NH2)與固態(tài)物體上的化學(xué)基團(如羧基-C00H)通過化學(xué)反應(yīng)(如氨基與羧基脫去一分子水)形成共價鍵，從而將核酸分子與高分子塊體緊密連接在一起；或者指溶液中的核酸分子通過高親和分子(包括但不限于biotin與avidin 或str印tavidin)之間的相互作用與固態(tài)物體連接在一體；或者指溶液中的核酸分子與已經(jīng)固定化到高分子塊體上的探針分子通過堿基配對生成氫鍵緊密連接在一起。因此，“固定化”不同于物理的吸附或粘附，通常的洗滌方式可以將吸附或粘附在高分子塊體上的雜質(zhì)洗去，卻不能洗去“固定化”到高分子塊體上的核酸分子?！癟ALE”指的是由4個或以上特異性識別DNA的串聯(lián)“蛋白模塊”和兩側(cè)的N-末端及C-末端序列組成，而每個“蛋白模塊”包含34個氨基酸，其中第12和13位氨基酸是靶向識別的關(guān)鍵位點，被稱作重復(fù)可變的雙氨基酸殘基O^peat variable diresidue，或者 RVDs)。"TALE單體(TALE monomer) ”指的是上述特異性識別DNA的“蛋白模塊”。"TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列”指的是編碼 TALE 單體(TALE monomer) 的對應(yīng)DNA序列，將該DNA序列經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯等生物化學(xué)過程表達出來的蛋白質(zhì)即為TALE 單體(TALE monomer)。"TALE連接單元”指的是至少一個TALE單體(TALE monomer)的DNA序列，例如可以是2個TALE單體(TALE monomer)的DNA序列(即兩個TALE單體并列相連形成的蛋白單元所對應(yīng)的DNA序列，可稱為“二連子”)，3個TALE單體(TALE monomer)的DNA序列(三連子)，或4個TALE單體(TALE monomer)的DNA序列(四連子)，或是非整數(shù)個TALE單體 (TALE monomer)的DNA序列(若干個TALE連接單元經(jīng)過組裝連接等一系列步驟后能夠形成至少含有一個完整TALE單體的DNA序列；更為簡單可設(shè)計為如0. 5,1. 5,2. 5,3. 5、4. 5或 5. 5個TALE單體(TALE monomer)的DNA序列，它們經(jīng)過組裝連接后能夠形成至少含有一個完整TALE單體的DNA序列)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下。方案1 一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子CTranscription Activator Like Effectors, TALE)的固相合成方法，其特征在于包括以下步驟(1)將一段核酸適配序列(DNA Linker)固定化到固相界面上，用限制性內(nèi)切酶3a 剪切產(chǎn)生3’-粘性末端；(2)將步驟(1)的產(chǎn)物與經(jīng)限制性內(nèi)切酶fe處理過的具有5’ -粘性末端的TALE 連接單元接觸，在DNA連接酶的作用下連接，洗脫未連接底物，上述5’-粘性末端具有與DNA Linker上3’ -粘性末端互補配對的核苷酸序列；(3)用限制性內(nèi)切酶北處理上一步驟所得產(chǎn)物，在DNA上剪切重新生成一個 3’_粘性末端，再與經(jīng)限制性內(nèi)切酶恥處理過的具有5’-粘性末端的TALE連接單元接觸， 在DNA連接酶的作用下連接，洗脫未連接產(chǎn)物；上述5’ -粘性末端具有與上述3’ -粘性末端互補配對的核苷酸序列；(4)重復(fù)步驟(3)至少一次；(5)用限制性內(nèi)切酶將連接好的DNA分子從固相界面上剪切下來，分離純化，除去未連接產(chǎn)物；(6)將步驟(5)所得DNA分子連接到一定表達載體上，表達成蛋白分子，即為含目標TALE的融合蛋白(如TALEN，或者TALEA)。利用上述技術(shù)方案可以方便地對每一步的連接產(chǎn)物進行純化，由于目標產(chǎn)物通過DNALinker固定化到固相界面上，因此通過簡單的固液分離手段，如磁力、離心、過濾等， 將固相界面與液體體系分離開，再對固相界面進行沖洗便可以除去絕大部分的非目標產(chǎn)物 (包括錯誤連接產(chǎn)物、未反應(yīng)的反應(yīng)物等)。此外，每一個TALE連接單元的5’-粘性末端的核苷酸序列都能與固定化到固相界面上的DNA分子的3’ -粘性末端的核苷酸序列互補配對，這保證了連接的準確度。上述兩個優(yōu)點保證了采用本發(fā)明的方法可以簡便而高效地大規(guī)模合成TALE。優(yōu)選地，步驟(4)中重復(fù)步驟03)2-20次使得TALE具備合適的長度，適應(yīng)特定場合的應(yīng)用。優(yōu)選地，TALE連接單元為0. 5個TALE單體(TALE monomer)的DNA序列、1個TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、1. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、2 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、2. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、3 個 TALE 單體(TALL· monomer)的 DNA 序列、3. 5 個 TALE 單體(TALL· monomer)的 DNA 序列、4 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、4. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、5. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列或 6 個TALE單體(TALE monomer)的DNA序列。具體的選擇可以根據(jù)合成過程中的需要(如合成更簡便、更快捷等)具體確定。優(yōu)選地，，剪切DNA分子產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶可以為II型限制性內(nèi)切酶， 為防止剪切出粘性末端的時候?qū)⒅斑B接好的DNA鏈切斷，每一次使用的酶都必須與之前用過的不同，因此，需設(shè)定限制性內(nèi)切酶3a、3b、……均不相同，限制性內(nèi)切酶fe、5b、…… 也均不相同。優(yōu)選地，剪切DNA分子產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶為同尾酶，采用同尾酶的好處是，DNA連接之后，識別位點不復(fù)存在，因此剪切產(chǎn)生3’-粘性末端的酶可以相同，剪切產(chǎn)生5’-粘性末端的酶也可以相同，操作更加簡便，也更加便宜。因而設(shè)定限制性內(nèi)切酶3a、 3b、……均相同，限制性內(nèi)切酶5aJb、……也均相同。優(yōu)選地，所述剪切產(chǎn)生3’ -粘性末端的限制性內(nèi)切酶為Nhel，剪切產(chǎn)生5’ -粘性末端的限制性內(nèi)切酶為SpeI ；或者剪切產(chǎn)生3’ -粘性末端的限制性內(nèi)切酶為Nhel，剪切產(chǎn)生5’ -粘性末端的限制性內(nèi)切酶為xbal ；或者剪切產(chǎn)生3’ -粘性末端的限制性內(nèi)切酶為 Spel，剪切產(chǎn)生5’ -粘性末端的限制性內(nèi)切酶為xbal ；或者剪切產(chǎn)生3’ -粘性末端的限制性內(nèi)切酶為Sail，剪切產(chǎn)生5’ -粘性末端的限制性內(nèi)切酶為xhol。優(yōu)選地，剪切DNA分子產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶為剪切位點不在限制性內(nèi)切酶DNA識別位點上的限制性內(nèi)切酶，這樣經(jīng)一次剪切后，限制性內(nèi)切酶識別位點不存在固相的DNA分子上，從而再次無法剪切固相的DNA分子上。因此剪切產(chǎn)生3'-粘性末端的酶可以相同，剪切產(chǎn)生5'-粘性末端的酶也可以相同，因而設(shè)定限制性內(nèi)切酶3a、
3b.......均相同，限制性內(nèi)切酶5ajb.......也均相同。但是剪切產(chǎn)生3'-粘性末端
的酶和剪切產(chǎn)生5'-粘性末端的酶不相同。優(yōu)選地，所述剪切產(chǎn)生3’ -粘性末端的限制性內(nèi)切酶為Bsal，剪切產(chǎn)生5’ -粘性末端的限制性內(nèi)切酶為ESP3I ；或者剪切產(chǎn)生3’ -粘性末端的限制性內(nèi)切酶為m^sl，剪切產(chǎn)生5’ -粘性末端的限制性內(nèi)切酶為m^vi。優(yōu)選地，步驟(1)中所述將一段核酸適配序列(DNA Linker)固定化到固相界面上按如下步驟操作在DNA Linker —端修飾生物素biotin，在固相界面上修飾鏈霉親和素 str印tavidin，將上述修飾了 biotin的DNA Linker與修飾了鏈霉親和素str印tavidin的固相界面接觸。固定化的方法并不限于上述例子，任何化學(xué)、生物的方法都可以使用，前提是可以在DNA Linker與固相界面之間形成緊密的結(jié)合，以常規(guī)的沖洗方法沖洗不掉為準。優(yōu)選地，所述固相界面包括磁性材料、硅、二氧化硅、陶瓷、高分子材料、石英或者玻璃。為了方便合成，本發(fā)明實施例中使用磁珠，但是任何形式的固體材料，只要可以固定化DNA Linker的，都可以使用。優(yōu)選地，步驟( 和(3)中所述洗脫未連接產(chǎn)物按如下步驟操作a.固液分離； b.將分離得到的固相沖洗至少一次。固液分離包括磁力分離、離心分離、過濾等常規(guī)手段， 沖洗可以用蒸餾水。優(yōu)選地，所述DNA Linker為一段與TALE單體的DNA序列完全不相同的序列，或者所述DNA Linker為TALE單體的DNA序列的一部分或全部。當(dāng)DNA Linker為TALE單體的 DNA序列的一部分或全部時，可以將DNA Linker連同TALE長鏈DNA分子一起從固相界面上剪切下來，作為合成TALE的DNA模板。
優(yōu)選地，所述DNA Linker具有20-500個核苷酸，優(yōu)選具有30-200個核苷酸，進一步優(yōu)選具有50-80個核苷酸。優(yōu)選地，所述DNA連接酶為T4DNA連接酶或Tag DNA連接酶。3，-粘性末端和5，-粘性末端也可以通過兩條互補的DNA單鏈退火成為DNA雙鏈而形成，或者分別由兩條互補的DNA單鏈退火成為DNA雙鏈而形成以及由限制性內(nèi)切酶剪切形成。所以也可以采用下面的方案2:一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(Transcription Activator Like Effectors,TALE) 的固相合成方法，其特征在于包括以下步驟(1)將一段核酸適配序列(DNA Linker)固定化到固相界面上，所述DNA Linker具有3’-粘性末端；(2)將步驟⑴的產(chǎn)物與具有5’ -粘性末端和3’ -粘性末端的TALE連接單元接觸，在DNA連接酶的作用下連接，洗脫未連接產(chǎn)物，上述5，-粘性末端具有與DNA Li nker 上3’ -粘性末端互補配對的核苷酸序列；(3)將步驟⑵的產(chǎn)物與具有5’ -粘性末端和3’ -粘性末端的TALE連接單元接觸，在DNA連接酶的作用下連接，洗脫未連接產(chǎn)物；上述5’-粘性末端具有與步驟( 所得產(chǎn)物的3’ -粘性末端互補配對的核苷酸序列；(4)重復(fù)步驟(3)至少一次；(5)用限制性內(nèi)切酶將連接好的DNA分子從固相界面上剪切下來，分離純化，除去未連接產(chǎn)物；(6)將步驟(5)所得DNA分子連接到一定表達載體上，表達成蛋白分子，即為含目標TALE的融合蛋白(如TALEN，或者TALEA)。上述3’ -粘性末端和5’ -粘性末端均通過兩條互補的DNA單鏈退火成為DNA雙鏈而形成，或者均通過限制性內(nèi)切酶剪切DNA雙鏈而形成，或者3 ’ -粘性末端通過兩條互補的DNA單鏈退火成為DNA雙鏈而形成、5，-粘性末端通過限制性內(nèi)切酶剪切DNA雙鏈而形成，或者5’-粘性末端通過兩條互補的DNA單鏈退火成為DNA雙鏈而形成、3’-粘性末端通過限制性內(nèi)切酶剪切DNA雙鏈而形成。DNA Linker上的3’-粘性末端可以在固定化到固相界面上之前形成，也可以在固定化到固相界面上之后形成。其他的3’ -粘性末端可以在同一 DNA分子上的5’ -粘性末端形成的同時形成或者之后形成。優(yōu)選地，步驟(4)中重復(fù)步驟(3) 2-20次。優(yōu)選地，TALE連接單元為0. 5個TALE單體(TALE monomer)的DNA序列、1個TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、1. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、2 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、2. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、3 個 TALE 單體(TALL· monomer)的 DNA 序列、3· 5 個 TALE 單體(TALL· monomer)的 DNA 序列、4 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、4. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、5. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列或 6 個 TALE單體(TALE monomer)的DNA序列。具體的選擇可以根據(jù)合成過程中的需要(如合成更簡便、更快捷等)具體確定。優(yōu)選地，步驟(1)中所述將一段DNA銜接物(DNA Linker)固定化到固相界面上按如下步驟操作在DNA Linker 一端修飾生物素biotin，在固相界面上修飾鏈霉親和素 str印tavidin，將上述修飾了 biotin的DNA Linker與修飾了鏈霉親和素str印tavidin的固相界面接觸。固定化的方法并不限于上述例子，任何化學(xué)、生物的方法都可以使用，前提是可以在DNA Linker與固相界面之間形成緊密的結(jié)合，以常規(guī)的沖洗方法沖洗不掉為準。優(yōu)選地，所述固相界面包括磁性材料、硅、二氧化硅、陶瓷、高分子材料、石英或者玻璃。為了方便合成，本發(fā)明實施例中使用磁珠，但是任何形式的固體材料，只要可以固定化DNA Linker的，都可以使用。優(yōu)選地，步驟( 和(3)中所述洗脫未連接產(chǎn)物按如下步驟操作a.固液分離； b.將分離得到的固相沖洗至少一次。固液分離包括磁力分離、離心分離、過濾等常規(guī)手段， 沖洗可以用蒸餾水。優(yōu)選地，所述DNA Linker為一段與TALE單體的DNA序列完全不相同的序列，或者所述DNA Linker為TALE單體的DNA序列的一部分或全部。當(dāng)DNA Linker為TALE單體的 DNA序列的一部分或全部時，可以將DNA Linker連同TALE長鏈DNA分子一起從固相界面上剪切下來，作為合成TALE的DNA模板。優(yōu)選地，所述DNA Linker具有20-500個核苷酸，優(yōu)選具有30-200個核苷酸，進一步優(yōu)選具有50-80個核苷酸。優(yōu)選地，所述DNA連接酶為T4DNA連接酶或Tag DNA連接酶。上述方法還可以擴展到任意長鏈核酸分子的合成，只需將上述方法中的TALE連接單元替換為任意的DNA序列，并省略步驟(6)，便可以采用上述固相合成方法由短鏈核酸分子合成任意的長鏈核酸分子。


圖ITALE結(jié)構(gòu)示意圖。TALE的核酸識別單位為重復(fù)34個恒定氨基酸序列，其中的 12、13位點雙連氨基酸與A、G、C、T有恒定的對應(yīng)關(guān)系，即NG識別T，HD識別C，NI識別A， NN識別G。圖2TALEN結(jié)構(gòu)以及其工作原理示意圖。將識別特異DNA序列的TALE與內(nèi)切核酸酶i^okl偶聯(lián)，可構(gòu)建成剪切特異DNA序列的內(nèi)切酶TALEN。而且R)kl需形成2聚體方能發(fā)揮活性，大大減少了隨意剪切的幾率。在實際操作中，需在目標基因的編碼區(qū)或外顯子和內(nèi)顯子的交界處選擇兩處相鄰(間隔13-22堿基)的靶序列(一般12-20個堿基)分別進行TAL識別模塊構(gòu)建。將這兩個相鄰靶點識別模塊(分別)融合克隆到R)kl的N-末端， 形成真核表達載體，得到TALEN質(zhì)粒對。圖3TALEN剪切后介導(dǎo)的同源重組示意圖。當(dāng)通過TALEN產(chǎn)生DSB后，若能提供同源修復(fù)模板，細胞可通過同源重組方式修復(fù)DNA，因此可以對內(nèi)源DNA做更精細的操作，如點突變(磷酸化位點)、保守區(qū)域替換、N端或C端加標記(GFP、HA、Flag)等等。圖4TALEA結(jié)構(gòu)以及工作原理示意圖。將識別特異DNA序列的TALE與轉(zhuǎn)錄因子激活區(qū)域VP64(VP64 Activation Domain)融合，可構(gòu)建成識別啟動子上特異DNA序列的轉(zhuǎn)錄激活因子TALEA.在實際操作中，需在目標基因的啟動子上游選取靶序列(一般12-18個堿基)，構(gòu)建TAL識別模塊。將識別模塊TALE融合克隆到VP64的N-末端，形成真核表達質(zhì)粒 TALEA。將TALEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞中，表達的融合蛋白結(jié)合啟動子附近的特異DNA序列，并通過VP64激活區(qū)域與Pol II結(jié)合，從而激活基因的轉(zhuǎn)錄，提高了內(nèi)源目標基因的表達。圖5組裝流程示意圖。a)固定化在固相表面的DNA linker的3’ -粘性末端由限制性內(nèi)切酶剪切產(chǎn)生，TALE連接單元的5’ -粘性末端由限制性內(nèi)切酶剪切產(chǎn)生；b)固定化在固相表面的DNA linker的3’ -粘性末端由限制性內(nèi)切酶剪切產(chǎn)生，TALE連接單元的5’-粘性末端是通過兩條互補的DNA單鏈退火成為DNA雙鏈時形成；c)固定化在固相表面的DNA linker的3，-粘性末端、TALE連接單元的3，-粘性末端和5，-粘性末端均是通過兩條互補的DNA單鏈退火成為DNA雙鏈時形成；d)固定化在固相表面的DNA linker 的3’ -粘性末端、TALE連接單元的5’ -粘性末端均是通過兩條互補的DNA單鏈退火成為 DNA雙鏈時形成，在完成每一步連接后，對固定化在固相表面的連接產(chǎn)物進行一步酶切產(chǎn)生 3’ -粘性末端，保證下一步組裝的順利進行。圖6由1個TALE單體(TALE monomer)的DNA序列(1連子)組裝為的五個TALE 單體(TALEmonomer)的DNA序列(5連子)。1)在DNA固定化前，將5’ -端修飾biotin的 DNA linker與KdsI酶切后的第一個連接單元混合，在溶液中連接；幻用KdvI酶切固定在磁珠上的連接單元，產(chǎn)生3’-端粘性末端，清洗三次；幻第二個TALE連接單元在加入前，先經(jīng)過rn^sl酶切產(chǎn)生5’-端粘性末端、純化等處理，然后在T4 DNA連接酶的作用下連接到磁珠上。4)重復(fù)步驟2-3 3次即可得到5連子。組裝產(chǎn)物在圖中左道所示。圖7由1個TALE單體(TALE monomer)的DNA序列(1連子)組裝為的10個TALE 單體(TALEmonomer)的DNA序列(10連子)。組裝產(chǎn)物在圖中左道所示。圖8由TALE四連子連接單元組裝為TALE 16連子。在TALE四連子的基礎(chǔ)上， 可在磁珠上進行4步的組裝，最后組裝成TALE 16連子。第一步，生物素修飾的雙鏈DNA linker (Biotinylatedds-DNA linker)帶有SpeI酶切位點，因此經(jīng)過酶切后會產(chǎn)生粘性末端，純化后與磁珠孵育將固定到磁珠表面。第二步，純化擴增TALE 4連子。第三步，利用 SpeI酶切TALE 4連子。第四步，將SpeI酶切好第一個4連子加入帶有DNA連接子的磁珠溶液上，連接后清洗3次。第五步，利用NheI酶切連接完第一個4連子的磁珠溶液，清洗3 次，加入SpeI酶切好第二個4連子，重復(fù)上述步驟。第六步和第七步，分別加入第三個和第四個4連子，重復(fù)步驟5的操作，然后跑膠回收1. 6k大小的片段，可得到TALE 16連子。
具體實施例方式以下將通過具體的實施例說明本發(fā)明，但是這些具體的實施例不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制，對某些細節(jié)進行修改將仍然落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。材料和方法利用PCR反應(yīng)，擴增第一個要組裝的TALE連接單元，其中PCR上游引物5端帶有 biotin修飾。然后將PCR產(chǎn)物與磁珠孵育固定，再經(jīng)過m^vl酶切處理，清洗3次去除酶等雜質(zhì)。在開始第二步組裝前，先將要組裝的TALE連接單元經(jīng)過PCR擴增，然后利用rn^sl酶切處理后，純化回收。將純化好的第二個TALE連接單元加入已組裝第一個TALE單元的磁珠，在T4 DNA連接酶的作用下，完成第二步組裝。重復(fù)上述酶切、純化、連接等步驟，直到獲得預(yù)定長度的TALE。組裝完畢后，利用酶切釋放磁珠上的DNA片段，酶切產(chǎn)物跑Agarose膠進行回收，連接到特定的表達質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化涂板挑菌測序。從實施例1-3的結(jié)果(實驗結(jié)果見圖6-8及

)可以看出固相組裝的效率還是非常高，至少在10步后，仍能得到30%的連接產(chǎn)物。實施例1.由1個TALE單元(1連子)組裝為的TALE 5連子單元DNA linker序列、5個TALE連接單元序列、5連子要結(jié)合的DNA序列以及最后組裝完成的TALE 5連子單元序列見附表1。首先，在DNA固定化前，將5端修飾biotin的DNA linker與KdsI酶切后的第一個連接單元混合，在溶液中連接；其次，用rn^vi酶切處理固定在磁珠上的連接單元后，清洗磁珠3次；再者，第二個TALE連接單元在加入前，將其用m^sl酶切處理、純化，在T4 DNA連接酶的作用下連接到磁珠上；重復(fù)上述酶切、純化、連接等步驟3次，即可得到5連子。實施例2由1個TALE單元(1連子)組裝為的TALE 10連子單元DNA linker序列、5個TALE連接單元序列、5連子要結(jié)合的DNA序列以及最后組裝完成的TALE 5連子單元序列見附表2。首先，在DNA固定化前，將5端修飾biotin的DNA linker與KdsI酶切后的第一個連接單元混合，在溶液中連接；其次，用rn^vi酶切處理固定在磁珠上的連接單元后，清洗磁珠3次；再者，在加入第二個TALE連接單元前，將其用m^sl酶切處理、純化，在T4 DNA連接酶的作用下連接到磁珠上；重復(fù)上述酶切、純化、連接等步驟8次，即可得到10連子。實施例3由4個TALE四連子連接單元組裝為TALE 16連子DNA linker、16連子要結(jié)合的DNA序列以及各個TALE連接單元的序列見附表3。在TALE四連子的基礎(chǔ)上，可在磁珠上進行4步的組裝，最后組裝成16 TALE連子。第一步，生物素修飾的雙鏈DNA linker (Biotinylated ds-DNA linker)帶有SpeI酶切位點，因此經(jīng)過酶切后會產(chǎn)生粘性末端，純化后與磁珠孵育將固定到磁珠表面。第二步，純化擴增TALE4連子。第三步，利用SpeI酶切TALE 4連子。第四步，將酶切好第一個4連子加入帶有DNA連接子的磁珠溶液上，連接15分鐘-1個小時，清洗3次。第五步，利用NheI酶切連接完第一個4連子的磁珠溶液，清洗3次，加入SpeI酶切好第二個4連子，重復(fù)上述步驟。第六步和第七步，分別加入第三個和第四個4連子，重復(fù)步驟5的操作，然后跑膠回收1. 大小的片段，可得到TALE 16連子。附表表權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(Transcription Activator Like Effectors,TALE)的固相合成方法，其特征在于包括以下步驟(1)將一段核酸適配序列(DNALinker)固定化到固相界面上，用限制性內(nèi)切酶3a剪切產(chǎn)生3'-粘性末端；(2)將步驟(1)的產(chǎn)物與經(jīng)限制性內(nèi)切酶fe處理過的具有5'-粘性末端的TALE連接單元接觸，在DNA連接酶的作用下連接，洗脫未連接底物，上述5 ‘-粘性末端具有與DNA Linker上3'-粘性末端互補配對的核苷酸序列；(3)用限制性內(nèi)切酶北處理上一步驟所得產(chǎn)物，在DNA上剪切重新生成一個3'-粘性末端，再與經(jīng)限制性內(nèi)切酶恥處理過的具有5 ‘-粘性末端的TALE連接單元接觸，在DNA 連接酶的作用下連接，洗脫未連接底物；上述5'-粘性末端具有與上述3'-粘性末端互補配對的核苷酸序列；(4)重復(fù)步驟(3)至少一次；(5)用限制性內(nèi)切酶將連接好的DNA分子從固相界面上剪切下來，分離純化，除去未連接產(chǎn)物；(6)將步驟( 所得DNA分子連接到一定表達載體上，表達成蛋白分子，即為含目標 TALE的融合蛋白(如TALEN，或者TALEA)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟中重復(fù)步驟(3)2-20次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述TALE連接單元為整數(shù)或非整數(shù)個 TALE單體(TALE monomer)的DNA序列，若干個TALE連接單元經(jīng)過組裝連接等一系列步驟后能夠形成至少含有一個完整TALE單體的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其特征在于所述TALE連接單元為0.5個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、1 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、1. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、2 個 TALE 單體(TALEmonomer)的 DNA 序列、2. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、3 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、3. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、4 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、4. 5 個 TALE 單體(TALEmonomer)的 DNA 序列、5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、5. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列或 6 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的任一項所述的方法，其特征在于剪切DNA分子產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶為II型限制性內(nèi)切酶，且限制性內(nèi)切酶3a、3b、……均不相同，限制性內(nèi)切酶 5a、5b、......也均不相同。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的任一項所述的方法，其特征在于剪切DNA分子產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶為同尾酶，且限制性內(nèi)切酶3a、3b、……均相同，限制性內(nèi)切酶5aJb、…… 也均相同。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項所述的方法，其特征在于剪切DNA分子產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶為剪切位點不在限制性內(nèi)切酶DNA識別位點上的限制性內(nèi)切酶，且限制性內(nèi)切酶3a、3b、……均相同，限制性內(nèi)切酶5aJb、……也均相同。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述剪切產(chǎn)生3'-粘性末端的限制性內(nèi)切酶為Nhel，剪切產(chǎn)生5'-粘性末端的限制性內(nèi)切酶為SpeI ；或者剪切產(chǎn)生3'-粘性末端的限制性內(nèi)切酶為Nhel，剪切產(chǎn)生5'-粘性末端的限制性內(nèi)切酶為xbal ；或者剪切產(chǎn)生3'-粘性末端的限制性內(nèi)切酶為Spel，剪切產(chǎn)生5'-粘性末端的限制性內(nèi)切酶為xbal ；或者剪切產(chǎn)生3'-粘性末端的限制性內(nèi)切酶為Sail，剪切產(chǎn)生5'-粘性末端的限制性內(nèi)切酶為xhol ；或者剪切產(chǎn)生3'-粘性末端的限制性內(nèi)切酶為Bsal，剪切產(chǎn)生 5'-粘性末端的限制性內(nèi)切酶為ESP3I ；或者剪切產(chǎn)生3'-粘性末端的限制性內(nèi)切酶為 m^sl，剪切產(chǎn)生5'-粘性末端的限制性內(nèi)切酶為m^i。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的任一項所述的方法，其特征在于步驟⑴中所述將一段DNA銜接物(DNA Linker)固定化到固相界面上按如下步驟操作在DNA Linker —端修飾生物素 biotin，在固相界面上修飾鏈霉親和素str印tavidin，將上述修飾了 biotin的DNALinker 與修飾了鏈霉親和素str印tavidin的固相界面接觸；或者按如下步驟操作在DNA Linker 一端修飾氨基-NH2，在固相界面上修飾羧基-C00H，將上述修飾了氨基-NH2的DNA Linker 與修飾了羧基-COOH的固相界面接觸并反應(yīng)脫去一分子水。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9的任一項所述的方法，其特征在于所述固相界面包括磁性材料、 硅、二氧化硅、陶瓷、高分子材料、石英或者玻璃。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10的任一項所述的方法，其特征在于步驟(2)和(3)中所述洗脫未連接底物按如下步驟操作a.固液分離；b.將分離得到的固相沖洗至少一次。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11的任一項所述的方法，其特征在于所述DNALinker為一段與 TALE單體的DNA序列完全不相同的序列，或者所述DNA Linker為TALE單體的DNA序列的一部分或全部。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12的任一項所述的方法，其特征在于所述DNALinker具有20-500 個核苷酸，優(yōu)選具有30-200個核苷酸，進一步優(yōu)選具有50-80個核苷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13的任一項所述的方法，其特征在于所述DNA連接酶為T4DNA連接酶或Tag DNA連接酶。
15.一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(Transcription Activator Like Effectors, TALE) 的固相合成方法，其特征在于包括以下步驟(1)將一段核酸適配序列(DNALinker)固定化到固相界面上，所述DNA Linker具有 3'-粘性末端；(2)將步驟(1)的產(chǎn)物與具有5'-粘性末端和3'-粘性末端的TALE連接單元接觸，在DNA連接酶的作用下連接，洗脫未連接底物，上述5 ‘-粘性末端具有與DNALinker上 3'-粘性末端互補配對的核苷酸序列；(3)將上一步驟所得固相產(chǎn)物與具有5'-粘性末端和3'-粘性末端的TALE連接單元接觸，在DNA連接酶的作用下連接，洗脫未連接底物；上述5'-粘性末端具有與步驟(2) 所得產(chǎn)物的3'-粘性末端互補配對的核苷酸序列；(4)重復(fù)步驟(3)至少一次；(5)用限制性內(nèi)切酶將連接好的DNA分子從固相界面上剪切下來，分離純化，除去未連接產(chǎn)物；(6)將步驟( 所得DNA分子連接到一定表達載體上，表達成蛋白分子，即為含目標 TALE的融合蛋白(如TALEN，或者TALEA)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于所述3'-粘性末端和5'-粘性末端均通過兩條互補的DNA單鏈退火成為DNA雙鏈而形成，或者均通過限制性內(nèi)切酶剪切DNA雙鏈而形成，或者3'-粘性末端通過兩條互補的DNA單鏈退火成為DNA雙鏈而形成、5'-粘性末端通過限制性內(nèi)切酶剪切DNA雙鏈而形成，或者5 ‘-粘性末端通過兩條互補的DNA單鏈退火成為DNA雙鏈而形成、3'-粘性末端通過限制性內(nèi)切酶剪切DNA雙鏈而形成。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其特征在于DNALinker上的3'-粘性末端是在固定化到固相界面上之前形成的、其他的3'-粘性末端是在同一 DNA分子上的5'-粘性末端形成之后或者同時形成的。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17的任一項所述的方法，其特征在于步驟(4)中重復(fù)步驟 (3)2-20 次。
19.根據(jù)權(quán)利要求15-18的任一項所述的方法，其特征在于所述TALE連接單元為整數(shù)或非整數(shù)個TALE單體(TALE monomer)的DNA序列，若干個TALE連接單元經(jīng)過組裝連接等一系列步驟后能夠形成至少含有一個完整TALE單體的DNA序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求15-19的任一項所述的方法，其特征在于所述TALE連接單元為0.5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、1 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、1. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、2 個 TALE 單體(TALEmonomer)的 DNA 序列、2. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、3 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、3. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、4 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、4. 5 個 TALE 單體(TALEmonomer)的 DNA 序列、5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列、5. 5 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列或 6 個 TALE 單體(TALE monomer)的 DNA 序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求15-20的任一項所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述將一段 DNA銜接物(DNA Linker)固定化到固相界面上按如下步驟操作在DNA Linker—端修飾生物素biotin，在固相界面上修飾鏈霉親和素str印tavidin，將上述修飾了 biotin的 DNALinker與修飾了鏈霉親和素str印tavidin的固相界面接觸?；蛘甙慈缦虏襟E操作在 DNA Linker 一端修飾氨基-NH2，在固相界面上修飾羧基-C00H，將上述修飾了氨基-NH2的 DNA Linker與修飾了羧基-COOH的固相界面接觸并反應(yīng)脫去一分子水。
22.根據(jù)權(quán)利要求15-21的任一項所述的方法，其特征在于所述固相界面包括磁性材料、硅、二氧化硅、陶瓷、高分子材料、石英或者玻璃。
23.根據(jù)權(quán)利要求15-22的任一項所述的方法，其特征在于步驟( 和C3)中所述洗脫未連接產(chǎn)物按如下步驟操作a.固液分離；b.將分離得到的固相沖洗至少一次。
24.根據(jù)權(quán)利要求12-23的任一項所述的方法，其特征在于所述DNALinker為一段與 TALE單體的DNA序列完全不相同的序列，或者所述DNA Linker為TALE單體的DNA序列的一部分或全部。
25.根據(jù)權(quán)利要求15-24的任一項所述的方法，其特征在于所述DNALinker具有 20-500個核苷酸，優(yōu)選具有30-200個核苷酸，進一步優(yōu)選具有50-80個核苷酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求15-25的任一項所述的方法，其特征在于所述DNA連接酶為T4DNA 連接酶或iTag DNA連接酶。
27.一種核酸分子的固相合成方法，其特征在于將權(quán)利要求146任一項中的TALE連接單元替換為任意的DNA序列，并省略步驟(6)。
全文摘要
一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子的固相合成方法，包括以下步驟將一段核酸適配序列(DNAlinker)固定化到固相界面上，用限制性內(nèi)切酶剪切產(chǎn)生3′-粘性末端；將產(chǎn)物與經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理過的具有5′-粘性末端的TALE連接單元接觸，在DNA連接酶的作用下連接，洗脫未連接底物；用限制性內(nèi)切酶處理上一步驟所得產(chǎn)物，在DNA上剪切重新生成一個3′-粘性末端，再與經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理過的具有5′-粘性末端的TALE連接單元接觸，在DNA連接酶的作用下連接，洗脫未連接底物；重復(fù)操作上述步驟至少一次；用限制性內(nèi)切酶將連接好的DNA分子從固相界面上剪切下來，分離純化，除去未連接底物；將所得DNA分子表達成蛋白分子，即為含目標TALE的融合蛋白(如TALEN，或者TALEA)。
文檔編號C12N9/22GK102584955SQ20111045670
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者莊峰鋒 申請人:北京唯尚立德生物科技有限公司